JPS6318478B2

JPS6318478B2 -

Info

Publication number: JPS6318478B2
Application number: JP5427885A
Authority: JP
Inventors: Masanari Yamada; Kyosuke Yomoto
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1985-03-20
Filing date: 1985-03-20
Publication date: 1988-04-19
Also published as: JPS61216698A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は発酵法によるＬ−スレオニンの製法に
関する。Ｌ−スレオニンは必須アミノ酸の１つであり、
医薬品、飼料添加物として重要であり、その安価
な製造方法が望まれている。従来、プロビデンシア属（レトゲリ種に関して
は旧プロテウス属）の微生物を用いた発酵法によ
るＬ−スレオニンの製造方法としては、Ｌ−イソ
ロイシン要求性株を用いる方法（特公昭43−4440
号公報）や、α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草
酸に耐性を有し、かつＬ−イソロイシン要求性株
を用いる方法（日本農芸化学会講演要旨p.9
（1970））が知られている。本発明者らは、より有利な発酵法によるＬ−ス
レオニンの製造方法について鋭意研究した結果、
プロビデンシア属に属する微生物のメチオニン代
謝拮抗物質について耐性を有する変異株が著量の
Ｌ−スレオニンを生成蓄積せしめることを見出
し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、プロビデンシア
（Providencia）属に属し、Ｌ−スレオニン生産
能を有する微生物のメチオニン代謝拮抗物質に耐
性を有する微生物を培養して、培養液中にＬ−ス
レオニンを生成蓄積せしめ、該培養液からＬ−ス
レオニンを採取することを特徴とする発酵法によ
るＬ−スレオニンの製法である。プロビデンシア属に属する微生物のメチオニン
代謝拮抗物質に耐性を有する微生物の変異株は、
これまでに分離されたことがない。また、セラチ
ア属に属し、メチオニン代謝拮抗物質に耐性を有
する変異株を用いてＬ−スレオニンを製造するこ
とは公知である（特開昭56−134993号公報）が、
本発明のごとく、プロビデンシア属に属する微生
物のメチオニン代謝拮抗物質に耐性を有する変異
株がＬ−スレオニンを著量に生成蓄積せしめ得る
ことは、まつたく新規の事実である。次に本発明を詳細に説明する。本発明で用いられる微生物はプロビデンシア属
に属し（バージーのマニアル・オブ・デターミネ
イテイブ・バクテリオロジー、第９版、第494〜
496頁の記載に従うものである）、メチオニン代謝
拮抗物質に耐性を有する微生物である。ここで、
メチオニン代謝拮抗物質としては、例えばエチオ
ニン、ノルロイシン、クロトノイルアラニン、ク
ロトノイルグリシン、メチオニンスルフオキシム
等が挙げられる。かかる性質を有していれば、他
の要求性、他の薬剤抵抗性等の性質をもつもので
も本発明の範囲に含まれる。本発明で用いられる微生物は、上記耐性に加え
て、好ましくはＬ−イソロイシンに対する栄養要
求性を有し、かつスレオニン生合成系においてス
レオニンのフイードバツクコントロールに抵抗性
を有するものである。ここにいう栄養要求性とは、広義の意味であ
り、不完全欠失型（いわゆるleaky型）も含むも
のである。さらに、Ｌ−イソロイシンの生合成前
駆物質で要求性が満足される場合も含むものであ
る。本発明で用いられる変異株の代表的なものとし
ては、例えば以下のものがある。プロビデンシア・レトゲリ（Providencia
Rettgeri）TY−１（FERM BP−872）、プロビ
デンシア・レトゲリ（Providencia Rettgeri）
TY−２（FERM BP−872）。これらの変異株は、プロビデンシア・レトゲリ
ATCC 21118（Ｌ−イソロイシン要求性）から
得られたα−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐
性株プロビデンシア・レトゲリIN4−7H（α−ア
ミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−イソロ
イシン要求性）より誘導されたもので、メチオニ
ン代謝拮抗物質のうち、Ｌ−エチオニンに耐性を
有する変異株である。変異株の誘導は、通常の変異処理法によつて比
較的容易に取得できる。すなわち、メチオニン代
謝拮抗物質に耐性を有する変異株を得るには、親
株を紫外線照射するか、あるいは変異誘発剤（例
えばＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジン、エチルメタンスルホン酸等）で処理し
た後、親株が生育できないような量のメチオニン
代謝拮抗物質を含む固体培地で生育できるような
菌株を採取すればよい。さらに具体例を実施例１
に示す。本発明におけるメチオニン代謝拮抗物質耐性株
とは、メチオニン代謝拮抗物質濃度が４mg／mlと
なるように添加した培地で培養した時の24時間後
の生育度が無添加の場合の70％以上のものをい
う。ここで生育度は、培養液の660nmにおける吸
光度を測定し、各菌株のメチオニン代謝拮抗物質
を添加していない培養液の吸光度を100％として
表わした場合の相対吸光度で示した。耐性を検定
する場合のメチオニン代謝拮抗物質、例えばエチ
オニン、ノルロイシン等は、市販のものを用いる
ことができる。本発明において用いる菌株と、そ
の親株のＬ−エチオニンに対する耐性を検定した
結果を実施例１に示す。また、本発明においては、上記のようにして取
得されるメチオニン代謝拮抗物質耐性株にＬ−イ
ソロイシン要求性、α−アミノ−β−ハイドロキ
シ吉草酸耐性等のスレオニン生産性を向上せしめ
る特性を、通常の変異誘導操作によつて付与する
ことができるので、このような変異株を使用する
こともできる。本発明におけるＬ−スレオニン生産用の培地は
炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じて
その他の有機微量成分を含有する通常の培地であ
る。炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、でん粉およびセルロースの加水分解物、糖蜜
等の糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の
如き有機酸、グリセロールの如きアルコール類等
を２〜15％、窒素源として、酢酸アンモニウムの
如き有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩
化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アン
モニウムの如き無機アンモニウム塩、アンモニア
ガス、アンモニア水、尿素等を0.5〜4.0％、有機
微量栄養素としては、Ｌ−イソロイシン等の被要
求物質が0.001〜0.4％、または必要に応じてコー
ンステイープリカー、ペプトン、酵母エキス等０
〜４％をそれぞれ適当量含有する培地が好適に用
いられる。これらの他にリン酸カリウム、硫酸マ
グネシウム、硫酸第１鉄７水和物、硫酸マンガン
４−６水和物等が少量添加される。培養は、好気的条件が望ましい。培養の間、培
地のPHは５から９に、温度は24〜37℃に調節し、
48〜120時間振とうまたは通気培養すれば好まし
い結果が得られる。培養液よりＬ−スレオニンを採取するには、例
えば菌体を除去した培養液をPH２に塩酸で調製
したのち、強酸性カチオンイオン交換樹脂に通液
後、希アンモニア水で吸着成分を溶出し、脱アン
モニア後、濃縮する。これにアルコールを添加
し、冷却保存下で生成した結晶を集め、Ｌ−スレ
オニンを得ることができる。実施例１Ａ（Ｌ−エチオニン耐性変異株の取得）プロビデンシア・レトゲリIN4−7H（α−アミ
ノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−イソロイ
シン要求性）の菌体に、通常の方法で紫外線照射
し、この細胞をＬ−エチオニン10g／添加した
寒天平板培地（グルコース１％、硫安0.3％、リ
ン酸第１カリウム0.05％、リン酸第２カリウム
0.15％、硫酸マグネシウム７水和物0.04％、Ｌ−
イソロイシン0.01％を含む最少培地）に塗布し
た。次に30℃にて４〜６日間培養し、生じた大き
なコロニーを釣菌分離して、Ｌ−エチオニン耐性
株（プロビデンシア・レトゲリTY−１および
TY−２）を取得した。Ｂ（Ｌ−エチオニン耐性変異株の耐性度）下記第１表に示す各菌株を液体ブイヨン培地を
用いて30℃で16時間振とう培養し、生育した菌体
を集菌し生理食塩水で洗浄した。この菌体の懸濁
液を、Ｌ−エチオニン０，４，８，16g／の割
合で含む最少培地（培地組成：グルコース1.0％、
硫安0.3％、リン酸第１カリウム0.05％、リン酸
第２カリウム0.15％、硫酸マグネシウム７水和物
0.01％、Ｌ−イソロイシン0.01％）５mlに植菌し
て、30℃にて24時間培養し、各菌株の生育度を調
べた。その結果は、第１表に示すとおりであり、
本発明方法で使用するエチオニンに耐性な変異株
（プロビデンシア・レトゲリTY−１またはプロ
ビデンシア・レトゲリTY−２）では、親株のプ
ロビデンシア・レトゲリIN4−7Hと比較して、
高濃度のＬ−エチオニンによつて生育が阻害され
ず、強いエチオニン耐性を獲得していることを示
している。

【表】実施例２下記の組成の発酵用培地50mlを１容振とうフ
ラスコに入れ、120℃で10分間蒸気殺菌した。こ
れに、あらかじめグルコース２％、ポリペプトン
１％、酵母エキス１％、NaCl 0.5％を含む種培
養培地で30℃、16時間振とう培養した第２表に示
す各菌株の培養液５mlを移し、30℃にて150回
転／分、振幅３cmの条件下90時間培養した。発酵用培地組成グルコース８％（NH₄）₂SO₄ ２％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.04％ Fe⁺⁺ 2ppm Mn⁺⁺ 2ppm Ｌ−イソロイシン 0.005％ CaCO₃（別滅菌）３％ PH 7.0（KOHで中和）

【表】

【表】培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去した
液中のＬ−スレオニン濃度を、自動アミノ酸分
析計（日本電子JLC 200A）で定量したところ第
２表に示すような結果を得た。実施例３第３表に示す各菌株を、液体ブイヨン培地で、
30℃、16時間振とう培養し、これを実施例２の発
酵用培地のうち（NH₄）₂SO₄を0.5％、グルコー
スを4.0％とした培地800mlを分注したガラス製小
型ジヤーフアーメンターへ10％となるように接種
した。30℃にて、800rpm、通気量1vvmにて通気
撹拌培養を開始した。PH調節および窒素源の供給
は、25％アンモニア水にて行ない、PHは6.5〜8.0
に維持した。グルコース、KH₂PO₄および
MgSO₄・7H₂Oを適宜添加しながら、70時間培養
したところ第３表に示すような結果を得た。

【表】プロビデンシア・レトゲリTY−１の培養液よ
り菌体を除き、その500mlを強カチオン交換樹脂
ダイヤイオンSK・1B（Ｈ型）のカラムに通した。
カラムを水洗後、2Nアンモニア水でカラムの吸
着成分を溶出し、脱色後減圧濃縮した。これにエ
タノールを加え、冷却し、生成した結晶を集めて
乾燥した結果、純度96％以上のＬ−スレオニンの
結晶8.4gが得られた。

Claims

【特許請求の範囲】

１プロビデンシア（Providencia）属に属し、
メチオニン代謝拮抗物質について耐性を有し、か
つＬ−スレオニン生産能を有する微生物を培養し
て培養液中にＬ−スレオニンを生成蓄積せしめ、
該培養液よりＬ−スレオニンを採取することを特
徴とする発酵法によるＬ−スレオニンの製法。