JPS61216698A - 発酵法によるｌ−スレオニンの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発酵法によるＬ−スレオニンの製法に関する。

Ｌ−スレオニンは必須アミノ酸の１つであり、医薬品、
飼料添加物として重要であり、その安価な製造方法が望
まれている。

従来、プロテウス属の微生物を用いた発酵法によるＬ−
スレオニンの製造方法としては、Ｌ−イ　　　□ソロイ
シン要求性株を用いる方法（特公昭４３−４４４０号公
報）や、α−アミノ−β−ハイドロ　　　：キシ吉草酸
に耐性を有し、かつＬ−イソロイシン要求性株を用いる
方法（日本農芸化学会講演要旨９．９　（１９７０））
が知られている。

本発明者らは、より有利な発酵法によるＬ−スレオニン
の製造方法について鋭意研究した結果、プロテウス属に
属する微生物のメチオニン代謝拮抗物質につ′、１て耐
性を有する変異株が著量のＬ−スレオニンを生成蓄積せ
しめることを見出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉ−ｄ
ｅｎｃ＊ａ）属に属し、Ｌ−スレオニン生産能を有する
微生物のメチオニン代謝拮抗物質に耐性を有する微生物
を培養して、培養液中にＬ−スレオニンを生成蓄積せし
め、該培養液からＬ−スレオニンを採取することを特徴
とする発酵法によるＬ−スレオニンの製法である。

プロテウス属に属する微生物のメチオニン代謝拮抗物質
に耐性を有する微生物の変異株は、これまでに分離され
たことがない。また、セラチア−Ｇζ属し、メチオニン
代謝拮抗物質に耐性を有する変異株を用いてＬ−スレオ
ニンを製造することは公知である（特開昭５６−１３４
９９３号公報）が、本発明のごとく、プロビデンシア属
に属する微生物のメチオニン代謝拮抗物質に耐性を有す
る変異株がＬ−スレオニンを著量に生成蓄積せしめ得る
ことは、まったく新規の事実である。

次に本発明の詳細な説明する。

本発明で用いられる微生物はプロビデンシア属に属しく
パージ−のアニマル・オブ・デターミネイティブ・バク
テリオロジー、第９版、第４９４〜４９６頁の記載に従
うものである）、メチオニン代謝拮抗物質に耐性を有す
る微生物である。ここで、メチオニン代謝拮抗物質とし
ては、例えばエチオニン、ノルロイシン、クロトノイル
アラニン、クロトノイルグリシン、メチオニンスルフオ
キシム等が挙げられる。かかる性質を有していれば、他
の要求性、他の薬剤抵抗性等の性質をもつものでも本発
明の範囲に含まれる。

本発明で用いられる微生物は、上記耐性に加えて、好ま
しくはＬ−インロイシンに対する栄養要求性を有し、か
つスレオニン生合成系がスレオニンのフィードバックコ
ントロールに抵抗性を有す　　　　□るものである。

ここにいう栄養要求性とは、広義の意味であり、不完全
欠乏型（いわゆる１ｅａｋｙ型）も含むものである。さ
らに、Ｌ−インロイシンの生合成前駆物質で要求性が満
足される場合も含むものである。

本発明で用いられる変異株の代表的なものとしては、例
えば以下のものがある。

プロピｆ’　：／　シフ　＊　Ｌ／トゲ＋）　（Ｐｒｏ
ｖｉｄｅｎｃｉａ　Ｒｅｔｔｇｅｒｉ　）ＴＹ−１（Ｆ
ＥＲＭ　ｐ−８０７５’）、プロビデンシア・レトゲリ
　　　（Ｐｒｏｖｌｄｅｎｃｉａ　　Ｒｅｔｔｇｅｒｉ
　　）　　　ＴＹ−２（ＦＥＲＭ　　　ｐ−ｇｏｔｏ）
　　。

これらの変異株は、プロテウス・レトゲリＡＴＣＣ２１
１１８（Ｌ−イソロイシン要求性）から得られたα−ア
ミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性株プロテウス・レト
ゲリｌＮ４−７Ｈ（α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草
酸耐性、Ｌ−イソロイシン要求性）より誘導されたもの
で、メチオニン代謝拮抗物質のうち、Ｌ−エチオニンに
耐性な変異株である。

変異株の誘導は、通常の変異処理法によって比較的容易
に取得できる。すなわち、メチオニン代謝拮抗物質に耐
性を有する変異株を得るには、親株を紫外線照射するか
、あるいは変異誘発剤（例、ｔ　ハＮ−メチルーＮ′−
二トローＮ−ニトロソクアニジン「エチルメタンスルホ
ン酸等）で処理した後、親株が生育できないような量の
メチオニン代謝拮抗物質を含む固体培地で生育できるよ
うな菌株を採取すればよい。さらに具体例を実施例１に
示す。

本発明におけるメチオニン代謝拮抗物質耐性株とは、メ
チオニン代謝拮抗物質濃度が４岬／ｄとなるように添加
した培地で培養した時の２４時間後の生育度が無添加の
場合の７０％以上のものをいう。ここで生育度は、培養
液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、各菌株のメチ
オニン代謝拮抗物質を添加していない培養液の吸光度を
１００％として表わした場合の相対吸光度で示した。耐
性を検定する場合のメチオニン代謝拮抗物質、例えばエ
チオニン、ノルロイシン等は、市販のものを用いた。本
発明にお゛いて用いる菌株と、その親株のし一エチオニ
ンに対する耐性を検定した結果を実施例１に示す。

また、本発明においては、上記のようにして取得される
メチオニン代謝拮抗物質耐性株にＬ−イソロイシン要求
性、ａ−７２７−β−ハイドロキシ吉草酸耐性等のスレ
オニン生産性を向上せしめる特性を、通常の変異誘導操
作によって付与することができるので、仁のような変異
株を使用することもできる。

本発明におけるＬ−スレオニン生産用の培地は炭素源、
窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微
量成分を含有する通常の培地である。炭素源としては、
グルコース、フラクトース、でん粉、セルロースの加水
分解物、糖蜜等の糖類、フマール酸、クエン酸、コハク
酸等の如き有機酸、グリセロールの如きアルコール類等
を２〜１５％、窒素源として、酢酸アンモニウムの如き
有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウムの如キ無
機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水、尿
素等を０．５〜４０ｇ６、有機微量栄養素としては、Ｌ
−イソロイシン等の被要求物質が０、００１〜０．４５
６．または必要に応じてコーンステイープリカー、ペプ
トン、酵母エキス等０〜４優をそれぞれ適当量含有する
培地が好適に用いられる。ξれらの他にリン酸カリウム
、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄７水和物、硫酸マンガ
ン４−６水和物等が少量添加される。

培養は、好気的条件が望ましい。培養の間、培地のｐＨ
は５から９化、温度は２４〜３７℃に調節し、４８〜１
２０時間振とうまたは通気培養すれば好ましい結果が得
られる。

培養液よりＬ−スレオニンを採取するには、例えば菌体
を除去した培養Ｐ液をｐＨ２に塩酸で調製したのち、強
酸性カチオンイオン交換樹脂に通液後、希アンモニア水
で吸着成分を溶出し、脱アンモニア後、濃縮する。これ
にアルコールを添加し、冷却保存下で生成した結果を集
め、Ｌ−スレオニンを得ることができる。

実施例１ Ａ、（Ｌ−エチオニン耐性変異株の取得）プロテウス・
レトゲリｌＮ４−７Ｈ（α−アミノ−β−ハイドロキシ
吉草酸耐性、Ｌ−インロイシン要求性）の１体に、通常
の方法で紫外線照射し、この細胞をＬ−エチオニン１０
１／Ｉｔ添加した寒天平板培地（グルコース１５１、硫
安０．３％、リン酸第１カリウム０．０５％、リン酸第
２カリウム０．１５％、硫酸マグネシウム７水和物０．
０４５Ｍ、Ｌ−イソロイシン０．０１％を含む最少培地
）に塗布した。次に３０℃にて４〜６日間培養し、生じ
た大きなコロニーを釣菌分離して、Ｌ−エチオニン耐性
株（プロビデンシア・レトゲリＴＹ−１およびＴＹ−２
）を取得した。

Ｂ、（Ｌ−エチオニン耐性変異株の耐性度）下記第１表
に示す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて３０℃で１６
時間振とう培養し、生育した菌体を集菌し生理食塩水で
洗浄した。この菌体の懸濁液を、Ｌ−エチオニンＱｅ４
ｅ８ｔ１６ｙ／ｌの割合で含む最少培地（培地組成ニゲ
ルコース１０％、硫安α３％、リン酸第１カリウム０．
０５％、リン酸第２カリウム０．１５％、硫酸マグネシ
ウム７水和物０．０１％、Ｌ−イソロイシン０．０１％
）５−に植菌して、３０℃にて２４時間培養し、各菌株
の生育度を調べた。その結果は、第１表に示すとおりで
あり、本発明方法で使用するエチオニンに耐性な変異株
（プロビデンシア・レトゲリＴＹ−１またはプロビデン
シア・レトゲリＴＹ−２）では、親株のプロテウス・レ
トゲリｌＮ４−７Ｈと比較して、高濃度のし一エチオニ
ンによって生育が阻害されず、強いエチオニン耐性を獲
得していることを示している。

第　　１　　表 （注）培養液の６６０　ｎｍにおける吸光度を測定し、
各菌株のし一エチオニンを添加していない培養液の吸光
度を１００％として表わした。

実施例２ 下記の組成の発酵用培地５０　ｄを１１容振とうフラス
コに入れ、１２０℃で１０分間蒸気殺菌した。これ化、
あらかじめグルコース２％、？リペプトン１５Ｍ、酵母
エキス１％、ＮａＣ１Ｏ，５％を含む種培養培地で３０
℃、１６時間振とう培養した第２表に示す各菌株の培養
液５　ｍｌを移し、３０℃にて１５０回転／分、振幅３
ｃＩｌの条件下９０時間培養した。

発酵用培地組成 グルコース　　　　　　８　　　％ ＜ＮＨａ）ｚｓＯａ　　　　　　　２　　　　％ＫＨｔ
ＰＯ４０，１Ｎ Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ１００，０４５Ｍ Ｆｅ什　　　　　　　　　　　　２　　　　　　ｗａＭ
ｎ什　　　　　　　　　　　　　２　　　　−Ｌ−イソ
ロイシン　　　　　　ｏ、ｏｏｓ　％ＣａＣ０３（別滅
菌）　　　　　３　　　　％’ｐＨ７゜Ｑ（ＫＯＨで中
和） 第　　２　　表 培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去したＰ液中の
Ｌ−スレオニン濃度を、自動アミノ酸分析計（日本電子
ＪＬＣ２００Ａ）で定量したところ第２表に示すような
結果を得た。

特許出願人　東　し　株　式　会　社 手　　続　　補　　正　　書 昭和　　匁　　月　　日 特許庁長官　宇　賀　道ｇＩ％　　石 １、事件の表示 昭和６０年特許願第　　５４２７８号 ２、発明の名称 発酵法によるＬ−スレオニンの製法 工補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　　　所　東京都中央区日本橋室町２丁目２番地自　
　　　　　発 翫　補正により増加する発明の数　　　０６補正の対象 （１）　　明細書第２ページ第６行目 「従来、プロテウス属の」を「従来、プロビデ　　　　
□ンシア属（レトゲリ種に関しては旧プロテウス　　　
　Ｉ′属）の」と補正する。

Ｃ）同第２ぺり下から第６行目、第３ページ第　　　８
′６行目、第５゛ページ第２行目、第８ページ第１２　
　　　　’ｉ： 行目、第９ページ下から第３行目、第１０ペー　　　　
ンジ第１表中第４行目および第１１ページ艙２表中第３
行目 「プロテウス」を「プロビデンシア」と補正する。

（３）同第４ページ第１Ｏ行目 「生合成系が」を「生合成系において」と補正　　　□
する。

（４）　　同第４ページ下から第７行目「不完全欠乏型
」を「不完全欠失型」と補正する。

ζω　同第５ページ第８行目 「耐性な」を「耐性を有する」と補正する。

（６）　　同第６ページ第９〜１０行目「エチオニン・
・・・・用いた。Ｊを 「エチオニンは、市販のものを用いることができる。ｌ
ｊと補正する。

（ｎ　　同第７ページ第４行目 「でん粉、セルロース」を「でん粉およびセルロースＪ
と補正する。

（８）同第８ページ第８行目 「結果を」を「結晶を」と補正する。

（９）同第１２ページ第４行目 「結果を得た。」の後に行を改めて次の文を挿入する。

「実施例３ 第３表に示す各菌株を、液体ブイヨン培地で、３０℃、
１６時間振とり培養し、これを実施例２の発酵用培地の
うち（ＮＨ４）Ｉ　Ｓ　０４　　を０．５９６、グルコ
ースを４．０％とした培地８００　ｄを分注しりが’ｙ
　Ｘ　製小１％ｌ　シャーファーメンタ−へ１０９６と
なるように接種した。３０℃にて、８００ｒｐｍ。

通気量１　ｖｖｍにて通気攪拌培養を開始した。ｐＨ調
節および窒素源の供給は、２．５４アンモニア水にて行
ない、ｐＨは６．５〜８．０に維持した。

グルコース、ＫＷ、　ＰＯ，およびＭｇＳＯ４・７Ｈ鵞
Ｏを適宜添加しながら、７０時間培養したところ第３表
に示すような結果を得た。

第　　３　　表

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属に
   属し、メチオニン代謝拮抗物質について耐性を有し、か
   つＬ−スレオニン生産能を有する微生物を培養して培養
   液中にＬ−スレオニンを生成蓄積せしめ、該培養液より
   Ｌ−スレオニンを採取することを特徴とする発酵法によ
   るＬ−スレオニンの製法。
2. （２）プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属に
   属し、メチオニン代謝拮抗物質に耐性を有し、かつＬ−
   スレオニン生産能を有する微生物。
3. （３）微生物がα−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸に
   耐性でＬ−イソロイシンを生育に要求することを特徴と
   する特許請求の範囲第２項記載の微生物。