JPH0673460B2 - 発酵法によるｌ−スレオニンの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は、発酵法によるＬ−スレオニンの製造方法に関
する。

Ｌ−スレオニンは、必須アミノ酸の１つであり、医薬
品、飼料添加物として重要であり、その安価な製造方法
が望まれている。

＜従来の技術＞ プロビデンシア属に属する微生物（バージェイズ マニ
ュアル オブ システマティック バクテリオロジー第
１巻（1984）で、一部プロビデンシア属に分類変更され
た、旧プロテウス属に属する微生物）を用いた発酵法に
よるＬ−スレオニンの製造方法としては、Ｌ−イソロイ
シン要求性株を用いる方法（特公昭43−4440号公報）
や、α−アミノ−β−ヒドロキシ−吉草酸に耐性を有
し、かつ、イソロイシン要求性を有する微生物を用いる
方法（日本農芸化学会講演要旨集、P9（1970）が知られ
ている。

＜発明が解決しようとする問題点＞ しかし、これらの方法によるＬ−スレオニンの生成蓄積
濃度、または、糖などの原料からのＬ−スレオニン生成
収率は、十分に満足できるものではなかった。

＜問題点を解決するための手段および作用＞ 本発明者らは、さらに生産性の高いＬ−スレオニンの製
造方法について、鋭意研究した結果、プロビデンシア属
に属し、Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物に、Ｌ−
リジン代謝拮抗物質に耐性を付与することによって、Ｌ
−スレオニンの蓄積濃度、生成収率が著しく向上するこ
とを見出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、プロビデンシア属に属し、Ｌ−ス
レオニン生産能を有する微生物のうち、リジン代謝拮抗
物質に耐性を有する微生物を培養して、培養液中にＬ−
スレオニンを生成蓄積せしめ、前記培養液からＬ−スレ
オニンを採取することを特徴とする発酵法によるＬ−ス
レオニンの製造方法である。

つぎに本発明を詳細に説明する。

本発明で用いられる微生物は、プロビデンシア属に属し
（バージーズ マニュアル オブ システマティック
バクテリオロジー第１巻第495〜496頁（1984）に従
う）、リジン代謝拮抗物質に耐性を有する微生物であ
る。

ここで、リジン代謝拮抗物質とは、プロビデンシア属に
属する微生物の１）生育を阻害し、その生育阻害がＬ−
リジンの添加による回復する物質、または、２）Ｌ−リ
ジン生合成系の酵素の抑制作用および阻害作用を示す物
質のことである。

ここで、リジン代謝拮抗物質としては、例えば、Ｓ−ア
ミノエチル−Ｌ−システイン、リジンハイドロキサメー
ト、４−ハイドロキシリジンなどが挙げられ、好ましく
は、Ｓ−アミノエチルシ−Ｌ−ステインが挙げられる。

かかる性質を有していれば、他の要求性、他の薬剤抵抗
性の性質を持つものでも本発明の範囲に含まれる。

本発明で用いられる変異株の代表的なものとしては、例
えば、プロビデンシア・レトゲリTP4−105−43（FERM B
P−1050）が挙げられる。

この変異株は、プロビデンシア・レトゲリATCC21118
（Ｌ−イソロイシン要求性）から得られたα−アミノ−
β−ハイドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−イソロイシン要求
性、Ｌ−エチオニン耐性、Ｌ−ロイシン要求性のプロビ
デンシア・レトゲリTP3−105より誘導されたもので、リ
ジン代謝拮抗物質のうちＳ−アミノエチル−Ｌ−システ
インに耐性な変異株である。変異株の誘導は、通常の変
異処理法によって比較的容易に取得できる。すなわち、
リジン代謝拮抗物質に耐性を有する変異株を得るには、
親株を紫外線照射するか、あるいは変異誘発剤（例えば
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、
エチルメタンスルオン酸など）で処理したのち、親株が
生育できないような量のリジン代謝拮抗物質を含む培地
で生育可能な菌株を取得すればよい。本発明で使用する
リジン代謝拮抗物質耐性株とは、リジン代謝拮抗物質の
濃度が2.5g/lとなるように添加した培地で培養した時の
24時間後の生育度が無添加の場合の50％以上のものをい
う。ここで生育度は、培養液の660nmにおける吸光度を
測定し、各菌株のリジン代謝拮抗物質を添加していない
培養液の吸光度を100％として表わした場合の相対吸光
度で示す。耐性を検定する場合のリジン代謝拮抗物質、
例えば、Ｓ−アミノエチル−Ｌ−システインは、市販の
物を用いればよい。

本発明におけるＬ−リジン生産用の培地は、炭素源、窒
素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量
成分を含有する通常の培地である。炭素源としては、グ
ルコース、フラクトース、でん粉およびセルロースの加
水分解物、糖蜜などの糖類、フマール酸、クエン酸、コ
ハク酸などの有機酸、グリセロールの如きアルコール類
などを２〜15％、窒素源として、酢酸アンモニウムの如
き有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウムの如き
無機アンモニウム塩、アンモニウムガス、アンモニア
水、尿素などを0.5〜40％、有機微量栄養素としては、
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンなどの被要求物質が、
0.001〜0.4％、または、必要に応じてコーンスティープ
リカー、ペプトン、酵母エキスなど０〜４％を、それぞ
れ適当量含有する培地が好適に用いられる。かかる培地
には、これらの他に、リン酸カリウム、硫酸第１鉄７水
和物、硫酸マグネシウム７水和物、硫酸マンガン４〜６
水和物などを、少量添加するのが通常である。培養は、
好気的条件が望ましい。培養の間、培地のpHは５〜９
に、温度は24〜37℃に調節し、48〜120時間振とうまた
は、通気培養すれば好ましい結果が得られる。

培養液から、Ｌ−スレオニンを採取するには通常の方法
を用いることができる。

例えば、菌体を除去した培養過液をpH2に塩酸で調整
したのち、強酸性イオン交換樹脂に通液後、希アンモニ
ア水で吸着成分を溶出し、脱アンモニア後、濃縮する。
これにアルコールを添加し、冷却保存下で生成した結晶
を集め、Ｌ−スレオニンを得ることができる。

＜実施例＞ 以下、実施例による本発明を具体的に説明する。

実施例１ A.（Ｓ−アミノエチル−Ｌ−システイン耐性変異株の分
離） プロビデンシア・レトゲリTP3−105（α−アミノ−β−
ヒドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−イソロイシン要求性、Ｌ−
エチオニン耐性、Ｌ−ロイシン要求性）の菌体に、常法
によりＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン処理（300μg/1、30℃で10分）した後、この細胞を
Ｓ−アミノエチル−Ｌ−システイン8g/l、Ｌ−スレオニ
ン10g/lL−イソロイシン10g/l、Ｌ−メチオニン10g/lを
添加した寒天培地（グルコース0.5％、硫安0.1％、リン
酸第１カリウム0.3％、リン酸第２カリウム0.7％、硫酸
マグネシウム７水和物0.01％、Ｌ−ロイシン0.005％を
含む最少培地）に塗布した。次に、30℃にて５〜７日培
養し、生じた大きなコロニーを釣菌分離して、Ｓ−アミ
ノエチル−Ｌ−システイン耐性株（プロビデンシア・レ
トゲリTP4−105−43を取得した。

B.（Ｓ−アミノエチル−Ｌ−システイン耐性変異株の耐
性度） 第１表に示す各菌株を、液体ブイヨン培地を用いて30℃
で16時間振とう培養し、生育した菌体を集菌し生理食塩
水でよく洗浄した。この菌体懸濁液を、Ｓ−アミノエチ
ル−Ｌ−システインを各々０、2.5、５、7.5、10g/lの
割合で含む最少培地（培地組成：グルコース0.5％、硫
安0.1％、リン酸第１カリウム0.3％、リン酸第２カリウ
ム0.7％、硫酸マグネシウム・７水和物0.01％、Ｌ−イ
ソロイシン0.005％、Ｌ−ロイシン0.005％）5mlに植菌
して、30℃にて14時間培養し、各菌株の生育度を調べ
た。その結果は、第１表に示すとおりである。

本発明で使用するＳ−アミノエチル−Ｌ−システインに
耐性な変異株（プロビデンシア・レトゲリTP4−105−43
は、親株のプロビデンシア・レトゲリTP3−105と比較し
て、高濃度のＳ−アミノエチル−Ｌ−システインによっ
て生育が阻止されず、強いＳ−アミノエチル−Ｌ−シス
テイン耐性を獲得していることを示している。

C.（Ｌ−スレオニン生産菌の培養およびＬ−スレオニン
の生産） 第２表に示す各菌株をそれぞれ液体ブイヨン培地で30
℃、16時間振とうして前培養したのち、予め120℃、10
分間蒸気滅菌した下記組成の発酵用培地40mlを含む1l容
エーレンマイヤーフラスコに前記培養液を各々4mlずつ
植継ぎ、30℃で150回転／分、振幅3cmの条件下、90時間
培養した。

発酵用培地組成 グルコース ８％ 硫 安 2.5％ リン酸第１カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム７水和物 0.04％ Fe2価イオン 2ppm Mn2価イオン 2ppm Ｌ−イソロイシン 0.0025％ Ｌ−ロイシン 0.08％ 炭酸カルシウム（別滅菌） ４％ pH 7.0（KOHで中和） 培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去した液中の
Ｌ−スレオニン濃度を、アミノ酸自動分析計（日本電子
（株）社製JLC−200A）で定量したところ、第２表に示
すような結果を得た。

スレオニン生成収率は、消費グルコースに対する生成ス
レオニンの重量収率で表わした。

プロビデンシア・レトゲリTP4−105−43の培養上清より
菌体を除き、その200mlを、強カチオン交換樹脂ダイヤ
イオンSK−1B（Ｈ型）のカラムに通した。カラムを水洗
後2Nアンモニア水でカラムの吸着成分を溶出し、脱色後
減圧濃縮した。これにエタノールを加え、冷却し、生成
した結晶を集めて乾燥した結果、純度96％以上のＬ−ス
レオニンの結晶4.6gを得た。

＜発明の効果＞ 本発明により、高収率でＬ−スレオニンの生成が可能と
なり、より安価なＬ−スレオニンの生産が可能となる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】プロビデンシア（Providencia）属に属し
   リジン代謝拮抗物質に耐性を有し、かつＬ−スレオニン
   生産能を有する微生物を培養して、培養液中にＬ−スレ
   オニンを生成蓄積せしめ、前記培養液よりＬ−スレオニ
   ンを採取することを特徴とする発酵法によるＬ−スレオ
   ニンの製造方法。
2. 【請求項２】リジン代謝拮抗物質が、Ｓ−アミノエチル
   −Ｌ−システインである特許請求の範囲第１項記載の発
   酵法によるＬ−スレオニンの製造方法。