JPH02219582A - 発酵法によるｌ―スレオニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、発酵法によるＬ−スレオニンの製造方法に関
するものである。

〈従来の技術〉 プロビデンシア属に属する微生物を用いる発酵法による
Ｌ−スレオニンの製造法としては、メチオニン代謝拮抗
物質に耐性を有し、かつＬ−スレオニン生産性を有する
微生物を用いる方法（特開昭６１−２１６６９８号公報
）や、生育のためにＬ−ロイシンを必要とし、かつＬ−
スレオニン生産能を有する微生物を用いる方法（特開昭
６１−２６０８９１号公報）が知られている。

〈発明が解決しようとする課題〉 しかし、これらの方法によるＬ−スレオニンの生成蓄積
濃度、または、糖などの原料がらのＬ−スレオニン生成
収率は十分に満足できるものではなかった。

く課題を解決するための手段および作用〉発明者らは、
さらに生産性の高いＬ−スレオニンの製造方法について
鋭意研究した結果、１０ビデンシア属に属しＬ−スレオ
ニン生産能を有する微生物に、バラアミノ安息香酸拮抗
物質に対する耐性を付与することによって、Ｌ−スレオ
ニン生産性が向上することを見い出し本発明に到達した
。

すなわち、本発明は、プロビデンシア属に属し、バラア
ミノ安息香酸拮抗物質に対する耐性を有し、かつＬ−ス
レオニン生産能を有する微生物を培養して、培養液中に
Ｌ−スレオニンを生成蓄積せしめ、前記培養液よりＬ−
スレオニンを採取することを特徴とする発酵法によるＬ
−スレオニンの製造法である。

ここで、パラアミノ安息香酸拮抗物質とは、グロビデン
シアに属する微生物の生育を阻害し、その生育阻害がバ
ラアミノ安息香酸の添加により回復する物質のことであ
る。

パラアミノ安息香酸拮抗物質としては、たとえば、サル
ファグアニジン、バラアミノベンゼンスルホンアミドな
どいわゆるサルファ剤または８−アザアデニンなどプリ
ン塩基生合成系阻害剤などが挙げられ、このうち、サル
ファグアニジンが特に好ましく用いられる。

本発明で用いられる微生物は１０ビデンシア属に属しく
バージ−のマニュアル・オブ・システマティク・バクテ
リオロジー第−巻（１９８４）、第４９５〜４９６頁に
従う）、パラアミノ安息香酸拮抗物質に対して耐性を有
する微生物である。

かかる性質を有していれば、他の栄養要求性、他の薬剤
抵抗性を持つものでも本発明の範囲に含まれる。特にバ
ラアミノ安息香酸拮抗物質耐性に加え、Ｌ−イソロイシ
ンまたは、Ｌ−ロイシンに対する栄養要求性ないしｔｅ
ａｋｙ型要求性、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸な
とスレオニン代謝拮抗物質に対する耐性およびエチオニ
ンなどメチオニン代謝拮抗物質に対する耐性は、Ｌ−ス
レオニン生成能に有効に作用するので、これらのいくつ
かの特性ないしはすべての特性をあわせ持つ微生物がよ
り好ましく用いられる。

本発明で用いられる変異株の代表的なものとしては、た
とえば、１０ビデンシア・レトゲリＳＧＲ５８８−７７
（ＦＥＲＭ　　　Ｐ−ｔθ夕ｃ２ｇ　　　）が挙げられ
る。

この変異株は、１０ビデンシア・レトゲリ０ＴＲ２８−
７０（α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−エ
チオニン耐性、チアイソロイシン耐性、オキシチアミン
耐性、Ｌ−ロイシン要求性、し−イソロイシン要求性な
いし１ｅａｋｙ型要求性（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９１９３）
）を親株として、通常の変異処理方法によって得られた
もので、パラアミノ安息香酸拮抗物質に耐性を有する変
異株である。

変異株の誘導は、通常の変異処理法によって行うことが
できる。すなわち、Ｌ−ホモセリンに耐性を有する変異
株を得るには、親株を紫外線照射するか、あるいは、変
異誘発剤（たとえば、Ｎ−メｆルーＮ−−二トローＮ−
二トロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸など）で
処理したのち、親株が十分生育できないような濃度のパ
ラアミノ安息香酸拮抗物質を含む固体培地で、親株に比
べて有意に生育可能な菌株を取得すればよい。

本発明におけるバラアミノ安息香酸拮抗物質耐性株゛と
は、その親株より強い耐性を有する菌株のことであり、
好ましくは親株の２４時間後の相対生育度が４０％以下
になるような濃度のパラアミノ安息香酸拮抗物質を含む
培地で培養した場合の相対生育度が５０％以上を示すよ
うなものをいう。

たとえば、サルファグアミジン耐性株の場合は、サルフ
ァグアニジン０．２　ｇ　／　Ｊとなるように添加した
培地で培養した時の２４時間後の生育度が、無添加の場
合の５０％以上のものを′サルファグアニジン耐性株と
いう。

ここで、相対生育度は、培養液の６６０ｎｍにおける吸
光度を測定し、各菌株のパラアミノ安息香酸拮抗物質を
添加していない培養液の吸光度を１００％として表わし
た場合の相対吸光度で示すものとする。

本発明におけるＬ−スレオニン生産用の培地は、炭素源
、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機
微量成分を含有する通常の培地である。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、でん粉お
よびセルロースの加水分解物、糖蜜などの糖類、フマー
ル酸、クエン酸、コハク酸などのごとき有機酸、グリセ
ロールのごときアルコール類などを２〜１５％、窒素源
として、酢酸アンモニウムのごとき有機アンモニウム塩
、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウムのごとき無機アンモニウム塩
、アンモニアガス、アンモニウム、尿素などを０．５〜
４．０％、有機微量栄養素としては、Ｌ−イソロイシン
などの被要求物質がｏ、ｏｏｉ〜０．４％、または必要
に応じてコーンステイープリカー、ペプトン、酵母エキ
スなど０〜４％をそれぞれ適当量含有する培地が好適に
用いられる。これらの他に、リン酸カリウム、ＷＸ酸マ
グネシウム、硫酸第１鉄７水和物、硫酸マンガン４−６
水和物などが微量成分として少量添加される。

培養は、好気的条件で行う、培養の間、培地のｐＨは５
から９に、温度は２４〜３７℃に調節し、４８〜１２０
時間振とうまたは通気培養すれば好ましい結果が得られ
る。

培養液よりＬ−スレオニンを採取するには、通常の方法
を用いることができる。たとえば、菌体を除去した培養
が液をｐＨ２に塩酸で調整したのち、強酸性カチオンイ
オン交換樹脂に通液後、希アンモニア水で吸着成分を溶
出し、脱アンモニア後、濃縮する。これにアルコールを
添加し、冷却保存下で生成した結晶を集め、Ｌ−スレオ
ニンを得ることができる。

〈実施例〉 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例Ｉ Ａ、（サルファグアニジン耐性株の分Ｍ）プロビデンシ
ア・レトゲリＯＴ　Ｒ２８−７０（α−アミノ−β−ヒ
ドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−エチオニン耐性、チアイソロ
イシン耐性、オキシチアミン耐性、Ｌ−ロイシン要求性
、Ｌ−インロイシン要求性ないしＪｅａｋ３’型要求性
）の菌体に常法によりＮ−メチル−Ｎニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジン処理 （３００μｇ　／　ｍｌ、３０℃で２０分）したのち、
この細胞をサルファグアニジン０．８ｇ／ぶ、Ｌ−ロイ
シン５０ｔ＠ｔ／１、Ｌ−イソロイシン５０■／１添加
した寒天培地（グルコース０゜５％、硫安０．１％、リ
ン酸第１カリウム０．３％、リン酸第２カリウム０．７
％、硫酸マグネシウム７水和物０．０１％を含む完全合
成培地）に塗布した。

次に３０℃にて、５〜７日培養し、サルファグアニジン
耐性株１０ビデンシア・レトゲリ５ＧＲ５８８−７７を
取得した。

Ｂ、（サルファグアニジン耐性株の耐性度）下記第１表
に示す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて３０℃で７時
間振とう培養し、生育した菌体を集菌し生理食塩水でよ
く洗浄した。この菌体懸濁液を、それぞれサルファグア
ニジン０．０．１．０．２．０．４ｔ／１の濃度で含む
最少培地（培地組成ニゲルコース０．５％、硫安０．１
％、リン酸第１カリウム０．３％、リン酸第２カリウム
０．７％、！ｆｉマグネシウム７水和物０．０１％、Ｌ
−インロイシン０．００５％、し−ロイシンＯ，ＯＯ５
％）５ｍｌに植菌して、３０℃で２４時間培養し、各菌
株の生育度を調べた。その結果は、第１表に示すとおり
である。ただし、サルファグアニジンは、市販のものを
用いた。

本発明方法で使用するサルファグアニジン耐性株１０ビ
デンシア・レトゲリ５ＧＲ５８８−７７では、親株のプ
ロビデンシア・レトゲリ０ＴＲ２８−７０と比較して、
サルファグアニジンによって生育が阻害されず、サルフ
ァグアニジンに対する耐性を獲得していることが明らか
である。

第　　１ 表 注：培養液の６６　Ｏｎ１１における吸光度を測定し、
各菌株のサルファグアニジンを添加していない培養液の
吸光度を１００％として表わした。

実施例２ （Ｌ−スレオニン生産菌の培養およびＬ−スレオニンの
生産） 第２表に示す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて３０℃
、２０時時間上うして前培養したのち、１１５℃、１０
分間オートクレーブで滅菌した下記組成の発酵培地４０
ｍ１を含むＩＪｌ容三角フラスコに接種し、３０℃、１
５０ｒｐｍ、振幅３Ｇ＋１の条件下で７２時間培養した
。

発酵用培地 グルコース（別滅菌）　　　　　８％ （ＮＨ４）２３０４　　　　　　３％ ＫＨ２ＰＯ４０，１％ Ｍｇ５Ｏ，・７　Ｈ２００，０４％ Ｆｅ”　　　　　　　　　　　　　　　２１）ＨＭｎ　
　　　　　　　　　　　　　２ｐｐｍし一イソロイシン
　　　　０．００５％Ｌ−ロイシン　　　　　　　０．
０６％ＣａＣＯ３（別滅菌）　　　　　４％ ｐＨ７（に０■で中和） 培養終了後、培養液から菌体、炭酸カルシウムを除去し
、そのｒ液中のＬ−スレオニンを自動アミノ酸分析計（
日本電子ＪＬＣ，２００Ａ）で定量したところ、第２表
に示す結果を得た。

第　　２　　表 スレオニン生成収率は、消費グルコースに対する生成ス
レオニン重量収率で表わした。

本発明例の１０ビデンシア・レトゲリ５ＧＲ５８８−７
７は、親株の１０ビデンシア・レトゲリ０ＴＲ２８−７
０と比較して、蓄積量、生成収率とも、顕著に高いＬ−
スレオニンを生産した。

実施例３ 第３表に示す菌株を、液体ブイヨン培地で３０℃、２０
時間、振とう培養し、これを実施例２の発酵用培地のう
ち、（ＮＨ＋＞２ｓＯ４を０．５％、グルコースを４，
０％とした以外は同様の培地８００ｍ１を分注したガラ
ス製小型ジャーファーメンタ−へ、接種サイズ１０％と
なるように接種した。３０℃、８００ｒｐｌＩ、通気量
ＩＶＶ１１で、通気攪拌培養を開始した。ＰＨ調節およ
び窒素源の供給は、２５％アンモニア水で行ない、ｐ　
Ｈは６．５〜８．０に維持した。グルコース、ＫＨ２Ｐ
Ｏ４、Ｍｇ５Ｏ＋　・７Ｈ２０，Ｌ−ロイシンおよびＬ
−イソロイシンを断続的に添加しながら、４８時間培養
したところ、第３表に示すような結果を得た。

第一　３　表 １０ビデンシア・レトゲリ５ＧＲ５８８−７７の培養液
より菌体を除き、その炉液５００ｍ１を強力チオン交換
樹脂ダイヤイオン５Ｋ−ＩＢ（Ｈ型）のカラムにとおし
た。カラムを水洗後、２Ｎアンモニア水でカラムの吸着
成分を溶出し、脱色後減圧濃縮した。

これにエタノールを加え、冷却し、生成した結晶を集め
て乾燥した結果、純度９６％以上のＬ−スレオニン３６
．７ｇを得た。

〈発明の効果〉 本発明法により、高い収率および高い蓄積濃度でＬ−ス
レオニン生成が可能となり、より安価なＬ−スレオニン
生産が可能となる。

特許出願大東し株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属に属し、
   パラアミノ安息香酸拮抗物質に対する耐性を有し、かつ
   Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物を培養して、培養
   液中にＬ−スレオニンを生成蓄積せしめ、前記培養液よ
   りＬ−スレオニンを採取することを特徴とする発酵法に
   よるＬ−スレオニンの製造法。