JPS60180597A - 発酵法によるｌ−スレオニンの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発酵法によるし一スレオニンの製法に関する。

Ｌ−スレオニンは必須アミノ酸の１つであり、医薬品、
飼料添加物として重要であり、その安価な製造方法が望
まれている。

従来、プロテウス属の微生物を用いた発酵法によるＬ−
スレオニンの製造方法としては、Ｌ−イソロイシン要求
性株を用いる方法（特公昭４３−４４４０　号公報）や
、α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸に耐性を有し、
かつＬ−イソロイシ、ン要求性株を用いる方法（日本農
芸化学会講演要旨ｐ　、９（１９７０）　）が知られて
いる。

本発明者らは、より有利な発酵法によるし一スレオニン
の製造方法について鋭意研究した結果、プロテウス属に
属する微生物のメチオニン代謝拮抗物質について耐性を
有する変異株が著量のＬ−スレオニンを生成蓄積せしめ
ることを見出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、プロテウス属に属し、Ｌ−スレオ
ニン生産能を有する微生物のメチオニン代謝拮抗物質に
耐性を有する微生物を培養して、培養液中にＬ−スレオ
ニンを生成蓄積せしめ、該培養液からＬ−スレオニンを
採取することを特徴とする発酵法によるし一スレオニン
の製法である。

プロテウス属に属する微生物のメチオニン代謝拮抗物質
に耐性を有する微生物の変異株は、これまでに分離され
たことがない。また、セラチア属に属し、メチオニン代
謝拮抗物質に耐性を有する変異株を用いてＬ−スレオニ
ンを製造することは公知である（特開昭５６−１３４９
９３＠公報）が、本発明のごとく、プロテウス属に属す
る微生物のメチオニン代謝拮抗物質に耐性を有する変異
株がＬ−スレオニンを著量に生成蓄積せしめ得ることは
、まったく新規の事実である。

次に本発明の詳細な説明する。

本発明で用いられる微生物はプロテウス属に属しくバー
ジ−のアニマルのオフ・テターミネイティブ・バクテリ
オロシー、第８版、第３２７〜３２９頁参照）、メチオ
ニン代謝拮抗物質に耐性を有する微生物である。ここで
、メチオニン代謝拮抗物質としては、例えばエチオニン
、ノルロイシン、クロトノイルグリシン、クロトノイル
グリシン、メチオニンスルフオキシ゛ムー血曇−シー等
が挙げられる。かかる性質を有していれば、他の要求性
、他の薬剤抵抗性等の性質をもつものでも本発明の範囲
に含まれる。

本発明で用いられる微生物は、上記耐性に加えて、好ま
しくはＬ−イソロイシンに対する栄養要求性を有し、か
つスレオニン生合成系がスレオニンのフィードバックコ
ントロールに抵抗性を有するものである。

ここにいう栄養要求性とは、広義の意味であり、不完全
欠失型（いわゆる１ｅａｋｙ型）も含むものである。さ
らに、Ｌ−イソロイシンの生合成前駆物質で要求性が満
足される場合も含むものである。

本発明で用いられる変異株の代表的なものとしては、例
えば以下のものがある。

プロテウス・しトゲリＥＴＲ１０−４３（ＦＥＲＭ　ｐ
：、−７３９５）、プロテウス・レトゲリＥＴＲ１０−
６３（ＦＥＲＭ　ｐ−７３９４）。

これらの変異株は、プロテウス・レトゲリＡ’ＴＣＣ２
１１１８（Ｌ−イソロイシン要求性）から得られたα−
アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸ｉｙ性株プロテウス拳
し１〜ゲリｌＮ４−７Ｈ（α−アミノ−β−ハイドロキ
ン吉草酸耐性、Ｌ−イソロイシン要求性）より誘導され
たもので、メチオニン代謝拮抗物質のうち、Ｌ−エチオ
ニンに耐性な変異株である。

変異株の誘導は、通常の変異処理法によって比較的容易
に取得できる。すなわち、メチオニン代謝拮抗物質に耐
性を有する変異株を得るには、親株を紫外線照射するか
、あるいは変異誘発剤（例えばＮ−メチル−Ｎ’−二ト
ローＮ−二トロソグアニシン、エチルメタンスルボッ酸
等）で処理した後、親株が生育できないような量のメチ
オニン代謝拮抗物質を含む固体培地で生育できるような
菌株を採取すればよい。さらに具体例を興雄側１に示す
。

本発明におけるメチオニン代謝拮抗物質耐性株とは、メ
チオニン代謝拮抗物質濃度が４　Ｍ９　／　ｍｌとなる
ように添加した培地で培養した時の２４時間後の生育度
が無添加の場合の７０％以上のものをいう。ここで生育
度は、培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、各
菌株のメチオニン代謝拮抗物質を添加していない培養液
の吸光度を１００％として表わした場合の相対吸光度で
示した。耐性を検定する場合のメチオニン代謝拮抗物質
、例えばエチオニン、ノルロイン７等は、市販のものを
用いた。本発明において用いる菌株と、その親株のし一
エチオニンに対する耐性を検定した結果を実施例１に示
す。

また、本発明においては、上記のようにして取得される
メチオニン代謝拮抗物質耐性株にＬ−イソロイシン要求
性、α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性等のスレ
オニン生産性を向上せしめる特性を、通常の変異誘導操
作によって付与することができるので、このような変異
株を使用することもできる。

本発明におけるし一スレオニン生産用の培地は炭素源、
窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微
量成分を含有する通常の培地である。炭素源としては、
グルコース、フラクト−ス、でん粉、セルロースの加水
分解物、糖蜜等の糖類、フマール酸、クエン酸、コハク
酸等の如き有機酸、グリセロールの如きアルコール類等
を２〜１５％、窒素源として、酢酸アンモニウムの如き
有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウムの如き無
機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水、尿
素等を０．５−；　４．０％、有機微量栄養素としては
、Ｌ−イソロイノン等の被要求物質が０．００１〜０．
４％、または必要に応じてコーノスティーブリカー、ペ
グ１−ン、酵母エキス等０〜４％をそれぞれ適当量含有
する培地が好適に用いられる。これらの他にリン酸カリ
ウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄７水和物、硫酸マ
ンガン４−６水和物等が少量添加される。

培養は、好気的条件が望ましい。培養の間、培地のｐＨ
は５から９に、温度は２４〜３７℃に調節し、４８〜１
２０時間振とうまたは通気培養すれば好ましい結果が得
られる。

培養液よりＬ−スレオニンを採取するには、例えば菌体
を除去した培養Ｐ液をＩ）Ｈ２に塩酸で調製したのち、
強酸性カチオンイオン交換樹脂に通液後、希アンモニア
水で吸着成分を溶出し、脱アンモニア後、ａｍする。こ
れにアルコールを添加し、冷却保存下で生成した結晶を
集め、Ｌ−スレオニンを得ることができる。

実施例Ｉ Ａ、（’Ｌ−エチオニン耐性変異株の取得ンプロテウス
・レトゲリＩＮ４．−７Ｈ（α−アミノ−β−ハイドロ
キシ吉草酸耐性、Ｌ−イソロイシン要求性）の菌体に、
通常の方法で紫外線照射し、この細胞をＬ−エチオニン
１０　ｆ／ｌ添加した寒天平板培地（グルコース１％、
硫安０．３％、リン酸第１カリウム０．０５％、リン酸
第２カリウム０．１５％、硫酸マグネシウム７水和物０
．０４％、Ｌ−イソロイシン０８０１％を含む最少培地
）に塗布した。次に３０℃にて４〜６日間培養し、生じ
た大きなコロニーを釣菌分離して、Ｌ−エチオニン耐性
株（プロテウス・レトゲリＥＴＲＩＯ−４３およヒＥ７
ｒＲ１０−６３）　を取得した。

Ｂ、（Ｌ−エチオニン耐性変異株の剛性度）下記第１表
に示す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて３０℃で１６
時時間表う培養し、生育した菌体を集菌し生理食塩水で
洗浄した。この菌体の懸〜液を、Ｌ−エチオニン０．４
，８．．１６ｇ／４の割合で含む最少培地（培地組成ニ
ゲルコース１０％、硫安０３％、リン酸第１カリウム０
．０５％、リン酸第２カリウム０．１５％、硫酸マグネ
シウム７水和物００１％、Ｌ−イノロイノン０．０１％
）５ｍｌに植菌して、３０℃にて２４時間培養し、各菌
株の生育度を調へた。その結果は、第１表に示すとおり
てあり、本発明方法で使用するエチオニンに耐性な変異
株（プロテウス・レトゲリＥＴＲ１０−４３またはプロ
テウス争しトゲリＥＴＲＩＯ−６３）では、親株のプロ
テウス・しトゲリＩ　Ｎ　４−７１１と比較して、高濃
度のし一エチぢニンによって生育が阻害されず、強いエ
チオニン耐性を獲得していることを示している。。

第１表 （注）培養液の６６０ｒ＋ｍにおける吸光度を測定し、
各菌株のし一エチオニノを添加していない培養液の吸光
度を１００％として表わした。

実施例２ 下記の組成の発酵用培地５０　ｍｌを１４容振とぅフラ
スコに入れ、１２０℃で１ｏ分間蒸気殺菌した。これに
、あらかじめグルコース２％、ポリペプトン１％、酵母
エキス１％、ＮａＣ７ｏ、　５％を含む種培養培地で３
０℃、１６時時間表ぅ培養した第２表に示す各菌株の培
養液５肩ｔを移し、３０　’Ｃにて１５０回転／分、振
幅３　ｏｘの条件下９０時間培養した。

発酵用培地組成 グルコース　８　％ （ＮＨ，＞２Ｓｏ、　２　％ ＫＨ２ｐｏ、　０．１　％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０４％ Ｆｅ＋２　Ｆ Ｍｎ什　２　ｗｍ Ｌ−イノロイジノ　０．００５％ ＣａＣ０ａ　（別滅菌）　３　％ ｐＨ７，０（ＫＯＨで中和） 第２表 培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去したＰ　Ｍ　
中のＬ−スレオニン濃度を、自動アミノ酸分析計（日本
電子ＪＬＣ２００Ａ）で定量したところ第２表に示すよ
うな結果を得た。

特許出願人　東　し　株　式　会　社 手　続　補　正　書 ６０、：、、１ 昭和　苑　月　日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １事件の表示 昭和５９年特許願第　３４１８６号 ２発明の名称 発酵法によるＬ−スレオニンの製法 ３補正をする者 事件との関係　特曹゛出願人 住　所　東京都中央区日本橋室町２丁目２番地４　補正
命令の日付 自　発 ５　補正により増加する発明の数　０ 、「頁参照）」を［項の記載に従うものである）」と補
正する。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）　プロテウス属に属し、メチオニン代謝拮抗物質
   について耐性を有し、かつＬ−スレオニン生産能を有す
   る微生物を培養して培養液中にＬ−スレオニンを生成蓄
   積せしめ、該培養液よりＬ−スレオニンを採取すること
   を特徴とする発酵法によるし一スレオニンの製法。
2. （２）　プロテウス属に属し、メチオニン代謝拮抗物質
   に耐性を有し、かつＬ−スレオニン生産能を有する微生
   物。
3. （３）微生物がα−アミノ−β−ハイドロキン吉草酸に
   耐性でＬ−イノロイシンを生育に要求することを特徴と
   する特許請求の範囲第２項記載の微生物。