JPH01187093A - 発酵法によるｌ―スレオニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は発酵法によるＬ−スレオニン（以下スレオニン
と略記）の製造法に関する。スレオニンは飼料用、医薬
品用に利用される重要なアミノ酸でおる。

（本発明が解決しようとする課題） 従来１発酵法によるスレオニンの製造法としてはブレビ
バクテリウム属細菌のスレオニンアナログであるα−ア
ミノ−β−とドロキシ吉草酸（以下ＡＨ′ｖと略記）に
耐性を有する変異株を使用する方法（Ａｇｒｌａ　、Ｂ
ｌｏｌ　、　Ｃｈ＠ｍ、、　３４（３）４４８−４５６
　（１９７０）　。

特公昭４５−２６７０８’）が知られている。この方法
はＡＨＶ耐性変異株のうち、スレオニンによるフィート
ノ童ツク阻害の解除されたホモセリンデヒドロダナーゼ
（以下器と略記）を持つ株を用いる方法である（Ｊ、Ｂ
ｉｏｅｈｓｍ、、　６８　、８５９−８６６（１９７０
）　）。この方法によるスレオニン生成収率は低く、シ
たがって飼料用に利用できる程安価ではない。そこで収
率向上のためにリジン生産株から変異誘導されることが
多い。この場合しばしばリジンを一生するためにスレオ
ニン収率が十分でなく、培養液からの分ｓｒより困難と
している。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは上述の課題を解決するために種々検討の結
果、ブレビバクテリウム属細菌からのジヒドロジピコリ
ン酸シンターゼ（以下ＤＰＳと略記）欠失あるいは低下
変異株がスレオニンを生産することを見出し次。これら
の変異株は肋のスレオニンによるフィードバック阻害が
解除されていないため、公知菌とは異なる新型のスレオ
ニン生産株である。

後述のようにこれらの変異株のスレオニン収率は従来型
の生産株とほぼ同じである。またＤＰＳはリノン生合成
経路上の第一酵素であるため、これの欠失あるいは低下
変異株１に誘導すればリジンの副生を軽減することがで
き、さらに、この変異は従来型のそれと全く異なる性質
であるため、従来型の株に重ね合せることでスレオニン
収率の向上も期待できる。

本発明のスレオニン製造法において用いられる微生物は
、ブレビバクテリウム属に属するＤＰ８欠失あるいは低
下味である。この性質の他にさらにＨＤのフィードバッ
ク阻害解除、Ｌ−メチオニン要求性、Ｌ−インロイシン
要求性、エチオニｙｉｌ、リジンアナログ耐性、ピルビ
ン酸キナーゼ欠失などを付与すると生産能ｔさらに向上
させることができる。

本発明の変異株の親株はいわゆるＬ−グルタミン酸生産
菌として知られているブレビバクテリウム属の微生物で
あり１例えば次のような菌？Ｒ１−あげることができる
。

ブレビ恍りデリウム　フラブム　　　　　　　　　ＡＴ
ＣＣ１４０６７プレビペクテリクム□デイパリカタム　
　　　　　　　ＡＴＣＣ１４０２０ブレビｉクテリウム
　ラクトファーメンタム　　　　Ａ’Ｌ’ＣＣｌ３８６
９プＡタジテリウム　ロゼラム　　　　　　　　　　Ａ
ＴＣＣ１３８２５本発明で用いる変異株はこれら上述の
凶昧ｔ−ｉ株として変位操作を施してＤＰＳの欠失ある
いは低下を付与することによって得られる。なお変異操
作は通常の方法１例えば紫外線照射或いはＮ−メチ）ｖ
−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンＣ以下ＮＧと
略記）、亜硝酸等の化学薬剤処理により行うことができ
る。ＤＰＳ人失あるいは低下変異株は変異処理後、ＡＨ
Ｖ耐性で且つスレオニンを生産する株を選択し、これら
の味のＤＰＳ活性を測定することにより分離できる。特
に親株としてアスＩ譬ルトキナーセ（以下ＡＫと略記）
のスレオニンとリジンによる相乗阻害解除型のリジン生
産株を用いる場合は、得られ７’ｈ　ＡＨＶ耐性スレオ
ニン生産株のうち、スレオニン生産量に比較しリジン副
生量が少い株を選択することでさらに効率よ（ＤＰ８欠
失株を得ることができる。

以下に本発明の使用菌株の一例プレビパクテリウム　フ
ラバムＡＪ　１２３６０（ＦＥＲＭ　Ｐ−１２１）の具
体的誘導方法を述べる。本菌株はブレビバクテリウム　
フラバムＡＪ　１４０６７から誘導されたアスパラギン
酸生産株ＡＪ　１１９５５（ＦＥＲＭＰ−６６６５、特
開昭を親株として誘導され比。ブレビバクテリウムフラ
バムＡＪ　１１９５５を１５０μｍ７−のＮＧで３０℃
。

１５分処理した。次いでＡＨＶ　１０１／ｌとリジン５
１／ｌｔ−含む第１表に示したグルコース最少寒天平板
培地（直径９ｃＩＩＬ）に平板あたりの菌数が約１０５
となるように接種し、５日間培養後に比視したコロニー
を耐性株として第２表に示した完全寒天平板培地に釣菌
した。次にこれらの株金試験管に３１Ｒ１分注した第３
表に示したスレオニン生産用培地（硫酸アンモニ９ム７
０１１／１１　、大豆加水分解物３０１！Ｌｌ／Ｉｔ−
含む培地を用いたが、この組成を以後単にＮ７０Ｓ３０
と略記する）に接種し、３０℃で７２時間振盪培養し、
スレオニンを生産する株七選択した。これらのうち最高
の生産能を示した変異株ＡＪ　１２３６０は、後述の方
法で測定したところ。

也のフィードバック阻害は親株と変わらないが、ＤＰ８
活性は欠失してい友（第４表）。

次に親株としてスレオニンとリジンによる相乗阻害の解
除されたＡＫを有するリジン生産株ブレビバクテリウム
　７ラパム　ＡＣ６６４株を用いて得られｆｌ：、ＤＰ
Ｓ久失欠失いは低下味ＡＪ　、１２３６１〜２（ＦＥＲ
ＭＰ−９？２２〜３）の具体的誘導方法について述べる
。ＡＣ６６４株ｆ：６００１１１１／−のＮＧで３０℃
、１５分処理した。次いでＮＧ処理菌体を２〜５１／ｌ
のＡＨＶ　ｔ−含む第５表に示した酢酸−ピルピン酸寒
天平板培地に平板あたりの菌数が約１０　個となるよう
に接種し、１２日間培養後までに出現したコロニーヲ耐
性株として釣菌した。これらの株のスレオニン、リシン
生産能を前述の培養方法で調べた。ただしスレオニン生
産用培地としてはＮ２５　Ｂ３＆の組成のものを用いた
。スレオニン生産量に比べてリジン副生量が少い５株を
選択した。これらのうち、第６表に示Ｌ７’ｊ！　５Ｋ
ＡＪ１２３６１〜２　、　ＤＡＩＩＯ０３ａ”’ｔ”Ｈ
Ｄのフィードバック阻害は親株と変わらないが、ＤＰＳ
活性が欠失あるいは低下していた。なおリジン副生量の
少い株を選択した理由は、ＤＰ８はジアミノピメリン酸
（以下ＤＡＰと略記）、リジン生合成経路上の反応を触
媒する酵素であるため、ＤＰＳ欠失株′においてはリジ
ン生産量が大幅に低下すると考えられるからである。実
際、これら３株は。

第６表に示し次ように、同じ親株から誘導された従来か
ら知られているスレオニンによるフィードバック阻害の
解除されｅ　ＨＤ　ｔ−持つスレオニン生産株の代表法
ＡＪ　１２３６３　（ＦＥＲＭＰ−’？１？、２４　）
に比べ、リジン／スレオニン比カ低かりｆｔ−６なお、
スレオニン生産量は後述の方法により。

リジン生産ｉは酸性ニンヒドリン法により測定した。ま
たＤＰＳ活性は次のように測定し友。第３表に示したス
レオニン生産用培地にＤＡＰ　１１１／ｌ　ｔ−添加し
た培地ｔ−５ｏｏ−容振盪フラスコに２０１１Ｌ１分注
し、加熱滅菌した。九だしＡＪ　１２３６０株にはＮ５
０Ｓ３０゜ＡＪ１２３６１〜２　、　ＤＡＩＩＯ株には
Ｎ２５８３５の組成のものを使用した。これにあらかじ
め第２表に示し比完全寒天平板培地にＤＡＰ　１１１／
ｌ　、　　Ｌ−ヒスチジン塩酸塩３００９／Ｊを添加し
た培地で３０℃、２４時間培養した菌体ｔ−１白金耳接
種し、３０℃で４０時間振盪培養後集菌し、０．２チ塩
化カリウム溶液で洗浄した。・この洗浄歯体ｔ５０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｍ７．０）に懸濁し、超音波処
理後遠心分離して得た上溝を、同バッファーを用いてセ
ファデックス０２５カラムでグルろかして粗酵素液を調
製した。活性測定は第７表に示した反応液で３０℃、１
０分間反応を行わせた後、　１Ｗ１ｔの０．０５Ｎ塩酸
を添加して反応を停止し、消費されたピルビン酸量を第
８表に示した反応液を用いて３４０ｎｍにおける吸光度
変化を測定することによ抄求めた。

なお反応の対照ｒｉＤＬ−アス／４ルテートーβ−セミ
アルデヒド無添加系とした。冊活性は次のように測定し
た。粗酵素液の調製は前述のＤＰ８の活性測定と同様の
方法で行っ九が、緩衝液として５０ｒａＭリン酸カリウ
ム緩衝液の代りに０．５Ｍ塩化カリウムを含む０．１Ｍ
リン酸カリウム緩衝液（ＰＨ７，０）ｔ−用いた。活性
測定は第９表に示した反応系で３４０ｎｍの吸光度の減
少を測定することにより行った。

反応の対照はＤＬ−アスパルテート−β−七きアルデヒ
ド無添加系とした。

次にＤＰＳ　ｆｉ失株ＡＪ　１２３６０　、　ＡＪ　１
２３６１　ＯＡＨＶ耐性変性度れらの親株と比較した。

ＡＨ’／耐性度は、ＤＡＰ１１１／１．ジピコリン酸５
０８９／１．およびＡＪ　１２３６１とその親株ＡＣ６
６４の場合にはさらに生育促進物質としてＬ−ヒスチジ
ン塩酸塩ｔ−３００Ｑ／ｌ添加し念第２表に示した完全
寒天平板培地で３０℃。

２４時間培養した菌体を、第１θ表に示したグルコース
最少液体培地で洗浄後、試験管に３ｄ分注した同培地に
接種し、２４時間振盪培養後の培養液の５６２　ｎｍに
おける吸光度ｔ−ＡＨＶ添加、無添加条件で測定比較す
ることにより求めた。なおこのグルコース最少液体培地
には生育促進物質としてＡＪ１２３６１とＡＣ６６４株
の場合にＦｉＬ−ヒスチジン塩酸塩ｔ−２００ダ／ｌ　
、　ＡＪ１２３６０とＡＪ　１１９５５株の場合にはＤ
ＡＰとリジンを各々５ｏＯｑ／ｌ添加した。

特にＤＡＰあるいはＤＡＰとリジンはＤＰＳ久失欠失い
は低下株の生育をしばしば促進したので、これまでの実
験においても必要に応じて液体、平板培地にＤＡＰ　ｆ
：添加している。第１１表に示したようにいずれのＤＰ
８欠失株とも親株に比較して加による生育阻害を受けに
くくなっており、ＡＲＭ耐性を獲得していた。

スレオニン生産用の培養培地は特に制限するところはな
く、炭素源、窒素源、無機塩及び必要ならば有機微量栄
養素を含有する通常の培地である。

炭素源としては炭水化物（グルコース、フラクトース或
いはデンプン。セルロース等の加水分解物。

糖蜜等）、有機酸（酢酸、クエン酸等）、アルコール（
グリセリン、エタノール等）、或いは炭化水素（ノルマ
ルノやラフイン等）が使用できる。窒素源としては硫酸
アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、アンモニアガス、その他を
、無機塩としてはリン酸塩、マグネシクム塩、カルシウ
ム塩、鉄塩。

マンガン塩、その他微量金属塩等を必要に応じて使用す
る。有機微量栄養素としては、栄養要求性のある場合に
は該当するアミノ酸、ビタミン、脂肪酸類、有機塩基物
質等を適量添加し、必要に応じて更に生育促進物質とし
てアミノ酸、ビタミン。

味液（登録商標、大豆加水分解物）＃酵母エキス。

ペグトン、カザミノ酸等が使用できる。特にＤＰＳ欠失
あるいは低下株の場合は、ＤＡＰ　−？　ＤＡＰとリジ
ンの添加によって生育が促進され、良好な結果が得られ
ることが多い。

培養条件は通常の方法でｐＨ５ないし９、温度は２０な
いし４０℃で好気的条件下に２４ないし７２時間培養す
れば良い。培養中に−が下がる場合には炭酸カルシウム
を別殺菌して加えるか又はアンモニア水、アンモニアガ
ス等のアルカリで中和する。又有機酸を炭素源とする場
合は−の上昇金鉱酸又は有機酸で中和する。

スレオニンの単離採取は常法によりて行いうル。

得られたものは薄層クロマトグラム上のＲｆ値及び微生
物定量法による生物活性値により、スレオニン標品のそ
れらと一致することを確めスレオニンと同定した。スレ
オニンの定量はロイコノストックメセンテロイデス（Ａ
ＴＣＣ８０４２）　を用いる微生物定量法に従りて行っ
た。

以下実施例にて説明する。

実施例１゜ 第３表に示し比スレオニン生産用培地（Ｎ５０Ｓ３０）
２０１を５００−容振盪フラスコに分注し、加熱滅菌し
た。これにあらかじめＤＡＰ　ｆｉｌｌｌ　、ジピコリ
ン酸５０ダ／ｌｔ−添加し次第２表の完全寒天平板培地
で３０℃、２４時間培養したＤＰＳ欠失株ＡＪ　１２３
６０およびその親株ＡＪ１１９５５の函体を一白金耳接
種し。

３０℃で７２時間娠盪培養し比。それぞれの培養液中の
スレオニン生成ｆは、１０．７ｇ／ｌ　、　ＯＩ／１（
検出限界以下）であった。

実施例２゜ スレオニン生産用培地としてＮ２５Ｓ３５の組成のもの
を用い、完全培地にＬ−ヒスチジン塩酸塩を３００〜／
ｌ添加した以外は実施例１と全く同様にＤＰＳ久失欠失
Ｊ１２３６１　、　ＤＡＩＩＯ、ＤＰ８低下低下Ｊ１２
３６２゜親株ＡＣ６６４および従来型生産株ＡＪ　１２
３６３　　ｔ”培養した。それぞれの培養液中のスレオ
ニン生成量は９．０　、６．３　、６．２　、０　、８
．９　ｆｉｌｌであった。

第１表　　ダルコース最少平板培地組成グルコース　　
　　　　　　２０１１／１硫酸アンモニウム　　　　　
　１０　＃ＫＷ２ＰＯ４１０＃ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，４＃ Ｆ　＠ＳＯ４・７Ｈ２０１０ダ／ｌ ＭｎＳＯ４４４Ｈ２０８，１’ チアミン塩酸塩　　　　　　０．１〃 ビオチン　　　　　　　　　０．３＃ 寒天　　　　　　　　　　２０１１７１ｐ８７．０　　
（ＮａＯＨ） 第２表　　完全寒天平板培地組成 ポリベグトン　　　　　　１０　ｆｉｌｌ酵母エキス　
　　　　　　ｌＯ＃ ＮａＣＡ　　　　　　　　　　　５　　ａグルコース　
　　　　　　　５　＃ 寒天　　　　　　　　　　２０１ ｐ）１７．０　　（ＮａＯＨ） 第３表　　　スレオニン生産用培地 ダルコース　　　　　　　　　１００１１／１硫酸アン
モニクム＊７０＃ ＫＨ２ＰＯ４１＃ ＭｇＳＯ４・７１１２０　　　　　　　　０．４　＃Ｆ
＠ＳＯ４・７Ｈ２０１０４／ｊ ＭｎＳＯ４・４Ｈ２０８，１Ｍ チアミン塩酸塩　　　　　　　０．２１ビオチン　　　
　　　　　　　０・３＃大豆加水分解物（全窒素３２１
／ｌ）＊３ｏＷＬｌ／１ｐｈ７．Ｑ　　（ＮａＯＨ） ＊硫酸アンモニウム７０１１／Ｉｔ、大豆加水分解物３
０ｍ１／ｌの組成の場合Ｎ７０Ｓ３０と表記する。

ＡＪ１１９５５（親株）　　６３．６　　　　　　　９
８ＡＪ１２３６０　（変異株）　　０　　　　　　　　
　９８＊　　　ｎｒｎｏｌ／ｍｉｎ／Ｉｆ　　ｐｒｏｔ
・ｌｎ＊＊　スレオニンＩｍｈｌｌ存在下における阻害
度（チ）第５表　　　酢酸−ピルピン酸寒天平板培地組
成酢酸　　　　　　　　　　　５ｇＺｌ ピルビン酸ナトリウム　　　　　　　　５　＃硫酸アン
モニウム　　　　　５　〃 ＫＨ２ＰＯ４１＃ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，４＃ Ｆ　＠Ｓ０４・７Ｈ２０１０〜／ｊ ＭｒｉＳＯ４−４Ｈ２０８，１＃ チアミン塩酸塩　　　　　　０．１ ピオチン　　　　　　　　　０．５ ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　　　２３．８９／１生育
促進物質　　　　　　　　＊ 寒天　　　　　　　　　　２０１１／１ｐＨ７，０（Ｎ
ａＯＨ） ＊酵母工中ス０．４１１／１１　、　Ｌ−シスチン、！
、−アラニン各２０９／１Ｌ−）リグトフ丁ン、Ｌ−フ
ェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ
−メチオニン、Ｌ−アルギニン塩酸塩各３００４／／第
７表　　　　ジヒドロジピコリン酸シンターゼ測定用反
応液組成 イミダゾール・塩酸緩衝液（ｐｉ（７，４）　　　　　
５０　　ｍＭピルビン酸ナトリウム　　　　　　　　　
２．５　ｍＭ粗酵素液　　　　　　　　　　　　　　Ｑ
、１ｍ／第８表　　　　ピルビン酸測定用反応液組成ト
リス鷹酸緩衝液（ｐＨ７，５）　　　　　　　　１００
ｍＭＮＡＤＨ２０，１５ｒｎＭ 乳酸脱水素酵素　　　　　　　　　　　２０ｔｔｌｌ第
７表の反応停止済反応液　　　　　０２ＴＩＬｔリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）　　　　　　１００ｍＭ
ＤＬ−アス／すＶテート−β−セずアルデヒド　　　　
　０．２　ｍＭ第１０表　　グルコース最少液体培地組
成グルコース　　　　　　　　　　　２０１／１硫酸ア
ンモニウム　　　　　　　１０　＃ＫＨ２ＰＯ４１＃ ＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，４＃ Ｆ＠ｓｏ４”　７Ｈ２０１０”９ ＭｎＳＯ４・４Ｈ２０Ｂ−１’ チアミン塩酸塩　　　　　　　　　０．１＃ビオチン　
　　　　　　　　　　　０．３１尿素　　　　　　　　
　　　　３９／１ｐＨ７，３（ＮａＯ）１） 第１１表　　ＤＰＳ欠失株のＡＨＶ耐性度＊　Ｍ■無添
加区の生育度’１ｆ００１とする。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ブレビバクテリウム属に属し、ジヒドロジピコリン
   酸シンターゼが欠失または低下した変異株を液体培地に
   培養し、培養液中にＬ−スレオニンを生成蓄積せしめ、
   これを採取することを特徴とするＬ−スレオニンの製造
   法。 ２）ブレビバクテリウム属に属しα−アミノ−β−ヒド
   ロキシ吉草酸に耐性を有し、かつジヒドロジピコリン酸
   シンターゼが欠失または低下した変異株を液体培地に培
   養し、培養液中にＬ−スレオニンを生成蓄積せしめ、こ
   れを採取することを特徴とするＬ−スレオニンの製造法
   。