JPH0369518B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、発酵法によるＬ−リジンの製造方法
に関する。本発明者らは、より生産性の高いＬ−
リジン生産菌を育種すべく研究した結果、ブレビ
バクテリウム属に属し、従来知られているＬ−リ
ジン生産菌が有する性質のうち、ピルビン酸キナ
ーゼ活性低下（特開昭58−170487、Agric.Biol.
Chem.471569〜1576（1976））、及びピルビン酸デ
ヒドロゲナーゼ活性低下（発酵と工業40110〜127
（1982））の両性質を併せ持つ変異株を誘導したと
ころ、それぞれの性質を有するＬ−リジン生産菌
より著しく高い収率で、Ｌ−リジンを生産するこ
とを見出した。本発明は、この知見にもとずいて
完成されるに到つたものである。 本発明のＬ−リジンの製造法において用いられ
る微生物は、ブレビバクテリウム属に属し、ピル
ビン酸キナーゼ活性低下および、ピルビン酸デヒ
ドロゲナーゼ活性低下の両性質を有し、かつリジ
ン生産能を有する変異株である。この２酵素活性
低下の他に、更に、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ
−システイン（以下AECと記す）に対する耐性、
Ｌ−ホモセリン要求性、Ｌ−スレオニン要求性、
Ｌ−ロイシン要求性、Ｌ−アラニン要求性、クエ
ン酸シンターゼ活性低下、γ−メチルリジン耐
性、α−クロロカプロラクタム耐性、β−フロロ
ピルビン酸感受性等の性質を付与せしめた菌株を
用いる事により、更にＬ−リジン生産能を増大さ
せる事ができる。 本発明の変異株の親株は、いわゆるＬ−グルタ
ミン酸生産菌として知られているブレビバクテリ
ウム属の微生物である。例えば ブレビバクテリウム・デバリカタム
ATCC 14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 14067 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC 13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825 等がある。本発明で用いる変異株は、これら上述
の菌株を親株として変異操作を施し、ピルビン酸
キナーゼ活性低下、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ
活性低下、及び例えばホモセリン要求性などのＬ
−リジン生産能を付与することによつて得られ
る。なお、変異操作は、紫外線照射、Ｎ−メチル
−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下
NGと略す）等の変異誘起材による処理等、通常
の変異処理法で行なうことができる。 ピルビン酸キナーゼ活性の低下した変異株は、
親株を変異処理し、変異処理した菌体のピルビン
酸キナーゼ活性を測定し、選択することによつて
（特開昭58−170487）、また、ピルビン酸デヒドロ
ゲナーゼ活性の低下した変異株は、親株を変異処
理し、酢酸要求性を示す変異株を誘導し、さらに
その変異株よ酢酸非要求性の復帰変異株を誘導す
る事により得られる。（発酵と工業、40、110〜
127、1982年） 以下に本発明の使用菌株の一例、ブルビバクテ
リウム・フラバムAJ12121FERM Ｐ−7441の具
体的誘導方法とピルビン酸キナーゼ活性、ピルビ
ン酸デヒドロゲナーゼ活性低下を示す実験例を示
す。 ピルビン酸キナーゼ活性の低下したＬ−リジン
生産菌ブレビバクテリウム・フラバムAJ11842
（FERM−P6464）（ピルビン酸キナーゼ低下、
AEC耐性、Ｌ−ホモセリン要求性）を親株とし
てピルビン酸デヒドロゲナーゼ低下変異株を誘導
した。600μｇ／mlのNGで30℃15分間処理した菌
体を（生残率10％）完全培地（第１表）の平板培
地に接種し、30℃４日間培養後、第２表に示す最
少培地及びこれに、酢酸ナトリウムを１ｇ／に
なるように添加した培地の２種の平板培地にレプ
リカし、前者に生育せず後者に生育するコロニー
を採取した。こうして得られた酢酸要求株の一菌
株No.29をさらに1000μｇ／mlのNGで30℃15分間
変異処理し（生残率４％）、処理菌を最少培地に
接種した。30℃５日間培養後現われてくるコロニ
ーすなわち酢酸非要求性株を採取し、このうちリ
ジン生産能のすぐれた変異株AJ12121、FERM
Ｐ−7441（ピルビン酸キナーゼ低下、ピルビン酸
デヒドロゲナーゼ低下、AEC耐性、Ｌ−ホモセ
リン要求生）を選択した。

【表】

【表】

【表】 この操作によつて得られた変異株
AJ12121FERM Ｐ−7441のピルビン酸キナーゼ
活性及びピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を、親
株AJ11842、FERM Ｐ−6464および野生株
ATCC14067と比較した結果を第３表に示した。 なお、ピルビン酸キナーゼ活性の測定は、
Agric.Biol.Chem.47(7)1569〜1576（1983）に従つ
た。またピルビン酸デヒドロゲナーゼは、酵素液
の調整をピルビン酸キナーゼと同様にし、活性の
測定は第４表に示す組成の反応液を調整し、21〜
23℃で酵素反応を行い、365nｍにおける吸光度
の増加の初速度を測定した。なおピルビン酸を除
いた反応液を対照とした。

【表】

【表】

【表】 こうして得られた変異株AJ12121、FERM Ｐ
−7441（ピルビン酸キナーゼ低下、ピルビン酸デ
ヒドロゲナーゼ低下、AEC耐性、Ｌ−ホモセリ
ン要求性）のＬ−リジン生産能は、実施例に示す
ように、対糖収率55％（蓄積55ｇ／）であり、
ピルビン酸キナーゼ活性低下のみを有する菌株
AJ11842、FERM Ｐ−6464（ピルビン酸キナーゼ
低下、AEC耐性、Ｌ−ホモセリン要求性）のＬ
−リジン対糖収率の、2.0倍に増加している。一
方、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性低下のみを
有する菌株によるＬ−リジン生産は、文献（発酵
と工業、40110〜127，1982年）の図１３に示され
ており、最高約27ｇ／である。変異株
AJ12121、FERM Ｐ−7441のＬ−リジン蓄積は、
これと比べても著しく高い。 これらの結果は、ピルビン酸キナーゼ活性低下
及びピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性低下の両性
質を併せ持つ事が、Ｌ−リジン生産能増加に極め
て有効である事を示している。 Ｌ−リジン生産用の培養培地は特に制限すると
ころはなく、炭素源、窒素源、無機塩及び必要な
らば有機微量栄養素を含有する通常の培地であ
る。炭素源として炭水化物（グルコース、フラク
トース或いはデンプン、セルロース等の加水分解
物、糖密等）、有機酸（酢酸、クエン酸等）、アル
コール（グリセリン、エタノール等）、或いは炭
化水素（ノルマルパラフイン等）が使用できる。
窒素源としては硫酸アンモニウム、尿素、硝酸ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、アンモニアガス、その他を、無機塩として
はリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄
塩、マンガン塩、その他微量金属塩等を必要に応
じて使用する。有機微量栄養素としては栄養要求
性のある場合には該当するアミノ酸、ビタミン、
脂肪酸類、有機塩基物質等を適量添加し、必要に
応じて更に生育促進物質としてアミノ酸、ビタミ
ン、味液（登録商標、大豆加水分解物）、酵母エ
キス、ペプトン、カザミノ酸、NZアミン、コー
ンスチープリカー等が使用できる。 培養条件は、通常の方法でPH５ないし９、温度
は20ないし40℃で好気的条件下に24ないし72時間
培養すれば良い。培養中にPHが下がる場合には炭
酸カルシウムを別殺菌して加えるか又はアンモニ
ア水、アンモニアガス等のアルカリで中和する。
又、有機酸を炭素源とする場合はPHの上昇を鉱酸
又は有機酸で中和する。 発酵液からのリジンの採取は、通常、イオン交
換樹脂法、その他公知の方法を組み合わせること
によりおこなわれ、培地の種類によつては直接晶
析法により行なうことも可能である。 以下実施例を示す。 実施例 第５表の組成の培地を500ml容振とうフラスコ
に分注し、110℃にて10分間蒸気殺菌した。

【表】 この培地に、あらかじめ完全寒天培地（第１
表）で24時間生育せしめた試験菌を１白金耳ずつ
接種し、30℃にて72時間振とう培養した。培養液
中に生成蓄積した、Ｌ−リジンの量を、酸性−銅
ニンヒドリン比色法で測定した。その結果を第６
表に示す。

【表】 AJ11842及びAJ12121の培養液を集め、遠心分
離して不溶性物質を除去し、得られた上清液1.0
を強酸性イオン交換樹脂〔アンバーライト1R
−120，Ｈ型〕カラムに通し、Ｌ−リジンを吸着
させた。次いで３％アンモニア水で溶出し、溶出
液を減圧下濃縮し、塩酸を加えた後、冷却・晶析
し、それぞれ24ｇ、47ｇのＬ−リジン塩酸塩（２
水塩）を得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ブレビバクテリウム属に属し、ピルビン酸キ
   ナーゼ活性及び、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活
   性が低下し、かつＬ−リジン生産能を有する変異
   株を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積し
   た、Ｌ−リジンを採取することを特徴とする発酵
   法によるＬ−リジンの製造方法。