JPS60168393A - 発酵法によるｌ−リジンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−リジンの製造法Info
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- JPS60168393A JPS60168393A JP2557684A JP2557684A JPS60168393A JP S60168393 A JPS60168393 A JP S60168393A JP 2557684 A JP2557684 A JP 2557684A JP 2557684 A JP2557684 A JP 2557684A JP S60168393 A JPS60168393 A JP S60168393A
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- Japan
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- lysine
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- strain
- producing
- pyruvic acid
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、発酵法によるＬ −ＩＪリジン製造方法に関
する。本発明者らは、より生産性の高いＬ−リジン生産
菌を育種すべく研究した結果、ブレビバクテリウム属に
属し、従来知られているＬ−リジン生産菌が有する性質
のうち、ピルビン酸キナーゼ活性低下（特開昭５８−１
７０４８７． Ａｇｒｉｃ。
する。本発明者らは、より生産性の高いＬ−リジン生産
菌を育種すべく研究した結果、ブレビバクテリウム属に
属し、従来知られているＬ−リジン生産菌が有する性質
のうち、ピルビン酸キナーゼ活性低下（特開昭５８−１
７０４８７． Ａｇｒｉｃ。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、４７１５６９〜１５７６（１９７
６））、及びピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性低下（発
酵と工業４−０１１０〜１２７（１９８２））の両性質
を併せ持つ変異株を誘導したところ、それぞれの性質を
有するＬ −ＩＪリジン産菌より著しく高い収率で、Ｌ
−リジンを生産することを見出した。本発明は、この知
見にもとすいて完成されるに到ったものである。
６））、及びピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性低下（発
酵と工業４−０１１０〜１２７（１９８２））の両性質
を併せ持つ変異株を誘導したところ、それぞれの性質を
有するＬ −ＩＪリジン産菌より著しく高い収率で、Ｌ
−リジンを生産することを見出した。本発明は、この知
見にもとすいて完成されるに到ったものである。
本発明のし一リジンの製造法において用いられる微生物
は、ブレビバクテリウム属に桐し、ピルビン酸キナーゼ
活性低下および、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性低下
の両性質を有し、かつリジン生産能を有する変異株であ
る。この２酵素活性低下の他に、更に、５−（２−アミ
ノエチル）−Ｌ−システィン（以下ＡＢＣと記す）に対
する耐性、ヒホモセリン要求性、Ｌ−スレオニン要求性
、Ｌ−ロイシン要求性、Ｌ−アラニン要求性、クエン酸
シンターゼ活性低下、γ−メチルリジン耐性、α−クロ
ロカグロラクタム耐性、β−７０ロビルビン酸感受性等
の性質を付与せしめた菌株を用いる事により、更にＬ−
リジン生産能を増大させる事ができる。
は、ブレビバクテリウム属に桐し、ピルビン酸キナーゼ
活性低下および、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性低下
の両性質を有し、かつリジン生産能を有する変異株であ
る。この２酵素活性低下の他に、更に、５−（２−アミ
ノエチル）−Ｌ−システィン（以下ＡＢＣと記す）に対
する耐性、ヒホモセリン要求性、Ｌ−スレオニン要求性
、Ｌ−ロイシン要求性、Ｌ−アラニン要求性、クエン酸
シンターゼ活性低下、γ−メチルリジン耐性、α−クロ
ロカグロラクタム耐性、β−７０ロビルビン酸感受性等
の性質を付与せしめた菌株を用いる事により、更にＬ−
リジン生産能を増大させる事ができる。
本発明の変異株の親株は、いわゆるＬ−グルメミン酸生
産菌として知られているブレビバクテリウム属の微生物
である。例えば ブレビバクテリウム・デバリカタム ＡＴＣＣ１４０２
０ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ１４０６７
ブレビパクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ
１３８６９ブレビバクテリウム・ロゼラム ＡＴＣＣ１
３８２５等がある。本発明で用いる変異株は、これら上
述の菌株をＭ１株として変異操作を施し、ピルビン酸キ
ナーゼ活性低下、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性低下
、及び例えばホモセリン要求性などのＬ−リジン生産能
を付与することによって得られる。
産菌として知られているブレビバクテリウム属の微生物
である。例えば ブレビバクテリウム・デバリカタム ＡＴＣＣ１４０２
０ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ１４０６７
ブレビパクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ
１３８６９ブレビバクテリウム・ロゼラム ＡＴＣＣ１
３８２５等がある。本発明で用いる変異株は、これら上
述の菌株をＭ１株として変異操作を施し、ピルビン酸キ
ナーゼ活性低下、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性低下
、及び例えばホモセリン要求性などのＬ−リジン生産能
を付与することによって得られる。
なお、変異操作は、紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−二
トローＮ−ニトロソグアニジン（以下ＮＧと略す）等の
変異誘起剤による処理等、通常の変異処理法で行なうこ
とかできる。
トローＮ−ニトロソグアニジン（以下ＮＧと略す）等の
変異誘起剤による処理等、通常の変異処理法で行なうこ
とかできる。
ピルビン酸キナーゼ活性の低下した変異株は、親株を変
異処理し、変異処理した菌体のピルビン酸キナーゼ活性
を測定し、選択することによって（特開昭５８−１７０
４８７）、また、ピルビン酸デヒドロケ゛ナーゼ活性の
低下した変異株は、親株を変異処理し、酢酸要求性を示
す変異株を誘導し、さらにその変異株よシ酢酸非璧求性
の復帰変異株を誘導する事により得られる。（発酵と工
業４」。
異処理し、変異処理した菌体のピルビン酸キナーゼ活性
を測定し、選択することによって（特開昭５８−１７０
４８７）、また、ピルビン酸デヒドロケ゛ナーゼ活性の
低下した変異株は、親株を変異処理し、酢酸要求性を示
す変異株を誘導し、さらにその変異株よシ酢酸非璧求性
の復帰変異株を誘導する事により得られる。（発酵と工
業４」。
１１０〜１２７．１９８２年）
以下に本発明の使用菌株の一例、プルビパクテリウム・
フラバムＡＪ１２１２１ ＦＥＲＭ Ｐ−７ゾく／の具
体的誘導方法とピルビン酸キナーゼ活性、ピルビン酸デ
ヒドロゲナーゼ活性低下を示す実験例を示す。
フラバムＡＪ１２１２１ ＦＥＲＭ Ｐ−７ゾく／の具
体的誘導方法とピルビン酸キナーゼ活性、ピルビン酸デ
ヒドロゲナーゼ活性低下を示す実験例を示す。
ピルビン酸キナーゼ活性の低下したＬ −ＩＪリジｌｆ
７ｍブレビバクテリウム・フラバムＡＪ １１８４２（
ＦＥＲＭ−Ｐ ６４６４ ） （ピルビン酸キナーゼ低
下、ＡＥＣ酎性１Ｌ−ホモセリン要求性）を親株として
ピルビン酸デヒドロダナーゼ低下変異株を誘導した。６
００ ｔｔｆｉ／ｍｌのＮＧで３０℃１５分間処理した
菌体を（生残率１０％）完全培地（第１表）の平板培地
に接種し、３０℃４日間培養後、第２表に示す最少培地
及びこれに、酢酸ナトリウムを１９／ｌになるように添
加した培地の２種の平板培地にレプリカし、前者に生育
せず後者に生育するコロニーを採取した。こうして得ら
れた酢酸要求株の一菌株Ａ ２９をさらに１０００ ｔ
ｉｇ／ｒｎｌのＮＧで３０℃１５分間変異処理しく生残
率４チ）、処理菌を最少培地に接種した。３０℃５日間
培養後現われてくるコロニーすなわち酢酸非要求性株を
採取し、このうちリジン生産能のすぐれた変異株ＡＪ１
２１２１．ＦＥＢＭＰ−７１７／ （ピルビン酸キナー
ゼ低下、ピルビン酸デヒドロダナーゼ低下、 ＡＥＣ耐
性、Ｌ−ホモセリン要求性）を選択した。
７ｍブレビバクテリウム・フラバムＡＪ １１８４２（
ＦＥＲＭ−Ｐ ６４６４ ） （ピルビン酸キナーゼ低
下、ＡＥＣ酎性１Ｌ−ホモセリン要求性）を親株として
ピルビン酸デヒドロダナーゼ低下変異株を誘導した。６
００ ｔｔｆｉ／ｍｌのＮＧで３０℃１５分間処理した
菌体を（生残率１０％）完全培地（第１表）の平板培地
に接種し、３０℃４日間培養後、第２表に示す最少培地
及びこれに、酢酸ナトリウムを１９／ｌになるように添
加した培地の２種の平板培地にレプリカし、前者に生育
せず後者に生育するコロニーを採取した。こうして得ら
れた酢酸要求株の一菌株Ａ ２９をさらに１０００ ｔ
ｉｇ／ｒｎｌのＮＧで３０℃１５分間変異処理しく生残
率４チ）、処理菌を最少培地に接種した。３０℃５日間
培養後現われてくるコロニーすなわち酢酸非要求性株を
採取し、このうちリジン生産能のすぐれた変異株ＡＪ１
２１２１．ＦＥＢＭＰ−７１７／ （ピルビン酸キナー
ゼ低下、ピルビン酸デヒドロダナーゼ低下、 ＡＥＣ耐
性、Ｌ−ホモセリン要求性）を選択した。
第１表 完全培地の組成
ペプトン １０
酵母エキス １０
塩化ナトリウム ５
グルコース ５
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム １０
、（５）
第２表 最少培地の組成
グルコース ２０ ｇ／Ｉｔ
硫酸アンモニウム １０１１／ｌ
ＫＨ２ＰＯ４］ Ｏ１７１
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，４＆／ｌ
ＦｅＳＯ４４Ｈ２０１０ｍＶＩ
ＭｎＳＯ４・４Ｈ２０８，ＩＴｎ９／ｌビオチン ３０
０μＶｌ サイアミン塩酸塩 ｉｏｏμｍ１／Ｉ Ｌ−スレオニン ２００■々 （ＰＨ７，０） この操作によって得られた変異株ＡＪ１２１２１ＦＥＲ
Ｍ Ｐ −７ブク／のピルビン酸キナーゼ活性及びピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ活性を、親株ＡＪ １１８４２
、ＦＥＲＭ Ｐ −６４６４オＪ：び野生株ＡＴＣＣ１
４０６７と比較した結果を第３表に示した。
０μＶｌ サイアミン塩酸塩 ｉｏｏμｍ１／Ｉ Ｌ−スレオニン ２００■々 （ＰＨ７，０） この操作によって得られた変異株ＡＪ１２１２１ＦＥＲ
Ｍ Ｐ −７ブク／のピルビン酸キナーゼ活性及びピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ活性を、親株ＡＪ １１８４２
、ＦＥＲＭ Ｐ −６４６４オＪ：び野生株ＡＴＣＣ１
４０６７と比較した結果を第３表に示した。
なお、ピルビン酸キナーゼ活性の測定は、 Ａｇｒｉｃ
。
。
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ４７ （７） １５６９〜１
５７６ （１９８３）（６） ニ従った。またピルビン酸デヒドロダナーゼは、酵素液
の調整をピルビン酸キナーゼと同様にし、活性の測定は
第４表に示す組成の反応液を調整し、２１〜２３℃で酵
素反応を行い、３６５ｎｍにおける吸光度の増加の初速
塵を測定した。なおピルビン酸を除いた反応液を対照と
した。
５７６ （１９８３）（６） ニ従った。またピルビン酸デヒドロダナーゼは、酵素液
の調整をピルビン酸キナーゼと同様にし、活性の測定は
第４表に示す組成の反応液を調整し、２１〜２３℃で酵
素反応を行い、３６５ｎｍにおける吸光度の増加の初速
塵を測定した。なおピルビン酸を除いた反応液を対照と
した。
こうして得られた変異株ＡＪ１２１２１、ＦＩＤＲＭ
Ｐ−７＜４／ （ピルビン酸キナーゼ低下、ピルビン酸
デヒドロゲナーゼ低下、ＡＢＣ耐性、Ｌ−ホモセリン要
求性）のＬ −ＩＪレジン産能は、実施例に示すように
、対糖収率５５％（蓄積ｓ５．！ｉ’／Ａ）でアシ、ピ
ルビン酸キナーゼ活性低下のみを有する菌株ＡＪ １１
８４２ 、 ＦＥＢＭＰ−６４６４（ピルビン酸キナー
ゼ低下、ＡＥＣ耐性、Ｌ−ホモセリン要求性）のＬ＋
ＩＪリジン糖収率の、２．０倍に増加シテいる。一方、
ピルビン酸デヒドロダナーゼ活性低下のみを有する菌株
によるＬ−ＩＪリジン産は、文献（発酵と工業、±」
１１０〜１２７．１９８２年）の図１３に示されておシ
、最高約２７ ｇ／１３でおる。変異株ＡＪ１２１２１
、ＦＥＲＭ Ｐ −Ｍｆ／のＬ−リジン蓄積は、これと
比べても著しく高い。
Ｐ−７＜４／ （ピルビン酸キナーゼ低下、ピルビン酸
デヒドロゲナーゼ低下、ＡＢＣ耐性、Ｌ−ホモセリン要
求性）のＬ −ＩＪレジン産能は、実施例に示すように
、対糖収率５５％（蓄積ｓ５．！ｉ’／Ａ）でアシ、ピ
ルビン酸キナーゼ活性低下のみを有する菌株ＡＪ １１
８４２ 、 ＦＥＢＭＰ−６４６４（ピルビン酸キナー
ゼ低下、ＡＥＣ耐性、Ｌ−ホモセリン要求性）のＬ＋
ＩＪリジン糖収率の、２．０倍に増加シテいる。一方、
ピルビン酸デヒドロダナーゼ活性低下のみを有する菌株
によるＬ−ＩＪリジン産は、文献（発酵と工業、±」
１１０〜１２７．１９８２年）の図１３に示されておシ
、最高約２７ ｇ／１３でおる。変異株ＡＪ１２１２１
、ＦＥＲＭ Ｐ −Ｍｆ／のＬ−リジン蓄積は、これと
比べても著しく高い。
これらの結果は、ピルビン酸キナーゼ活性低下及びピル
ビン酸デヒドロダナーゼ活性低下の両性質を併せ持つ事
が％Ｌ−！Ｊジン生産能増加に極めて有効である事を示
している。
ビン酸デヒドロダナーゼ活性低下の両性質を併せ持つ事
が％Ｌ−！Ｊジン生産能増加に極めて有効である事を示
している。
Ｌ −ＩＪレジン産用の培養培地は特に制限すると（１
０） こ↓は々く、炭素源、窒素源、無機塩及び必要々らげ有
機微量栄養素を含有する通常の培地である。
０） こ↓は々く、炭素源、窒素源、無機塩及び必要々らげ有
機微量栄養素を含有する通常の培地である。
炭素源として炭水化物（グルコース、フラジ） −ス或
いはデンプン、セルロース等の加水分解物、糖蜜等）、
有機酸（酢酸、クエン酸等）、アルコール（グリセリン
、エタノール等）、或いハ炭化水素（ノルマル・ぐラフ
イン等）が使用できる。窒素源としては硫酸アンモニウ
ム、尿素、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩
化アンモニウム、アンモニアガス、その他を、無機塩と
してはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩
、マンガン塩、その他微量金属塩等を必要に応じて使用
する。有機微量栄養素としては栄養要求性のある場合に
は該当するアミノ酸、ビタミン、脂肪酸類、有機塩基物
質等を適量添加し、必要に応じて更に生育促進物質とし
てアミノ酸、ビタミン、味液（登録商標、大豆加水分解
物）、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、ＮＺチアミ
ンコーンスチーデリカー等が使用できる。
いはデンプン、セルロース等の加水分解物、糖蜜等）、
有機酸（酢酸、クエン酸等）、アルコール（グリセリン
、エタノール等）、或いハ炭化水素（ノルマル・ぐラフ
イン等）が使用できる。窒素源としては硫酸アンモニウ
ム、尿素、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩
化アンモニウム、アンモニアガス、その他を、無機塩と
してはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩
、マンガン塩、その他微量金属塩等を必要に応じて使用
する。有機微量栄養素としては栄養要求性のある場合に
は該当するアミノ酸、ビタミン、脂肪酸類、有機塩基物
質等を適量添加し、必要に応じて更に生育促進物質とし
てアミノ酸、ビタミン、味液（登録商標、大豆加水分解
物）、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、ＮＺチアミ
ンコーンスチーデリカー等が使用できる。
培養条件は、通常の方法でｐＨ５’ｒいし９、温度け２
０ないし４０℃で好気的条件下に２４ないし７２時間培
養すれば良い。培養中にＰｌ（が下がる場合には炭酸カ
ルシウムを別殺菌して加えるか又はアンモニア水、アン
モニアガス等のアルカリで中和する。又、有機ｅを炭素
源とする場合はＰＨの上昇を鉱酸又は有機酸で中和する
。
０ないし４０℃で好気的条件下に２４ないし７２時間培
養すれば良い。培養中にＰｌ（が下がる場合には炭酸カ
ルシウムを別殺菌して加えるか又はアンモニア水、アン
モニアガス等のアルカリで中和する。又、有機ｅを炭素
源とする場合はＰＨの上昇を鉱酸又は有機酸で中和する
。
発酵液からのリジンの採取は、通常、イオン交換樹脂法
、その他公知の方法を紹み合わせることによりおこなわ
れ、培地の種類によっては直接晶析法によシ行々うこと
も可能である。
、その他公知の方法を紹み合わせることによりおこなわ
れ、培地の種類によっては直接晶析法によシ行々うこと
も可能である。
月下実施例を示す。
実施例
第５表の組成の培地を５００ ｍｌ容振とうフラスコに
分注し、１１０℃にて１０分間蒸気殺菌した。
分注し、１１０℃にて１０分間蒸気殺菌した。
第５表 ［、−ＩＪレジン産用培地の組成グルコース
１００ ｇ／ｌ 硫酸アンモニウム ６０ ｇ／Ｉ ＫＨ２Ｐ０４ １１１／Ａ！ Ｍｇ５Ｏａ −７Ｈ２００，４Ｖｌｌ ＦｅＳＯ４，７Ｈ２０１０”０１／１３ＭｎＳＯ４、４
Ｈ２０８，Ｉ Ｑ／１ ビオチン ３００μ９／１ サイアミン塩酸塩 ２００μＦ／／１ 大豆蛋白塩酸加水分解液 ３５ ｍｌ／ｌ（総窒素３．
２係） Ｌ −１ｆ：ｉｒ＝ン２００ｍ９／１ （ｐＨ７，０） この培地に、あらかじめ完全寒天培地（第１表）で２４
時間生育せしめた試験菌を１白金耳ずつ接種し、３０℃
にて７２時間振とり培養した。培養液中に生成蓄積した
、Ｌ ＋ ＩＪリジン量を、酸性−銅ニンヒドリン比色
法で測定した。その結果を第（１３） ６表に示す。
１００ ｇ／ｌ 硫酸アンモニウム ６０ ｇ／Ｉ ＫＨ２Ｐ０４ １１１／Ａ！ Ｍｇ５Ｏａ −７Ｈ２００，４Ｖｌｌ ＦｅＳＯ４，７Ｈ２０１０”０１／１３ＭｎＳＯ４、４
Ｈ２０８，Ｉ Ｑ／１ ビオチン ３００μ９／１ サイアミン塩酸塩 ２００μＦ／／１ 大豆蛋白塩酸加水分解液 ３５ ｍｌ／ｌ（総窒素３．
２係） Ｌ −１ｆ：ｉｒ＝ン２００ｍ９／１ （ｐＨ７，０） この培地に、あらかじめ完全寒天培地（第１表）で２４
時間生育せしめた試験菌を１白金耳ずつ接種し、３０℃
にて７２時間振とり培養した。培養液中に生成蓄積した
、Ｌ ＋ ＩＪリジン量を、酸性−銅ニンヒドリン比色
法で測定した。その結果を第（１３） ６表に示す。
第６表 し−リジンの蓄積量
ＡＪ１１８４２ ２８ ２８
ＡＪ１２１２１ ５５ ５５
ＡＪ１１８４２及びＡＪ１２１２１の培養液を集め、遠
心分離して不溶性物質を除去し、得られた上清液１、Ｏ
ｌを強酸性イオン交換樹脂〔アンバーライトＩＲ−１２
０．Ｈ型〕カラムに通し、Ｌ−リジンを吸着させた。次
いで３チアンモニア水で溶出し、溶出液を減圧下濃縮し
、塩酸を加えた後、冷却・晶析し、それぞれ２４ｇ、４
７ｇのし一リジン塩酸塩（２水塩）を得た。
心分離して不溶性物質を除去し、得られた上清液１、Ｏ
ｌを強酸性イオン交換樹脂〔アンバーライトＩＲ−１２
０．Ｈ型〕カラムに通し、Ｌ−リジンを吸着させた。次
いで３チアンモニア水で溶出し、溶出液を減圧下濃縮し
、塩酸を加えた後、冷却・晶析し、それぞれ２４ｇ、４
７ｇのし一リジン塩酸塩（２水塩）を得た。
出 願 人 味の素株式会社
（１４）
Claims (1)
- ブレビバクテリウム属に属し、ピルビン酸キナーゼ活性
及び、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が低下し、かつ
Ｌ ＋ ＩＪレジン産能を有する変異株を液体培地中で
培養し、培養液中に生成蓄積した、Ｌ−リジンを採取す
ることを特徴とする発酵法によるＬ−リジンの製造方法
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2557684A JPS60168393A (ja) | 1984-02-14 | 1984-02-14 | 発酵法によるｌ−リジンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2557684A JPS60168393A (ja) | 1984-02-14 | 1984-02-14 | 発酵法によるｌ−リジンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60168393A true JPS60168393A (ja) | 1985-08-31 |
| JPH0369518B2 JPH0369518B2 (ja) | 1991-11-01 |
Family
ID=12169751
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2557684A Granted JPS60168393A (ja) | 1984-02-14 | 1984-02-14 | 発酵法によるｌ−リジンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60168393A (ja) |
-
1984
- 1984-02-14 JP JP2557684A patent/JPS60168393A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0369518B2 (ja) | 1991-11-01 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |