JPH0555115B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔発明の目的〕 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は発酵法によるＬ−スレオニン（以下、
スレオニンと記す）の製造法に関する。スレオニ
ンは飼料用、医薬品用に利用される重要なアミノ
酸である。従来、発酵法によるスレオニンの製造
法としては、ブレビバクテリウム属細菌のスレオ
ニンアナログに耐性を有する変異株を使用する方
法（Agric.Biol.Chem.，34(3)448〜456（1970）、特
公昭45−26708）が知られている。 ＜本発明が解決しようとする問題点＞ 本発明が解決しようとする問題点は更に安価に
スレオニンを製造することにある。 〔発明の構成〕 ＜問題点を解決するための手段＞ 本発明者等は発酵法により更に安価にスレオニ
ンを製造する方法を開発すべく研究を行つた結
果、ブレビバクテリウム属細菌にスレオニン生産
能とともにピルビン酸キナーゼ活性の低下または
欠失という性質を併せ持たせたところ、親株であ
るピルビン酸キナーゼ活性の低下または欠失して
いないスレオニン生産菌よりも更に大量にスレオ
ニンを生産することを見い出した。この発明はこ
の知見に基づいて更に研究の結果完成されたもの
である。 本発明のスレオニン製造法において用いられる
微生物は、ブレビバクテリウム属に属し、ピルビ
ン酸キナーゼ活性が低下または欠失していてかつ
スレオニン生産能に必要な性質、例えばスレオニ
ンアナログの一種であるα−アミノ−β−ヒドロ
キシ吉草酸（以下、AHVと記す）耐性を有する
変異株である。それらの性質の他に更にＬ−リジ
ン要求性、Ｌ−メチオニン要求性、Ｌ−イソロイ
シン要求性、他のスレオニンアナログ耐性などを
付与すると生産性を更に向上させることができ
る。 本発明の変異株の親株は、いわゆるＬ−グルタ
ミン酸生産菌として知られているブレビバクテリ
ウム属の微生物であり、例えば次のような菌株を
あげることができる。 ブレビバクテリウム フラバムATCC14067 ブレビバクテリウム デイバリカタム
ATCC14020 ブレビバクテリウム ラクトフアーメンタム
ATCC13869 ブレビバクテリウム ロゼウムATCC13825 本発明で用いる変異株はこれら上述の菌株を親
株として変異操作を施して、スレオニン生産能及
びピルビン酸キナーゼ活性の低下または欠失を付
与することによつて得られる。なお変異操作は通
常の方法、例えば紫外線照射或いはＮ−メチル−
N′−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジン（以下、NG
と略す）、亜硝酸等の化学薬剤処理によつて行う
ことができる。 なおピルビン酸キナーゼ活性の低下または欠失
した変異株は親株を変異処理し、変異処理した菌
体のうちグルコース最少寒天培地には親株同様に
生育するが、リボース最少寒天培地には生育しな
いか生育の遅い菌株で、リボース最少寒天培地に
さらにピルビン酸ナトリウム５ｇ／を添加して
培地に生育する菌株を選択し、これらの株のピル
ビン酸キナーゼ活性を測定することによつて効率
よく分離できる（特願昭61−49298）。 以下に本発明の使用菌株の一例ブレビバクテリ
ウムフラバムAJ12292（FERM Ｐ−8724）の具体
的誘導方法を示す。即ちブレビバクテリウムフラ
バムATCC14067からAHV耐性として誘導され
たスレオニン生産菌AJ12291（FERM Ｐ−8723）
（Agric.Biol.Chem.，34(3)448〜456（1970））を親
株として、これからピルビン酸キナーゼ活性欠失
株を誘導した。ブレビバクテリウムフラバム
AJ12291を1000μｇ／mlのNGで30℃15分間処理
した（生残率12.6％）。ついで第一表に示す完全
寒天平板培地に平板あたりのコロニー数が約500
コロニーとなるように稀釈して接種し、30℃で４
日間培養した。出現したコロニーをレプリカ法で
第二表に示したグルコース最少寒天平板培地およ
びリボース最少寒天平板培地に接種し、30℃で24
時間培養した。両平板上での生育を比較して、グ
ルコース培地には親株並に生育するが、リボース
培地には生育しないか生育の遅い株を釣り上げ、
このうちリボース培地での生育がリボース最少寒
天平板培地にさらにピルビン酸ナトリウム５ｇ／
を添加することによつて回復する株を選択し
た。これらの株についてピルビン酸キナーゼ活性
を測定することにより、ピルビン酸キナーゼ活性
を欠失した株を得、その中からスレオニン生産能
のすぐれた変異株AJ12292（FERM Ｐ−8724）を
分離した。実施例に示すように、この変異株はピ
ルビン酸キナーゼ活性を有する親株AJ12291
（FERM Ｐ−8723）よりもスレオニンを15％多
く生産した。 次にこの操作によつて得られた変異株AJ12292
のピルビン酸キナーゼ活性を測定し、親株
AJ12291と比較した結果を第三表に示した。 なお、ピルビン酸キナーゼ活性は次のように測
定した。第四表に表した組成の培地を500ml容振
盪フラスコに50ml宛分注し、加熱滅菌した。これ
にあらかじめ第一表に示した寒天平板培地で30
℃、24時間培養した菌体を１白金耳接種し、30℃
で１日間培養後集菌し、0.2％塩化カリウム溶液
で洗浄後0.1Mリン酸カリウム緩衝液（PH7.5）に
懸濁した。これにセチルトリメチルアンモニウム
ブロマイド（CTAB）を最終濃度が0.6mMにな
るように添加し、37℃で10分間保持後氷冷し、遠
心分離により集菌した後菌体を0.1Mトリス塩酸
緩衝液（PH7.5）に懸濁してCTAB処理菌体を得
た。第五表の組成の酵素反応液を30℃で10分間保
持後氷冷し、遠心上清中の生成ピルビン酸を定量
した。上清に0.1Mトリス塩酸緩衝液PH7.5、
0.15mM NADH₂（いずれも最終濃度）を加え、
さらに3.3μｇ／mlの濃度になるように乳酸脱水素
酵素を加えたときの340nmにおける吸光度変化を
測定して、生成ピルビン酸量の相対値を得た。こ
れを親株を100として表示し、ピルビン酸キナー
ゼ活性の相対値とした。 第三表に示すように、AJ12292はピルビン酸キ
ナーゼ活性が欠失していることが確認された。 スレオニン生産用の培養培地は特に制限すると
ころはなく、炭素源、窒素源、無機塩及び必要な
らば有機微量栄養素を含有する通常の培地であ
る。炭素源としては炭水化物（グルコース、フラ
クトース或いはデンプン、セルロース等の加水分
解物、糖蜜等）、有機酸（酢酸、クエン酸等）、ア
ルコール（グリセリン、エタノール等）、或いは
炭化水素（ノルマルパラフイン等）が使用でき
る。窒素源としては硫酸アンモニウム、尿素、硝
酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、アンモニアガス、その他を、無機塩と
してはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム
塩、鉄塩、マンガン塩、その他微量金属塩等を必
要に応じて使用する。有機微量栄養素としては、
栄養要求性のある場合には該当するアミノ酸、ビ
タミン、脂肪酸類、有機塩基物質等を適量添加
し、必要に応じて更に生育促進物質としてアミノ
酸、ビタミン、味液（登録商標、大豆加水分解
物）、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸等が使
用できる。 培養条件は通常の方法でPH５ないし９、温度は
20ないし40℃で好気的条件下に24ないし72時間培
養すれば良い。培養中にPHが下がる場合には炭酸
カルシウムを別殺菌して加えるか又はアンモニア
水、アンモニアガス等のアルカリで中和する。又
有機酸を炭素源とする場合はPHの上昇を鉱酸又は
有機酸で中和する。 スレオニンの単離採取は常法によつて行いう
る。得られたものは薄層クロマトグラム上のR_f
値及び微生物定量法による生物活性値により、ス
レオニン標品のそれらと一致することを確めスレ
オニンと同定した。スレオニンの定量はロイコノ
ストツクメセンテロイズ（ATCC8042）を用いる
微生物定量法に従つて行つた。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 第六表に示した組成のスレオニン生産用培地20
mlを500ml容振盪フラスコに分注し加熱滅菌した。
これにあらかじめ第一表に示した寒天平板培地で
30℃24時間培養した第三表に示した微生物をそれ
ぞれ１白金耳接種し、30℃で72時間振盪培養し
た。それぞれの培養液中のスレオニン生成量は第
三表の如くであつた。

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Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ブレビバクテリウム属に属し、ピルビン酸キ
   ナーゼ活性が低下または欠失し、かつＬ−スレオ
   ニン生産能を有する微生物を液体培地に好気的に
   培養し、培養液中にＬ−スレオニンを生成蓄積せ
   しめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレ
   オニンの製造法。