JPS62239996A - 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 〈産業上の利用分野７〉 本発明は発酵法によるし一スレオニン（以下、スレオニ
ンと記す）の実情法に関する。スレオニンは飼料用、医
薬品用例利用される重要なアミノ酸である。従来、発酵
法によるスレオニンの製造法としては、ブレビバクテリ
ウム属細菌のスレオニンアナログに耐性を有する変異株
を使用する方欽仁（＾ｔｐｖ−Ｉｎ、　　Ｔｌ＋ｎ＋　
、　　１”ｈａｍ、、　　ＱＡ（’１）４４只、４１’
；ｇ／　Ｉ　Ｑ７ｎ　　）−特公昭４５−２６７０８　
）が知られている。

〈本発明が解決しようとする問題点〉 本発明が解決しようとする問題点は更に安価にスレオニ
ンを製造することにある。

〔発明の構成〕

く問題点を解決するための手段〉 本発明者等は発酵法により更に安価にスレオニンを製造
する方法を開発すべく研究を行った結果、ブレビバクテ
リウム属細菌にスレオニン生産能とともにピルビン酸キ
ナーゼ活性の低下または欠失という性質を併せ持たせた
ところ、親株であるピルビン酸キナーゼ活性の低下また
は欠失していなイスレオニン生産菌よりも更に大量にス
レオニンを生産することを見い出した。この発明はこの
知見に基づいて更に研究の結果完成されたものである。

本発明のスレオニン製造法において用いられる微生物は
、ブレビバクテリウム属に属し、ピルビン酸キナーゼ活
性が低下または欠失して―てかつスレオニン生産能に必
要な性質、例えばスレオニンアナログの一種であるα−
アミノ−β−ヒドロキシ吉草醗（以下、Ａ石と記す）耐
性を有する変異株である。それらの性質の他に更にＬ−
リジン要求性、Ｌ−メチオニン要求性、Ｌ−イソロイシ
ン要求性、他のスレオニンアナログ耐性などを付与する
と生産能を更に向上させることができる。

本発明の変異株の親株は、いわゆるＬ−グルタミン酸生
産菌として知られて−るブレビ・ぐクテリウム属の微生
物であり、例えば次のような璽株をあげることができる
。

ブレピノ櫂りテリウム　フラバム　ＡＴＣＣ１４０６７
プレビパクテリウム　ディパリカタム　ＡＴＣＣ１４０
２０ブレビバクテリウム　ラクトファーメンタムＡＴＣ
Ｃ１３８６９ブレビバクテリウム　ロゼラム　ＡＴＣＣ
１３８２５本発明で用いる変異株はこれら上述の菌株を
親株として変異操作を施して、スレオニン生産能及びピ
ルビン酸キナーゼ活性の低下または欠失を付与すること
によって得られる。なお変異操作は通常の方法、例えば
紫外線照射或いはＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二ト
ロアｊ７ニシン（以下、ＮＧト略す〕、亜硝酸等の化学
薬剤処理によって行うことができる。

なおピルビン酸キナーゼ活性の低下または欠失した変異
株は親株を変異処理し、変異処理した菌体のうちグルコ
ース最少寒天培地には親株同様に生育するが、ＩＪ　、
％”−ス最少寒天培地には生育しないか生育の遅い菌株
で、す？−ス最少寒天培地にさらにピルビン酸ナトリウ
ム５１／ｌを添加した培地に生育する菌株を選択し、こ
れらの株のピルビン酸キナーゼ活性を測定することによ
って効率よく分離できる（４？願昭６１−４９２９８　
）。

以下に本発明の使用菌株の一例プレビパクテリウムフラ
パムＡ　Ｊ　１２２９２　（ＦＥＲＭ　Ｐ　−８７２４
）の具体的誘導方法を示す。即ちブレビバクテリウムフ
ラバムＡＴＣＣ１４０６７からＡＨ’Ｖ耐性として誘導
されたスレオニン生産菌ＡＪ１２２９１（Ｆ’ＥＲＭＰ
−８７２３）（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｓｍ、
、　３４（３）４４８〜４５６（１９７０））を親株と
して、これからピルビン酸キナーゼ活性欠失株を誘導し
た。ブレビバクテリウムフラバムＡＪ１２２９１ｔ−１
０００μに家のＮＧで３０℃１５分間処理した（生残率
１２．６４）。ついで第−表に示す完全寒天平板培地に
平板あたりのコロニー数が２　約５００コロニーとなる
ように稀釈して接種し、３０℃で４日間培養した。出現
したコロニーをレプリカ法で第二表に示したグルコース
最少寒天平板培地およびり♂−ス最少寒天平板培地に接
種し、３０℃で２４時間培養した。測子板上での生育を
比較して、グルコース培地【は親株並に生育するが、リ
バース培地知は生育しないか生育の遅い株を釣り上げ、
このうちＩＪ　、ｆ−ス培地での生育がリデース最少寒
天平板培地にさらにピルビン酸ナトリウム５１／ｌを添
加することによって回復する株を選択した。これらの株
についてピルビン酸キナーゼ活性を測定することにより
、ピルビン酸キナーゼ活性を欠失した株を得、その中か
らスレオニン生産能のすぐれ念変異株ＡＪ１２２９２（
ＦＥＲＭＰ−８７２４）を分離した。実施例に示すよう
に、この変異株はピルビン酸キナーゼ活性を有する親株
ＡＪ１２２９１（ＦＥＲＭＰ−８７２３）よりもスレオ
ニンを１５憾多（＃、意１．た７ 次にこの操作によって得られた変異株ＡＪ１２２９２の
ピルビン酸キナーゼ活性を測定し、親株ＡＪ１２２９１
と比較した結果を第三表に示した。

なお、ピルビン酸キナーゼ活性は次のように測定した。

第四表に表し光組成の培地を５００ｄ容振盪フラスコに
５ＱｍＪ宛分注し、加熱滅菌した。

これにあらかじめ第−表に示した寒天平板培地で３０℃
、２４時間培養した菌体を１白金耳接種し、３０℃で１
日間培養後集菌し、０．２幅塩化カリウム溶液で洗浄後
０．１　Ｍ　ＩＪン酸カリウム緩衝液（Ｐ［（７，５〕
に懸濁した。これにセチルトリメチルアンモニウムブロ
マイド（ＣＴＡＢ　）を最終濃度が０．６　ｒｎＭにな
るように添加し、３７℃で１０分間保持後氷冷し、遠心
分離により集菌した後菌体を０．１　Ｍ　）リス塩酸緩
衝液（ｐ）１７．５）に懸濁してＣＴＡＢ処理菌体を得
た。第五表の組成の酵素反応液を３０℃で１０分間保持
後氷冷し、遠心上清中の生成ピルビン酸を定量した。上
清に０．１　Ｍ　）　＋Ｊス塩酸緩衝液ｐＩ（７−５，
０，１５ｒｎＭ　ＮＡＤＨ２（いずれも最終濃度）を加
え、さらに３．３μＩ／ｍｌの濃度になるように乳酸脱
水素酵素を加えたときの３４０ｎｍＫおける吸光度変化
を測定して、生成ピルビン酸量の相対値を得た。これを
親株を１００として表示し、ピルビン僚キナーゼ活性の
相対値とした。

第三表に示すように、ＡＪ１２２９２はピルビン酸キナ
ーゼ活性が欠失していることが確認された。

スレオニン生産用の培養培地は特に制限するところはな
く、炭素源、窒素源、無機塩及び必要ならば有機微量栄
養素を含有する通常の培地である。

炭素源としては炭水化物（グルコース、フラクトース或
いはデンプン、セルロース等の加水分解物。

糖蜜等〕、有機酸（酢酸、クエン酸等）、アルコール（
グリセリン、エタノール等〕、或いは炭化水素（ノルマ
ルパラフィン等〕が使用できる。窒素源としては硫酸ア
ンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、アンモニアがス、その他を、
無機塩としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム
塩、鉄塩。

マンガン塩、その他微看金属塩等を必要に応じて使用す
る。有機微量栄養素としては、栄養要求性のある場合に
は該当するアミノ醒、ビタミン、脂肪酸類、有機塩基物
質等を適量添加し、必要に応じて更に生育促進物質とし
てアミノ酸、ビタミン。

味液〔登録商標、大豆加水分解物〕、醪母エキス。

ペプトン、カブミノ酸等が使用できる。

培養条件は通常の方法でｐＨ５ないし９．温度は２０な
いし４０℃で好気的条件下に２４ないし７２時間培養す
れば良い。培養中に−が下がる場合には炭醸カルシウム
を別殺菌して加えるか又はアンモニア水、アンモニアガ
ス等のアルカリで中和する。又有機酸を炭素源とする場
合は−の上昇を鉱酸又は有機酸で中和する。

スレオニンの単離採取は常法によって行いうる。

得られたものは薄層クロマトグラム上のＲｆ値及び微生
物定量法による生物活性値により、スレオニン標品のそ
れらと一致することを確めスレオニン生産用した。スレ
オニンの定量はロイコノストックメセンテロイデス（Ａ
ＴＣＣ８０４２）を用いる微生物定量法に従って行った
・ 以下、実施例にて説明する。

実施例１ 第六表に示した組成のスレオニン生産用培地２０ｄを５
００ゴ容振盪フラスコに分注し加熱滅菌した。これにあ
らかじめ第−表に示した寒天平板培地で３０℃２４時間
培養した第三表に示した微生物をそれぞれ１白金耳接種
し、３０℃で７２時間振盪培養した。それぞれの培養液
中のスレオニン生成毫は第三表の如くであった。

第−表　　完全培地組成 ポリペグトン　　　１０１１／１ 酵母エキス　　１０〃 ＮａＣｌ２　ＩＩ グルコース　　　５　〃 寒天　　　　２０　〃 ｐｌ（７，０（ＮａＯＨ） 第二表　　最少培地組成 グルコースまたはり？−ス　　　２０　１／１硫酸アン
モニウム　　　１０　〃 尿　　素　　　　　　　　　　　　　　３　　　〃ＫＨ
２ＰＯ４１／’ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，４／／ ＮａＣＬ　　　　　　Ｏ，５／’ Ｆ６ＳＯ４−７Ｈ２Ｏ１０ｍ９／ｌ Ｍｎ５Ｏ４・４　Ｋ２Ｏ８，１’ ピオチン　　　　　　　５０μｍ１／１チアミン塩酸塩
　　　　　２００　　〃ｐ１．ｏ　　（ＫＯＨ） 第三衣　　ピルビン酸キナーゼ活性と スレオニン生成号 Ａ　Ｊ　１２２９１（親株）　　　１００　　　　　９
．３７Ａ　Ｊ　１２２９２　（変異株）　　　　　０　
　　　　１０．８０第四表　　ピルビン酸キナーゼ測定
用菌体集菌用培地組成 ？リペグトン　　２０１１／１ 酵母エキス　　２０１ ＮａＣＬ　　　　　　５　ｓ グルコース　　２０〃 ｐｌ（７，０（ＮａＯＨ） 第五衣　　ピルビン酸キナーゼ測定用反応液組成トリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　　　１００　　ｍＭＭｎ
Ｓ０４３．３　　ｔｔ アゾノン／−５′−ニリンｉ￥！　　　　　　　　　１
．０　　／／ホスホエノールピルビン酸　　　　　　　
　２．０〃ＣＴＡＢ処理菌体懸濁液　　　　　　　　　
０．１５ｍｌ／ｍｌ第六表　　スレオニン生産用培地組
成 グルコース　　　　　　　１００　１／１硫女アンモニ
ウム　　　　３０　〃 ＫＨ２ＰＯ４１，５＃ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，４／’ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０１０ｍｌｉ／ｌ ＭｎＳＯ４’　４　Ｈ２Ｏ８，１ｇ ビオチン　　　　　　　２００μｍ／／１チアミン塩酸
塩　　　　　　３００μｍ１／１「味液」　　　　　　
　　　　　　４　ゴ／ｌ炭酸カルシウム（別殺菌）５０
９／１ ｐｉ−１７，２（ＫＯｆ（）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ブレビバクテリウム属に属し、ピルビン酸キナーゼ活性
   が低下または欠失し、かつＬ−スレオニン生産能を有す
   る微生物を液体培地に好気的に培養し、培養液中にＬ−
   スレオニンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特
   徴とするＬ−スレオニンの製造法。