JPS594994B2 - 発酵法によるｌ−メチオニンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は発酵法によるＬ−メチオニンの製造法に関し
、詳しくは、メタノールを炭素源とする発酵法によるＬ
−メチオニンの製造法に関する。

メタノールを炭素源とする発酵法によるし一メチオニン
の製造法については、プロタミノバクタ−属、シュード
モナス属およびアクロモバクタ−属のエチオニンに耐性
を有する変異株がＬ−メチオニンを生産することが知ら
れている（特開昭５Ｏ−３１０９２）。

本発明者らは、メチロモナス属に属し、エチオニオンお
よびα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸に耐性を有する
変異株が、メタノールを炭素源としてより高い効率でＬ
−メチオニンを生産することを見い出した。

即ちこの発明は、メチロモナス （Ｍｅｔｈｙｌ ｏｍｏｎａｓ ） 属に属し、エチオ
ニンおよびα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸に耐性を
有し、Ｌ−メチオニン生産能を有する変異株を、炭素源
としてメタノールを使用して培養し、培地中に生成、蓄
積されたし一メチオニンを採取することを特徴とする発
酵法によるし一メチオニンの製造法である。

本発明において使用される変異株は、上に述べたように
、メチロモナス属に属し、エチオニンおよびα−アミノ
−β−ヒドロキシ吉草酸ｔこ耐性を有する変異株である
。

このような変異株は、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジンに接触せしめる等の通常の変異方法
により得られる。

変異処理後、エチオニンおよびα−アミノ−β−ヒドロ
キシ吉草酸に耐性を有する変異株を選別する方法は、そ
の親株が生育できないような量のエチオニン又はα−ア
ミノ−β−ヒドロキシ吉草酸を含有する培地中又は培地
上に生育できるような変異株を分離すればよい。

本発明の変異株を具体的に例示すれば、以下のものがあ
る。

メチロモナス・チオメドゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎ
ａｓ ｔｈｉｏｍｅｄｏｇｅｎｅｓ） ＯＥＡ ９（Ａ
Ｊ１１６２７）（ＦＥＲＭ−Ｐ５７２１）（エチオニン
耐性、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性） 上記例示の変異株は、野性株ＯＭ３３ （ＡＪｌ １６
２５ ） （ＦＥＲＭ−Ｐ ５７１９ ）を親株として
変異誘導されたものである。

０Ｍ３３は新菌種であり、その菌学的性質は以下のとお
りである。

０Ｍ３３の菌学的性質 （ａ） 形態 １）細胞の形および大きさ： 桿菌０．３〜０．５ Ｘ Ｏ，６〜２．５μ２）細胞の
多形性の有無；なし。

３）運動性の有無：あり、極鞭毛。

４）胞子の有無：なし。

５）ダラムの染色性、陰性。

６）抗酸性：陰性。

（ｂ） 各培地における生育状態 １）肉汁寒天平板培養（メタノール１．０チ入）＝１〜
２１ｆｔ７ｒＬ、円形、凸円状、金縁、円滑、半透明〜
不透明、混光、バタ一様光沢、均質、黄味臼〜うす黄色
。

２）肉汁寒天斜面培養（メタノール１．０％人）：中程
度の生育、薄膜状、糸状、うす黄色〜うす茶色。

３）肉汁液体培養（メタノール１．０係人）：均一に濁
る、わずかに粉状沈澱がある、表面に膜は形成しない。

４）肉汁ゼラチン穿刺培養：液化しない。

５）リドマス・ミルク：変化なし。

６）その他：メタノールを含有しない肉汁培地では生育
しない。

（ｃ）生理学的性質 １）硝酸塩の還元：弱く還元する。

２）脱窒反応：陰性。

３）ＭＲテスト：陰性。

４）ＶＰテスト：陰性。

５）インドールの生成：陰性。

６）硫化水素の生成：陰性。

７）デンプンの加水分解：陰性。

８）クエン酸の利用： Ｋｏｓｅｒ培地で利用しない。

Ｃｈｒ １ｓｔｅｎｓｅｎ培地で利用しない。

９）無機窒素源の利用： 硝酸塩を利用する。

アンモニウム塩を利用する。

１０）色素の生成：生成しない。

１１）ウレアーゼ：陰性。

１２）オキシダーゼ：陽性。

１３）カタラーゼ：陽性。

１４）生育の範囲： 温度 ３０℃で生育するが３７℃で生育しない。

ｐＨ６〜９゜ １５）酸素に対する態度：好気性。

１６）０−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ ＆ Ｌｅｉｆｓｏｎ法
による）： 酸を生成しない。

１７）糖類から酸およびガスの生成の有無：酸の生成
ガスの生成 Ｌ−アラビノース −− Ｄ−キシロース −− Ｄ−グルコース −− Ｄ−マンノース −− Ｄ−フラクトース −− 麦芽糖 −− ショ糖 −− 乳糖 −− トレハロース −− Ｄ−ソルビット −− Ｄ−マンニット −− イノジット −− グリセリン −− デンプン −− ラフィノース −− アトニット −− サリシン −− ズルシット −− ラムノース − １８）マロン酸の利用： （Ｅｗｉｎｇ ｅｔ ａｌ、の方法） １９）フェニルアラニンのデアミナーゼ反応：陰性（Ｅ
ｗｉｎｇ ｅｔ ａｌ 、の方法）２０デ力ルボキシラ
ーゼ反応： （ＭΦ１１ｅｒ−の方法） リジン：陰性 オルニチン：陰性 アルギニン：陰性 ２１）アルギニンジヒドロラーゼ反応： 陰性（５ｔａｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ 、の方法）２２）
Ｐｏｌｙ−β−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｃの蓄積
の有無： 蓄積しない。

２３）下記の化合物の資化性（５ｔａｎｉｅｒの培地に
よる） Ｄ−グルコース −メサコン酸 −トレ
ハロース −エリスリトール −２−ケ
ト−ブレコン酸 −２，３−フ゛チレフグリコ→レーメ
ソーイノシット −メタ−安息香酸 −Ｌ
→マリン −ノラー安息香酸 −β−アラ
ニン −トリプタミンＤＬ−７’／喀ン
−α−アミルアミンベタイン −Ｄ
Ｌ−乳酸 り乳酸クーアラビノース −トフラクトースサツカロー
ス −マロン酸 プロピオン酸 −テストステロン酪 酸
−セロビオース ア、ユツト −ＤＬ−β−・イド口
−オキシブチレート プロピレングリコ→し −Ｌ−ヒスチジン
−エタノ→し −パントテン酸
−Ｄ−キシロース −酢 酸
−Ｄ−リボース −コハク酸
−Ｌ−ラムノース −クエン酸
−ホリソル喝−ト８０ −Ｌ−オル
ニチン −レブリン酸 −５−
ケトーク’／ｌ／：Ｉン酸 −シトラコン酸
−Ｌ−リジン −メソ−酒石酸 −Ｌ
−アラニン −Ｄ（−）−酒石酸 −ズルシ
ット −ソルビトール −メタノール
＆メチルアミン ＋ジメチルアミン、エタノールアミン
、ギ酸、トリメチルアミン、ジエチルアミン、エチルア
ミン、ホルムアミドおよびホルムアルデヒド、グリセロ
ール、ピルビン酸、ラクトースは資化しない。

２４）ＤＮＡのＧＣ含有量：５１．６％（Ｔｍ法）。

２５） ３−へキュスロース・フォスフェートシンター
ゼ活性を有する。

２６）ハイドロキシピルベート・レダクターゼ活性を有
さない。

０Ｍ３３の固定 ０Ｍ３３はグラム陰性で極鞭毛を有する運動性の桿菌で
、メタノール、モノメチルアミンのみを炭素源として資
化できるが、その他の炭素源は資化できない。

メタノールの資化経路としてリブロースモリノン酸経路
を利用し、セリン経路は利用しない。

ｒＢＥＲＧＥＹＳＭＡＮＵＡＬＯＦＤＥＴＥＲＭＩ−Ｎ
ＡＴＩＶＥ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹＪ第８版によれ
ば、本菌株はメチロモナス属に属する。

同文献に記載されたメチロモナス属に属する菌株は、い
ずれもメタンを炭素源として利用できるが、本菌株は利
用できない点が大きく異なっている。

一方、同文献には記載されていないが、近年メチロモナ
ス属に属すると同定された微生物としてメチロモナス・
メタノロボランス（大野、浜田、高田、熱井、Ｊ 、
Ｆｅｒｍｅｎｔ 、 Ｔｅｃｈｎｏｌ 、 ５５ 。

２９５（１９７７））、メチロモナス・アミノファシェ
ンス（賭方、和泉、河盛、浅野、谷、Ｊ。

Ｆｅｒｍｅｎｔ 、 Ｔｅｃｈｎｏｌ 、 、 ５５、
４４４（１９７７））、メチルモナス・メタノロフイラ
（銘木、キューン、ベルグルンド、ウンデン、ベデン、
Ｊ 、 Ｆｅｒｍｅｎｔ 、 Ｔｅｃｈｎｏｌ 、 ５
５、４５９（１９７７））、メチロモナス・メチロポー
ラ（河野、沖、封材、尼崎、Ｊ 、 Ｇｅｎ 、 Ａｐ
ｐｌ 。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 、 、ユ９，１１（１９７３））
、メチロモナス・サラシカ（白木らＪ 、 Ｆｅｒｍｅ
ｎｔ 。

Ｔｅｃｈｎｏｌ 、 、 ５８、９９ （１９８０）
）、メチロモナス・クララ（ホーンローゼルら、 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ 、 Ａｐｐｌ ｉｅｄ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ ａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 、
６、１６７ （１９７８） ）、メチロモナスＭ１５
（ザーム、ワグナ− Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ 、 Ａｐｐｌ ｉｅｄ 、 Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ。

２．１４７（１９７５））が知られているが、本菌株は
これらいずれの菌株とも性質を異にしている。

即ち、メチロモナス・メタノロボランスは、水溶性色素
を生成すること、メチルアミンの資化性がない点が本菌
株と異なっている。

メチロモナス・アミノファシェンスは、アセトインの生
成（ＶＰテスト）がみられること、３７℃で生育するこ
と、ポリベータハイドロキシ酪酸の蓄積がみられること
、メチルアミンの資化性がないことが本菌株と異なり、
メチロモナス・メタノロフイラとは、アセトインの生成
がみられること、３７℃で生育すること、メチルアミン
の資化性がないことが本菌株と異なっている。

さらに、メチロモナス・メチロポーラは、メチルアミン
の資化性がないこと、メチロモナス・サラシカは生育に
ＮａＣｌおよびビタミンＢ１□を要求すること、３７℃
で生育すること、ＧＣ含量が４３．８−４７．３％と低
い点、ホルムアルデヒドの資化性を有することなどが異
なっている。

またメチロモナス・クララは、メタンの資化性を有する
こと、モノメチルアミンの資化性を有さないこと、３７
℃で生育すること、ＧＣ含量が低いことなどが、メチロ
モナスＭ１５は４２℃でも生育すること、メチルアミン
の資化性がない点などが本菌株とは異なっている。

以上の結果により本菌をメチロモナス属に属する新菌種
と固定し、メチロモナス・チオメドゲネスと命名した。

このような変異株を培養する培地としては、メタノール
炭素源として含有するほかは、通常の培地が使用できる
。

即ち、炭素源としてメタノール窒素源、無機イオンおよ
び必要によりアミノ酸、有機酸等の有機微量栄養素を含
有するものである窒素源としては、アンモニアガス、ア
ンモニア水アンモニウム塩、硝酸、硝酸塩等が好ましい
。

有機微量栄養素としてビタミンＢ１２を使用すれば、よ
りよい結果が得られる。

又、金儲無機、又は有機化合物を培地に添加すれば、よ
り望ましい結果が得られる場合が多い。

メタノールは、培地中の濃度があまり高くならないよう
、遂次補給添加するのが好ましい。

培養は好気的条件下で行うのが好ましく、培養の間ｐＨ
を５ないし８に調節し、温度を２５ないし３５℃とすれ
ば、より好ましい結果が得られる。

かくして２ないし５日間も培養すれば、培地中に著量の
Ｌ−メチオニンが蓄積される。

培養液よりＬ−メチオニンを採取する方法としては、イ
オン交換樹脂を用いる方法等の通常の方法が適用できる
。

実施例 １ １ 変異株の誘導 メチロモナス・チオメドゲネス０Ｍ３３の菌体を、２５
０ｐｇ／ｒｔｔｌのＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジンを含有する０、１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ
７，０）にけん濁し、３０℃に１５分間保った。

エチオニン耐性を獲得した変異株を分別し、これより最
もＬ−メチオニンの生産性の高い変異株ＯＥＩ ２０（
ＡＪ １１６２６）（ＦＥＲＭ−Ｐ ５７２０ ）を得
た。

０Ｅ１２０を、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジンを用いて上記と同様に変異処理し、更にα−
アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性も獲得した変異株を
得た。

これより、最もＬ−メチオニンの生産性の高い変異株０
ＥＡ９を得た。

２０ＥＡ９の薬剤耐性度 １１当り、メタノール１０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４３，
Ｏｇ、に２ＨＰ０．２、Ｏｇ、 ＮａＣＡ１．０＆ 、
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２ｇ、ビタミン混合液１０１
１Ｌｌを含み、更にＬ−エチオニン又はＤＬ−α−アミ
ノ−β−ヒドロキシ吉草酸を第１表に示す量添加した培
地を調製し、このｐＨを７．０に調節した培地の４ゴを
試験管に入れ加熱殺菌した。

これに第１表に示す試験菌株を接種し、２８℃にて２！
Ｌ時間、振とうしつつ培養した。

培養後、培養液の６１０ｎｍにおける吸光度を測定して
生育度とした。

結果を第１表に示す。３ Ｌ−メチオニン生産試験 ５００ｒＩＬｌ容振盪フラスコに純水１１当り（ＮＨ４
）２ＳＯ４５，１，に２ＨＰＯ４４，１゜Ｍｇ５０４−
７Ｈ２００，２ｇ、ＮａＣｌ ｌ、Ｏｇ、ＦｅＣｌ３・
６Ｈ２０１０ｍ１！、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２０２，０ｒｎ
９および酵母エキス２．０ｇをそれぞれ含有し、ｐＨを
Ｈ２ＳＯ４にて７．０に調節した生産培地５０１１Ｌｌ
を仕込んだ。

これを１２１℃にて１０分間殺菌後、別途殺菌したメタ
ノールを最終濃度として１０ ｇ／ｌとなるように添加
した。

これに上記と同組成の培地４罰を含む試験管を用いて２
８℃にて２４時間培養した第２表に示す菌株を接種し、
２８℃で振盪培養を行なった。

培養２４時間後、別途殺菌したメタノールおよびＣａ
ＣＯ３を最終濃度としていずれも２０ ｊ９／１３とな
るように添加した。

さらに培養４８時間後メタノールを２０ ｇ／ｌとなる
ように添加して培養を続けた。

培養９０時間後に培養液中に生成蓄積されたし一メチオ
ニンを測定した。

結果は第２表に示す通りである。

（Ｌ−メチオニン蓄積量は培地中に既に含有しているＬ
−メチオニン量を差引いた値を示しており、以下の実症
例においても同様である。

）実姉例 ２ 実姉例１に示した生差培地に第３表に示す量のビタミン
Ｂ１□を添加し、実施例１に示した方法によりメチロモ
ナス・チオメドゲネス０ＥＡ９を培養した。

９０時間培養したところ、第３表に示すようにＬ−メチ
オニンが蓄積した。

実施例 ３ 実姉例１に示した生産培地に第４表に足置の含硫黄化合
物を含有せしめ、実症例１に示した方法によりメチロモ
ナス・チオメドゲネス０ＥＡ９を培養した。

９０時間培養したところ、第４表に示すようにＬ−メチ
オニンが蓄積した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ） Ｆ
   Ｅに属し、エチオニンおよびα−アミノ−β−ヒドロキ
   シ吉草酸に耐性を有し、Ｌ−メチオニン生産能を有する
   変異株を、炭素源としてメタノールを使用して培養し、
   培地中に生成、蓄積されたＬ−メチオニンを採取するこ
   とを特徴とする発酵法によるＬ−メチオニンの製造法。