JPS6129718B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、フマール酸またはその塩、および、
アンモニアまたはアンモニウム塩を原料とし、ブ
レビバクテリウム属に属し、α−アミノ−ｎ−酪
酸に耐性を有する微生物の好気的培養物中の酵素
による反応を利用して、効率的にＬ−アスパラギ
ン酸を製造する方法に関する。 Ｌ−アスパラギン酸は、重要なアミノ酸の一つ
として蛋白質中にその存在が知られ、医薬や食品
添加物として用いられている。 従来、大腸菌の休止菌体から得られるアスパル
ターゼは、フマール酸およびアンモニアからＬ−
アスパラギン酸を生成する反応を司る酵素として
知られ、その後、種々の微生物を用いた醗酵培養
法により、フマール酸およびアンモニアを原料と
して、Ｌ−アスパラギン酸を生成する方法も知ら
れるようになつた。 この従来の醗酵培養法においても、微生物のア
スパルターゼを利用して、フマール酸およびアン
モニアからＬ−アスパラギン酸を得るものであ
り、従つて、強力なアスパルターゼ活性を有する
微生物を得ることが、工業的生産への重要要素と
なつているが、このような目的に合致する微生物
を自然界から分離することは多くの困難を伴な
い、工業化への障害となつていた。 ここにおいて本発明者らは鋭意研究の結果、ブ
レビバクテリウム属に属する微生物にα−アミノ
−ｎ−酪酸耐性を付与すると、アスパルターゼ活
性、すなわちフマール酸およびアンモニアからＬ
−アスパラギン酸を生合成する能力が高まること
を見いだし、ここに本発明を完成させたものであ
る。 すなわち本発明は、ブレビバクテリウム属に属
し、α−アミノ−ｎ−酪酸に耐性を有する微生物
を好気的に培養し、その培養物を用いて、フマー
ル酸またはその塩、および、アンモニアまたはア
ンモニウム塩よりＬ−アスパラギン酸を生成、採
取することを特徴とする、Ｌ−アスパラギン酸の
製造方法である。 本発明は、Ｌ−アスパラギン酸の工業的生産に
有利な菌株の育成方法の開発に成功した結果なさ
れたもので、本発明の方法に依れば安価なＬ−ア
スパラギン酸を効率よく得ることができる。 本発明で用いる微生物は、ブレビバクテリウム
属に属し、α−アミノ−ｎ−酪酸に耐性を有する
微生物であり、その耐性機構を人為的に付与させ
た微生物に限定されることなく、自然界における
偶発的変異によつてその機構を取得した微生物で
あつてもよい。 本発明に用いる代表的菌株としては、ブレビバ
クテリウム・フラバムMJ−233−AB−41（微工
研菌寄第3812号）がある。この菌株は、ブレビバ
クテリウム・フラバムMJ−233（微工研菌寄第
3068号）よりα−アミノ−ｎ−酪酸耐性株とし
て、例えば次の操作によつて誘導されたものであ
る。 紫外線照射、あるいは化学的薬剤（例えばＮ−
メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
等）処理によりブレビバクテリウム・フラバム
MJ−233に変異を誘起せしめた後、この菌懸濁液
をα−アミノ−ｎ−酪酸10mg/ml含有する平板培
地（尿素0.2％、硫安0.7％、KH₂PO₄0.05％、
K₂HPO₄0.05％、MgSO₄・7H₂O0.05％、NaCL2
mg/、CaCl₂・2H₂O2mg/、FeSO₄・7H₂Omg/
、MnSO₄×４〜6H₂O、ZnSO₄・7H₂O2mg/、
ビオチン200μｇ/、チアミン塩酸塩100μｇ/
、α−アミノ−ｎ−酪酸1.0％寒天20％、エタ
ノール３容量％〔滅菌後添加〕）に、30℃にて数
日間培養し生じた大コロニーを分離することによ
り、耐性変異株を得る。 なお、ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233
の菌学的性質と其の分類学的同定理由は次の通り
である。 菌学的性質 顕微鏡的性質 0.6〜0.8×1.0×2.4μの短桿菌、通常Ｖ字形
の対をなし、柵状も認められる。グラム陽性、
無胞子、非運動性、夾膜認められず、非抗酸
性。 培養的性質 １ 肉汁寒天コロニー 円形、表面は平滑、コロニーの隆起は扁平
もしくはやゝ隆起、コロニーの周縁はやゝ波
状、黄色、不透明、やゝ光沢あり。 ２ 肉汁寒天傾面 生育中程度、糸状、黄色。 ３ 肉 汁 生育中程度、沈渣あり、濁度なし。 ４ 肉汁寒天穿刺 表面によく生育、内部生育は僅かで糸状。 生育条件 １ 生育温度：適温30〜37℃、範囲15〜40℃ ２ 生育PH：最適PH〜７〜８、範囲５〜10 ３ 酸素要求性：好気性 ４ アンモニウム塩の利用性：あり ５ 尿素の利用性：あり ６ 硝酸塩の利用性：あり 生理学的性質その他 １ ゼラチンを液化しない。 ２ リトマスミルク変化しない。 ３ 硝酸塩の環元性：陽性 ４ インドールの生成：陰性 ５ 硫化水素の生成：陰性 ６ 澱粉の加水分解：陰性 ７ ペプトンからアンモニアの生成：陽性 ８ フオーゲスプロスカウエル反応：陰性 ９ メチルレツド試験：陽性（弱） 10 カタラーゼ：陽性 11 ウレアーゼ：陽性 12 炭水化物から酸の生産 グルコース、サツカロース、トレハロー
ス、マルトース、サリシンから酸を生成、ガ
スは生成しない。アラビノース、キシロー
ス、ラクトース、ラムノース、ラフイノー
ス、マンニツト、ズルシツト、イノシツト、
アドニツトから酸およびガスを生成しない。 13 ビタミンの要求性：ビオチンの要求性あ
り。 本菌体はグラム陽性、無胞子、非運動性、好気
性であり、かつ検鏡観察した範囲で、すべて楕円
ないし短桿形でＶ字状分裂が認められる。 また増殖経過に伴なうグラム染色の変化、態的
変化および分岐状細胞が認められない。 また、前記のブレビバクテリウム・フラバム
MJ−233−AB−41（微工研菌寄第3812号）と其
の親株であるブレビバクテリウム・フラバムMJ
−233（微工研菌寄第3068号）のα−アミノ−ｎ
−酪酸に対する相対生育度は次の表−１の如くで
ある。 なお％は重量％を示す。

【表】 親株とα−アミノ−ｎ−酪酸耐性株との耐性度
の違いは、特に限定されるものではなく、α−ア
ミノ−ｎ−酪酸に対する抵抗性が親株より向上し
ているものであれば、該耐性株に含まれるもので
ある。 本発明の培養に使用する、炭素源、窒素源、無
機塩等の培地組成は特に限定されない。 炭素源としてはエタノール、メタノール、ｎ−
パラフイン、糖蜜等、また、窒素源としてはアン
モニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
硝酸アンモニウム、尿素等を単独または混合して
用いることができる。 無機塩としては、リン酸一水素カリウム、リン
酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いら
れる。この他に菌の生育に必要であれば、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリ
カー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培
地に添加し用いる。 培養は通気撹拌、振盪等の好気的条件下で行な
い、培養温度は20〜40℃好ましくは25〜35℃で行
なう。培養途中のPHは５〜10好ましくは７〜８付
近にて行ない、培養液中のPHの調整には酸、アル
カリを添加して行なう。 α−アミノ−ｎ−酪酸の添加濃度は、0.1〜５
重量％好ましくは、１〜３重量％である。 培養開始時のエタノール濃度は１〜５容量％、
好ましくは、２〜３容量％が適する。培養期間は
２〜８日間、最適期間は４〜５日間を要する。 斯様にして得た培養物は、活性の高いアスパル
ターゼを含んでいる為、フマール酸または、その
ナトリウム塩もしくはカルシウム塩等のフマール
酸塩、および、アンモニアまたは、塩化アンモニ
ウムもしくは炭酸アンモニウム等のアンモニウム
塩から効率的にＬ−アスパラギン酸を生合成する
ことができる。 上記の培養物とは、培養液ものものの他、それ
に含まれている菌体、菌体の破壊物、磨砕物およ
び自己消化液等、培養で得られる全てのものを含
むものである。 なお、フマール酸等およびアンモニア等からＬ
−アスパラギン酸を生合成する方法は、本発明で
用いる培養物を用いる点を除けば、通常行なわれ
ている方法によつて為される。 次に本発明の実施例を示めし、本発明を更に詳
しく説明するが、本発明は、これに限定されるも
のではない。 なお、生成されたＬ−アスパラギン酸の定性
は、ペーパークロマトグラフイーにより標準品と
のRf値の比較法（一致することが前提）、また定
量は、ロイコノストツクメセンテロイデス
ATCC8042による微生物定量法を用いた。また、
生成されたＬ−アスパラギン酸の採取法は、公知
の方法、すなわち等電点沈殿法、イオン交換樹脂
クロマト等により行なつた。 実施例 １ 尿素40ｇ、硫安14.0ｇ、KH₂PO₄0.5ｇ、
K₂HPO₄0.5ｇ、MgSO₄・7H₂O0.5ｇ、FeSO₄・
7H₂O6mg、MnSO₄・４〜6H₂O6mg、酵母エキス1.
ｇ、カザミノ酸1.0、ビオチン200μｇ、チアミン
塩酸塩100μｇ、水道水１からなる培地10mlを
口径24mmの大型試験管に分注し、120℃、10分間
加圧滅菌し、無菌的にエタノール0.3mlを添加し
て前培養用培地とした。この培地にブレビバクテ
リウム・フラバムMJ−233（微工研菌寄第3068
号）とブレビバクテリウム・フラバムMJ−233−
AB−41（微工研菌寄第3812号）を各々植菌し、
30℃で２日間振盪培養を行なつた。次に、上記の
前培養用培地組成と同一なる培地50mlを500ml容
量の三角コルペンに分注し、120℃、10分間加圧
滅菌し、無菌的にエタノール1.5mlを添加して本
培養培地とし、上記前培養液1.0mlを植菌して30
℃で３日間振盪後、遠心分離（3000rpmで15分
間）にて集菌した。 一方、フマール酸10ｇを水50mlに加え、アンモ
ニア水にてPH10.0に調節後、更に水を加えて全量
を100mlとした。次に上記の集菌体を10ｇ（Wet
cell）加え、30℃で３日間静かに撹拌しながら反
応を行なつた。 これらの結果、親株であるブレビバクテリウ
ム・フラバムMJ−233（微工研菌寄第3063号）の
集菌菌体を使用の場合、1.1ｇのＬ−アスパラギ
ン酸が採取され、また、α−アミノ−ｎ−酪酸耐
性株であるブレビバクテリウム・フラバムMJ−
233−AB−41（微工研菌寄第3812号）の集菌菌体
を使用の場合、3.2ｇのＬ−アスパラギン酸が採
取された。 実施例 ２ 尿素２ｇ、硫安７ｇ、KH₂PO₄0.5ｇ、
K₂HPO₄0.5ｇ、MgSO₄・7H₂O0.5ｇ、FeSO₄・
7H₂O20mg、Mn、SO₄・４〜6H₂O20mg、酵母エキ
ス３ｇ、ビオチン200μｇ、チアミン塩酸塩100μ
ｇ、コーンステイープリカー５ml、水道水１か
らなる培地50mlを500ml容三角フラスコに入れ、
120℃で10分間滅菌後、無菌条件下でエタノール
を２%V/Vになるように添加した。 この培地にブレビバクテリウム・フラバムMJ
−233−AB−41（微工研菌寄第3812号）のブイヨ
ン斜面培地上の菌体１白金耳を植菌し、33℃で２
日間振盪培養後、遠心分離に集菌した。 一方、フマール酸10ｇ、MgSO₄・7H₂O10ｍＭ
よびZnSO₄・7H₂O1ｍＭを水50mlに加え、アンモ
ニア水でPH10.0に調節後、更に水を全体量が100
mlになるように加えて調製した反応液、（PH9.7）
に、先の集菌菌体（Wet cell）30ｇを加え、45℃
で静かに撹拌しながら25時間反応を進めた。この
後遠心分離に集菌し、一回目の反応を終えた菌体
を得た。この菌体を除いた反応残液（略100ml）
を塩酸でPH2.8に調整して沈殿した粗Ｌ−アスパ
ラギン酸を過分別後、冷水で洗い、乾燥して
8.2ｇのＬ−アスパラギン酸（比旋光度〔α〕^２０ _Ｄ＋
25.1゜、Ｃ＝４、6N−HCl）が得られた。 さて、一回目の反応を終えた集菌菌体を再度上
記と同じ組成の反応液に加え、上記と同じ条件で
二回目の反応をさせて、また集菌菌体とＬ−アス
パラギン酸を得た。 この繰返し反応操作を都合七回繰返し、各反応
で得られたＬ−アスパラギン酸が理論収率にほぼ
達していることから、繰返し用いた集菌菌体中の
アスパルターゼ活性低下がないことが認められ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ブレビバクテリウム属に属し、α−アミノ−
   ｎ−酪酸に耐性を有する微生物を好気的に培養
   し、その培養物を用いて、フマール酸またはその
   塩、および、アンモニアまたはアンモニウム塩よ
   りＬ−アスパラギン酸を生成、採取することを特
   徴とする、Ｌ−アスパラギン酸の製造方法。