JPS59232088A - Ｌ−アスパラギン酸の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は高子スパルターゼ活性を有するエシエリシγ属
に属する新規微生物及び当該微生物を用いるＬ−アスパ
ラギン酸の製法に関する。

従来、ニジエリシア・コリがアスパルターゼ活性を有し
ており、この微生物を用いてフマール酸アンモニウム（
又は７マール酸とアンモニウム塩）からＬ−アスパラギ
ン酸を酵素的に製造する方法が知られている（　Ｂｕｌ
ｌ、Ａｇｒ、Ｃｈｅｗ、ＳｏＣ，＋　２４　＋２９６　
（１９６０）　、、Ａｐｐｌ、Ｍｉ、ｏｒｏｂｉｏｌｏ
、　１３８６　（１９７４）、特公昭５４−１２５５３
号、特公昭５７−１８８６７号〕。しかしながら上記方
法で用いられているエシエリシＴ畳コ、りのＴスパルタ
ーゼ活性は工業的に充分満足し得るほど高いとは云えな
いという問題があった。

本発明者らはエシエリシＹ属に属する微生物の−３− 有するアスパルターゼ活性を司る染色体フラグメントを
切り出し、これをプラスミｙに組み込んだのち、エシエ
リシγ属微生物に移入する。所謂セルフクローニングに
より親株に比して極めて高いアスパルターゼ活性を有す
る微生物をＭＷすることに睨功した。

即ち１本発明はエシエリシ了属に属する微生物から採取
したアスパルターゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核酸
をプラスミドに組み込んだハイブリッドプラスミドを含
有せしめたエシエリシγ属に属する微生物及び該教生物
閑体、その培養物もしくは該菌体の処理物をフマール酸
とアンモニアに作用させることを特徴とするＬ−アスパ
ラギン酸の製法である。

〔不発明徴生物の調製法〕

本発明においてアスパルターゼの遺伝情報を担うデオキ
シリポ核ｌｖ（以下・染色体ＤＮＡと称する）の供給源
となる微生物としては、エシエリシγ属に属しアスパル
ターゼ活性を有するものであればいかなる微生物であっ
てもよく惨例えばニジエリシア・コリに−１２ＭＭ２９
４（ＡＴ　ＣＣ，１＆３３６２５　）ｅニジエリシア・
：ＩＩＪＫ−１２Ｃ６Ｑ　Ｑ’ｒｊｍ−（”Ａ　’Ｉ’
　ＣＣＡ３３５２５　）等を用いることができる。

牲 上記の如λ微生物から接収される染色体ＤＮＡを組み込
むプラスミドとしてはエシェリシγ属に属する微生物中
において複製可能なプラスミドであれば特に限定されな
いが例えばｐｓｃｌ　０１　〔Ｐｒｏｏ、Ｎａｔｌ、Ａ
ａａｄ、Ｓａｉ、Ｕ！ＦＡ、　ｌ　７０　ｅ　３２４０
　（１９７３）］もしくはｐ　Ｂ　Ｒ３２２Ｃ”ｅｎθ
：’　＊　２　＋９５Ｇ］　９７５　））、或いはｐＢ
Ｒ３２５［Ｇｅｎｅ。

、４．１２１（１９７８）］、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。、１３４．１　］　Ａ４　（１９
７Ｂ）］　、　ｐＡｃＹｃ１３４（Ｊ、Ｂａｃｔ、ｅｒ
ｉｏｌｏ、　１３４　。

１１４１　（１９７８））等を用いることができる。

また、染色体ＤＮＡをプラスミドに組み込んだツバイブ
リッドプラスミドを含有せしめる宿主としてはエシエリ
シγ属に属し形質転換可能な微生物であればよく９例え
ば前記染色体ＤＮＡの供給源として用いた微生物を好適
に用いることができる。

　５一 本発明に係る微生物を調製するに際しては、先ずアスパ
ルターゼ活性を有するエシェリシγ属に属する微生物よ
り染色体ＤＮＡを採取する。染色体ｔｌＮＡの採取は前
記した如きエシエリシγ属微生物の菌体をリゾチーム処
理、界面活性剤［ＳＤＳ、ザルコシル（Ｎ−ラウロイサ
ルコシン酸ナトリウム）等］で処理したのち、除蛋白し
ついでエタノール沈殿せしめる常法［Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉ
ｏ１６．３　。

２０８　＊　（１９６１）　＋　Ｂｉｏｏｈｅｍ、Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、Ａｃｔ’ａ。

、１２．６１９（１９６３））により容易に実施できる
。

かくして得られた染色体１）ＮＡとブーラスミドとラス
ミドのｔｌＮＡ鎖を一重もしくは二重切断したのち、リ
ガーゼ（例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ。

大腸菌ＤＮ’Ａリガーゼ等）で処理するか、或いはその
切断末端によってはターミナ′ルトランス７エラーゼ、
ＤＮＡポリメラーゼ等で処理したのちりガーゼを作用さ
せてＤＮＡ鎖を結合する等の常法　６− （Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｈｉｎ’ｚｙｎ＋ｏｌｏｇｙ
　＋　８８　ｔ　４１　＊遺伝子操作実験法（高木康敬
編著、講談社サイエンティフィック）〕により実施する
ことができる。

このようにして得たハイブリッドプラスミドによる形６
転換方法は例えば低温下で塩化カルシウム含有溶液で宿
主微生物細胞を処理して菌膜の透過性を増大させ、ハイ
ブリッドＴ）ＮＡを宿主微生物中にとり込ませる方法［
Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌｌ、５３　＋１５９（１９７０）
　、　Ｊ、ＢａｏｔｅｒｏＪ、　ｌ　ｌ　９．１０７２
（１９７４）、）等を採用できる。

カくシて得られた形質転換株のうち、アスパルターゼの
遺伝情報を担うハイブリッドプラスミドが移入された菌
株の選択はＬ−アスパラギン酸を唯一の炭素源もしくは
窒素源として良好に生育しうる菌株を釣菌・分離するこ
とにより実施できる。

又・形質転換に際し、ハイブリッドプラスミドを各種の
変異を有する変異株に移入して目的とするハイブリッド
プラスミドを予め選択することもできる。かかる選択に
列用し得る変異株としては例えばエシェリシγ属に属す
る微生物であってアスパ−　７− ルターゼ欠損性恋異株があげられ、グルタミン酸を唯一
の炭素源として生育しうる菌株として選択できる。

かくすることにより水元明番こ係る微生物、即ち、ニジ
エリシア嘱に属する微生物から採取したアスパルターゼ
の遺伝情報を担うデオキシリポ核ｅをプラスミドに組み
込んだハイブリッドプラスミドを含有せしめたエシェリ
シγ属に嘱する微生物を得ることができる。

かかる微生物としては具体的には例えばニジエリシアφ
コリＴＡ５００３（微工研菌寄第７０９ぢ １号）、ニジエリシア・コリＴＡ本００４（ｆｉエルタ
ーゼ活性を有する。

〔Ｌ−アスパラギン酸の製造〕

本発明に係る微生物は前記の如く親株に較べて顕著に優
れたアスパルターゼ活性を有しているので、該微生物を
用いてフマール酸とアンモニアからＬ−アスパラギン酸
を好適に製造することがで特開ＩＩＨ５９−２３２０８
８（３） きる。

即ち２本発明に係る微生物の培養欣、該培挫７没から採
取した菌体もしくは該菌体の処理物を７７−ル酸とアン
モニアに作用させることによりＬ−アスパラギン酸を・
製造することができる。

本発明に係る微生物を培養するに際しては炭素源、窒素
ｌｘ、有桟栄掩源、無機塩類などを含む通常の栄養培地
が使用できる。培養は常法により行なうことができ１例
えば培地のｐＨを５６０〜９．０に調整し、微生物を接
種したのち１０〜４５℃、好ましくは２８〜３７℃で好
気的に培養すればよい。又、上記培地においてＬ−アス
パラギン酸を炭素源、窒素源として用いることができそ
の際の添加量は約０．１〜５鴫であるのが適当である。

し 酵素反応に際＝ては上記の如くして得られる培養液のほ
かに該培養液から採取した菌体、該菌体の処理物をも用
いることができ、ここに菌体の処理物としては例えば洗
浄菌体、乾燥菌体、菌体磨砕物、菌体の自己消化物、菌
体の超音波処理物、菌体抽出物又はこれらをゲル抱括法
や吸着法等のそ　９− れ自体公知の固定化方法により固定化したものがあげら
れる。固定化したものの具体例としては菌体等を例えば
ポリアクリルアミドゲル、含硫多糖類ゲル（カラギーナ
ン、）茎−セレラン等）、コラーゲンゲル、アルギン酸
ゲル、ポリビニル了ルコールゲネ、寒天ゲルで固定化し
たものがあげられ、ポリアクリルアミドゲルによる場合
は例えば特公昭５３−１８３１号記載の方法により・又
・含硫多糖類による場合は例えば特ＰＡ席５３−６４８
３号記載の方法により固定化することができる。

コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、ポリビ、ニルアルコ
ールゲル、寒天ゲル等による場合も９例えば特開昭５１
−１４４７８０号、特開昭４９−３０５８２号・特開昭
４９−８０２８５号、特開昭５１−１３３４８４号記載
の方法に従って固定化することができる。

基質りるフマール酸とアンモニアは種々の形で反応系に
供給することができ９例えばフマール酸アンモニウム塩
として供給してもよく、更にはフマール酸もしくはその
塩と無機アンモニウム塩と１０− して供給してもよい。

フマール酸塩としては例えばフマール酸ナトリウム、７
マール酸カリウムを好適に用いることができ、無機アン
モニウム塩としては例えば塩化アンモニウム、硫酸アン
モニウム、リン酸アンモニウム又はこれらの混合物を好
適に用いることができる。

フマール酸もしくはその塩と無機アンモニウム塩を用い
る場合１こけ、これら２成分のモル比は１：１．５〜１
：２の間にあるのが適当である。

酵素反応は約５〜５０℃の広い温度範囲で実施すること
ができるが微生物の酵素の安定性を考慮して２０〜４５
℃で実施するのが好ましい。又。

酵素反応に際してそのｐＨは６〜１０となるよう実施す
るのが好まし手。尚、上記酵素反応に際してはカルシウ
ム、マグネシウム、マンガン、ストロンチウム等の２価
金属イオンを添加するのが好ましい。これらの２価金属
イオンの濃度は０．１〜１０ミリモル程度でよく、これ
により酵素の安定性−１１− を高めることができる。

叛 反応は微舌物菌体を用いる場合にはバッチ法で実施する
のが好ましく、培養後集菌した微生物菌体を前記した如
き基質溶液にけん濁しかく拌することによってＬ−アス
パラギン酸が生成する。又、固定化微生物を用いる場合
の反応は固定化微生物が水に不溶性であるため、バッチ
法によるのみならず、カラム法によって連続的に実施す
ることば、Ｌ−アスパラギン酸のみを含む流出液が得ら
、れる。またバッチ法による場合は基質溶液に固定化微
生物をけん濁させ、かく拌することによってＬ−アスパ
ラギン酸が生成する。この場合には反応終了液から固定
化微生物を口過或いは遠心分離することにより取得すれ
ば再びこれを反覆使用することができる。上記反応を実
施するにあたって１　　は反応進行率は微生物の量一温
度１反応時間書基質の流速（特に線速度〕その他により
影響される。

例えば、カラム法によ、る場合は使用する固定化微特開
ｎＵ３９−２３２０８８　（４） 生物の量に従い基質／８液の流下速度を、またバッチ法
による場合はその反応時間を適当に５整することにより
反応進行率を１００幅にまで高める至適条件を見出すこ
とも容易である。

かくして反応液中に生成蓄積したＬ−アスパラギン酸の
分離精製はｍ　ａ常のイオン交換樹脂法やその他の公知
方法を組合せて容易に行なうことができる。

以上の如く本発明に係る微生物は従来知られているエシ
エリシ了属微生物の有するアスパルターゼ活性より格段
に高いアスパルターゼ活性を有し。

かかる高アスパルターゼ活性の微生物を用いることによ
り工業的に極めて有利にＬ−アスパラギン酸を製造し得
る。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

尚、実施例中のアスパルターゼ活性は１１．０　Ｍ　７
マル酸アンモニウム（ｐ）！８．７　、　Ｉ　ＷＭｍ化
マクネシウム含有）と菌体又は菌体処理物とを接触させ
。

３７℃で１時間反応後反応液中のＬ−アスパラギ１３− ン酸をロイコノストック・メ〜センチロイデスｐ６０を
用いるバイオアッセイ法［Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、
＋　］７２．１５（１９４８））により測定した。

実施例　１ （１）染色体ＤＮＡの調製 ニジエリシア・コリに一１２ＭＭ２９４株を１゜２／の
グルコース２呪を含むＬ−プロス（ペプトン１幅、酵母
エキス０．５＜、塩化ナトリウム０．５４、ｐ）１７．
０１に接種し、３７℃で８時間振とう培養し対数増殖期
後期の菌体を遠心分離により集めた。この菌体をリゾチ
ーム処理、ザルコシル処理してｒｓ菌し、フェノール処
理により除蛋白したのちエタノール処理して染色体り、
ＮＡを沈殿させた。

ついで常法により染色体り、ＮＡを抽出精製することに
より染色体ＤＮＡ５．４”９を得た。

（２）　　プラスミドＤＮＡの調製 エシエリシγ−コリに一１２Ｃ６００ｒ−ｍ−株に直 ｐｓｃｌｏｌを含有させた菌株（Ｐｒｏａ、Ｎａｔ＋隻
、Ａａａｄ。

Ｓａｉ、ＵＪ、Ａ、　、　７０−３２４０　（１９７３
）　〕を８００−のグルコース２鳴を含むＬ−ブロスに
接種１４− して３７℃で７時間振とう培養した後、菌体を遠心分離
して集菌し１こ。ついで該菌体をリゾチーム処理、ＳＤ
Ｓ処理によりＦＪｍさせ、最終ＩＭになるように塩化ナ
トリウムを加えた後書１０Ｇ、０００×７，３０分間の
遠心分離を行なった。上清を採取し、フェノール−クロ
ロホルム処理した後、エタノールを加えＤＮＡを遠心分
離により集めた。

沈殿したＴＩＮＡを１０ｒｒＬＭ）リス塩酸−］ｍ、Ｍ
Ｐ！Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐｉ（７，５３に溶解し、塩化セシ
ウム・工千ジウムブロマイド平衡密度勾配遠心法により
プラスミドＴ）ＨＡを分離精製した。かくして１．０■
のｐｓｃ１０１プラスミドＤＮＡを得た。

（３）ハイブリッドプラスミドの調製 上記（１）で得た染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　１０μ９　、　＋
２）で得たプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　２／４．の各々に制
限エンドヌクレアーゼＥｏｏＲＩとＸｈｏ　工を同時に
通常の条件で作用させＴ）ＨＡ鎖を完全に切断した。６
５℃、１０分間の熟処理後９両反応液を混合しＴ４ファ
ージ由来のＤＮＡ、ｊＪガーゼを通常の条件下で作用さ
せてＤＮＡ鎖を連結させた。

−１５− （４）ハイブリッドプラスミドによる形質転換（ａｌ　
ｘ　シエリシ？　・コリに一１２Ｃ６０Ｑｒ−ｎ＋−を
Ｎ−メチル−Ｎ＋−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで
変異誘導処理し、Ｌ−グルタミン酸３　Ｑ　ｒｎ　Ｍを
炭素源とする最小寒天培地（リン酸第二カリウム０．７
＜、リン酸第−カリウム０．３＜、硫酸アンモニウム０
．１＜−ｆｆｌ酸マグネシウム・７水和物ｏ。

０１鳴、寒天１．５＜）に塗布した。３７℃で２日間培
養したのち、生じたコロニーのうち大きなコロニーを釣
菌分離しＴＫ６株を得た。ついでこのＴＫ５株をＮ−メ
チル−Ｗ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで変異誘導
処理し、０．２＜のグルコースを含むＬ−ブロス寒天培
地に平板あたり約１００個のコロニーが生じるように塗
布した。生じたコロニーのうちＬ−グルタミン酸３９　
ｍ−Ｍを炭素源として含む最小培地上で、３７℃で２日
間培養しても生育しない株を選択（レプリカ法）した。

１　　かくして得られた株からアスパルターゼ活性を欠
損したＴＫ２３７株を得た。

得られたＴＫ２３７をグルコース０．２鴨を含む特開昭
５９−２３２０８８（５） Ｌ−ブロス３０ｒｎｌに接オし、３７℃で振とう培養し
その対数増瘤期間中期まで生育せしめた菌体を集菌した
。ついで水冷した０、１Ｍ塩化マグネシウム溶筬１５−
にけん濁したのち集菌し、氷冷した０、１Ｍ塩化カルシ
ウム溶液１５−にけん濁した。

０℃で２０号間放置したのち集菌し、水冷した０゜１Ｍ
塩化カルシウム溶液３．ｄ！こけん濁した。この細抱け
ん濁、夜に（３）で得たＤＮＡ溶液を加えて６０分間水
冷したのち、３７℃で３分間熱処理することによってＤ
ＮＡを到胞内にとりこ土せた。ついでこのけん濁液にグ
ルコース０，２％を含むＬ−ブロス１５−を加え３７℃
で２時間振とう培養した後、集菌し、生理食塩水１５ｒ
ｎｌにけん濁した。再度集菌し一生理食塩水１５−にけ
ん濁したのち集菌した。ついで生理食塩水１５−にけん
濁し、該けん濁液を０．５〜１ｍ／ずっＬ−グルタミン
酸３０？ｙＬＭを炭素源とする寒天培地（アンピシリン
２５μ９／ｍ／含有）に塗布し、３７℃で７日間培養し
電相じたコロニーのうち、ＴＫ６株よりアスパルターゼ
活性の高いものをハイブリッドプラスミド１７− ＤＮＡによる形質転換株として得た。かくして得られた
形質転換株をＬ−ブロスＩＩ！で培養したのち（２）と
同様にしてハイブリッドプラスミドＤＮＡを採取した。

（ｂｌ得らｎたハイブリッドプラスミドＤＮＡとＴＫＧ
株とを上記４ａｌと同様１こ処１里して形質転換株を調
製し、グルコース０．２＜、アンピシリン５０〜／ｒｎ
ｌを含むＬ−ブロス寒天培地上に上布して３゛７℃で１
夜培養することによりアスパルターゼの遺伝子を有する
ハイブリッドプラスミドＤＮＡ（ｐ’Ｉ’Ａ３０３）を
含み高７スパルターゼ活性を宵する形質転換株ニジエリ
シア・コリＴＡ５００３（微工研菌寄第７０９１号］を
得た。

上記で得られたエシエリシ了・コリｙＡ５００３　ト原
ｎエシエリシ了・コリに−ｉ　２１Ｊ　Ｍ　２９４のア
スパルターゼ活性を測定した。その結果は下記第１表に
示す通りである。

１８− 第　　１　　表 上記第１表から本発明の微生物ニジエリシア・：Ｉ！Ｊ
’Ｉ’Ａ３００３は原株たるエシエリシγ・コリに−１
２ＭＭ２９４に比べ約７倍のアスパルターゼ活性を有す
ることが明らかである。

実施例２ （１）　　プラスミドＤＮＡの調製 実施例１−＋２１においてプラスミドｐｓｃ１０１に代
えてｐＢＲ３２２を用い・以下同様にして処理すること
によりｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ−１９− １゜Ｏηを得た。他方・実施例１で得たエシエリシγ・
コリ’［’Ａ３００３を実施例１−（２＋と同様にしテ
処理スルコトニヨリＤ　Ｎ　Ａ　ｐ　Ｔ　Ａ　５０３　
０．６ｒｎ９を得た。

（２）ハイブリッドプラスミドの調製 （ａｌ上記（１）で得ｊ＝Ｐ　Ｂ　Ｒ３２２１５ｐＦｌ
とｐＴＡ　５０３のＤＮＡ１５μ７に各々制限エンドヌ
クレアーゼＢａｍＦｆｌ：と５ａｌＩを同時に通常の条
件で作用させて両プラスミドＤＮＡ鎖を切断した。６５
℃、１０分間の熱処理後９両反応液を混合し’１４１）
ＮＡＩＪガーゼを通常の条件下で作用させてＤＮＡ鎖を
連結させた。

（ｂ）ニジエリシア・コリＴＫ２３７を上記（２１−ｆ
ａ）で得たＤＮＡ溶液で形質転換し、得られる菌株をグ
ルコース０．２＜、アンビンリン５０１４！／ｍｌを含
ムＬ−ブロス寒天培地で３７℃、４８時間培養したのち
、実施例１−（２１と同様に処理することにより）１１
　　　イブリッドプラスミドＤＮＡ０．７１１ｖを得た
。ついで得られたハイブリッドプラスミドＤＮＡ４βに
制限エンドヌクレアーゼＢｃｏＲＶを通常の条件で作用
さ、せてプラスミドＤＮＡ鎖を切断した。６５℃、１０
分間の熱処理後ＩＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを通常の条件下
で作用させてＤＮＡ鎖を連結させた。

（４）　　ハイブリッドプラスミドによる形質転換得ら
れたバイブリドプラスミドＤＮＡと’１’に２３７を実
施例１−（４１と同様にして形質転換し、グルコース０
．２’＜、アンピシリン５０μＰＡＪを含ムＬ−ブロス
寒天培地を用いて生育する菌株を採取し高アスパルター
ゼ活性を有する微生物を選択することによりアスパルタ
ーゼの遺伝子を有する）１イ千 ブリッドプラスミド（Ｐ’ｒＡ５０−ｉ）を含み高アス
パルターゼ活性を有する本形質転換株ニジエリら シア・コＩＪ　Ｔ　Ａ中００４（微工研閑寄第７０９２
号）を得た。

上記で得られたニジエリシア・コリＴＡ５００４と原性
エシエリシ了・コリＫ　＋　１２　Ｍ　Ｍ　２９４のア
スパルターゼ活性を測定した。その結果は下記第２表に
示す通りである。

２１− 第　　２　　表 （培地；実施例１で用い１こものと同一組成）上記第２
表から本発明の微生物エシェリシγ・３’　ｌｌ“ｒＡ
５０Ｑ４は原性たるニジエリシア・コリに一１２ＭＭ２
ｑ４＋こ比べ約１５倍のアスパルターゼ活性を有するこ
とが明らかである。又、ニジエリシア・コリ’ｆ’Ａ５
０’０４ｏハイブリッドプラスミドＤＮＡｐＴＡ５Ｑ４
を抽出し、制限エンドヌクレアーゼＶａｏＲ■とＳａｌ
　■で同時ニＤ　Ｍ　Ａ鎖を切断した。生じたＤＮＡ断
片を通常のγガロース・ゲル電気泳動法で調べた。その
結果、ｐＴＡ５０４はｐＢＲ３２２プラスミドＴ）ＮＡ
をＥｃｏＲ■とＳａ１■で切断して生じる大きい方のＤ
　ｌｉ　Ａ断片とｐＴＡ５０３由来のＤＮＡ断片とから
成ることがわかった。

２２一 実施例　３ フマール酸アンモニウム３％、第１リン酸カリウム０．
２＜、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５弘、コーン
スチーブリ力−４％、ミースト２％を含む培地（ｐｔＬ
’、ｏ）５００−にニジエリシア・コリＴＡ５ＱＱ４を
植菌し、３７℃で２４時間培養した。この培養散のｐＨ
をアンモニア水でｐＨ８，５とし、フマール酸アンモニ
ウム６５ｙおよびトリトンＸ−１００５００預りを添加
してさらに３７℃で６時間静置して酵素反応を行なった
。反応終了液をろ過、濃縮したのちｐ）Ｉ　２．８に調
整し析出晶をろ取することによりＬ−アスパラギン酸の
粗結晶を得た。ついで該粗結晶を水から再結晶すること
によりＬ−アスパラギン酸４７．０　ｆ／を得た。

実施例　４ ＋１１　　フマール酸アンモニウム３＜、＠１リン酸カ
リウム０．２％、硫酸マグネシウム・７水和物０゜０５
％、コーンスチーブリ力−４呪、ミースト２％を含む培
地（ｐＨ７，０）にニジエリシア・コリＴＡ５００４を
植菌し、３７℃で２４時間振とう培−２３− 養した。この培養液から遠心分離により集菌した菌体を
生理食塩水１６−にけん濁し、あらかじめ４０℃に保温
した３、２幅ゲニューゲルＷＧ水溶板６４．１／を加え
４０℃の混溶中で混合した。この混合液ヲ１１Ｊフマー
ル酸了ンモニウム水溶１（ｐｉ−１８゜５　、　］　Ｗ
ＬＭ　塩化マグネシウム含有）巾に滴下することにより
球状ゲル（直径３　ｍｍ　）のγス／Ｎｌ’　ルターゼ
活性を有する固定化エシエリシγ・コリ６１グ（湿潤量
］を得た。この固定化菌体１７のアス／、ｓルターゼ活
性は２２．３　ｍｍｏｌｅ／７．Ｔであった。

（２）　　上記（１）で得られた固定イレシエリシア・
コリ６１７を外套管付カラム（４ｃｍ　Ｘ　８　ｃｘ　
）に充填し、３７℃にて４８時間インキスペードするこ
とにより活性化（Ｙスパルターゼ活性１９３　Ｑ　ｙＦ
ＬｍｏｌｓｓＡｒ　）　後、Ｆｌ温度にてＩＭフマール
酸アンモニウム溶液（ｐＨ８，５、１ｍＭ塩化マグネシ
ウム含有〕１０００−を５０　ｒｎｌ／ｈｒの流速で流
下した。流出液をｐＨ・、　　　′・８とする０と″り
結晶を析出させた・析出品をろ取することによりＬ−ア
スパラギン酸１２８ノを得た。

特開昭５９−２３２０８８　（７） 実施例　５ （１）ニジエリシア・コリ’Ｉ’Ａ５ＱＯ４の［１Ｋ８
２を生理食塩水５Ｉｎｌにけん濁し、これにあらかじめ
４０℃ζこ保温した２、２幅ゲニューゲルＷａ水溶液（
１呪ローカストビーンガム含有）８０−を加えて混合し
た。この混合液を冷却してゲル化させ、更に２幅塩化カ
リウム水溶′ｅ２５−を静かに加え３０分間静置した。

得られたゲルを１辺３跣の立方体に成型し２％塩化カリ
ウム水溶液で洗浄した。得られたゲル９１７を冷エタノ
ール１０〇−に浸漬し、これにグルタルアルデヒドを最
終濃度０．４９＜になるよう加え、水冷下に１５分間静
置した。ついでゲルをろ取し２鴫塩化カリウム水溶す 液で洗浄した後、活性化することによりγスパルターゼ
活性を有する固定化エシエリシγ・コリ８７ｙ（湿潤＠
　、　３０．０　ｍ、ｍｏ１ｅｓ／ＦＬｒ／９菌体）を
得た。

（２）　　上記（１）で得られた固定化ニジエリシア・
コリ１１１を外套管付カラム（１，６αＸ１２Ｃ１１）
に充填し、３７℃にてＩＭフマール酸アンモニウム水溶
２（ｐＨ８，５、１？ｙＬＭ塩化マグネシウム含有］を
２５− ６　ｍ１Ａｒ　（２）　流速で昼夜速続して導通し経時
的にアスパルターゼ活性を測定した。その結果２０日間
経過後もなお活性の低下は殆ど認められなかった。

実施例　６ ニジエリシア・コリＴＡ５００４のｉ１体１０ｇを０．
０５Ｍリン駿緩衝液（ＰＩ−１８，５）５０ｒｎｌにけ
ん飾し９Ｋｃで１５５＋間音波処理を行なった。ついで
該けん濁液を遠心分離し得られる上澄液４０−を弱塩基
性イオン交換樹脂デュオライト−Ａ７　（米国、ダイア
モンドジャムロック社製）６０−を充填したカラムに３
０ｆｎｌ／ｈｒで室温下に導通した。次に０．１Ｍリン
酸緩衝ｇｌ（ｐ＋１８．５）３００−と０．４％グルタ
ルアルデヒド３００−を含むｍＫ＋−で３０分し 間架橋＃グルタルアルデヒドを充分洗浄して固定化酵素
を調製した。この固定化酵素を５〇−容量のカラムに充
填し、ＩＭフマール酸アンモニウム（ｐＨ８，５、１７
グ１Ｍ塩化マグネシウム含有）５００ｄを２５　ｍｌ／
ｈｒの流速で導通した。流出液を合しｐａｌ　２゜８と
することによりＬ−アスパラギン酸５５グを得る。

２６− 実施例　７ ニジエリシア・コリ’Ｉ’Ａ３００４を用いて実施例６
と同様にして得られた上澄液を硫安分画（３０〜５０＜
飽和）し得られた沈殿を水５−に溶解した。この溶液を
水に対して１夜透析し透析内液を酵素液（γスパルター
ゼ標品）とした。ついでこの酵素液２−と３．２幅ゲニ
ューゲルＷＧ水溶液　１２ｒｚを３７℃の混溶中にて混
合した。該混合液を２呪塩化カリウム水溶１叩中に滴下
することにより球状ゲル（直径約３９）を得た。得られ
た固定化アスパルターゼの活性は１８．７　ｍｍｏｌｅ
ｓ／ｈｒ／　９であった。

自発手続補正書 １．事件の表示 昭和も２年特許願第　）Ｄ’７ｔ；７３　　号２、発明
の名称 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 大阪府大阪市東区道修町３丁目２１番地（〒５４１）（
２９５）田辺製薬株式会社 代表者　松　原　−部・ ４、代理人 大阪府大阪市淀川区加島３丁目１６番８９号（〒５３２
）５、補正により増加する発明の数 ′６．補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ７、補正の内容 別紙の通り 補　　正　　の　　内　　容 １、明細好第２頁１３行目の 「Ｓｏｃ、　、　２４　、Ｊを ［Ｓｏａ、　Ｊａｐａｎ　、　２４　Ｊ　　に訂正する
。

２、同第２頁下から７行目の 「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　、　８８６　Ｊを「Ｍｉｏｒ
ｏｂｉｏｌ、　、　２７−８８６　Ｊ　　に訂正する。

３、同第４頁１１行目の ｒ（１９７５）Ｊを ｒ（１９７７）Ｊ　　に訂正する。

４、同第５頁６行目の 「Ｎ−ラウロイ」　を 「Ｎ−ラウロイル」　に訂正する。

５、同第５頁下から８行目の 「Ｈｉｎｄ　ｌ［Ｊを 「Ｈｉｎｄ　［［Ｊ　　に訂正する。

６、同第５頁下から７行目の 「ＥｃｏＲＩ等」を 「ＥｃｏＲＩ　、　＠ａｏＲＶ等」　に訂正する。

７、同第１２頁下から３行目の ｒ　８．７　Ｊを ｒ８．５Ｊ　　に訂正する。

８、同第１３３頁１行目 「Ｐ６」を 「Ｐ６」　に訂正する。

９、同第１３３頁７行目 「２呪」を 「０．２呪」　に訂正する。

１０、同第１３頁下から２行目の ［Ｕ、Ｓ、Ａ、Ｊを 「ＵｓＡＪに訂正する。

１１、　　同第１３頁下から１行目の 「２鳴」を 「０．２％」　に訂正する。

１２、同第１６６頁２行目 「増殖期間中期」　を 「、アンピシリン２５　ｆｉ９／−Ｉ　Ｊ　　を「テト
ラ廿イタリン５ｐ−」　に訂正する。

１４、同第１７７頁７行目 「アンピシリン５０η」　を 「テトラサイタリン５μ７」　に訂正する。

１５．同第１８頁第１表及ぶ第２１頁第２表の「　（μ
ｍａｌｅ　／　ｍｉｎ　／ブＶ蛋白）」　　を「（ｐ　
１Ｔｌｏｌｅｓ　／ｍｉｎ／’１７　蛋白）ｊ　に訂正
する。

１６、同第１８頁下から１１１行目 「コーンスターブリカー」　を 「コーンスターブリカー」　に訂正する。

１７、同第１９頁１０行目及び第２０頁２行目の「〒４
」を 「〒４」　に訂１ピする １８、同第１９頁下から５行目の 「４８時間」　を 「８時間」　に訂正する。

１９、同第２０頁５行目の 「バイブリド」　を 「ハイブリッド」　に訂正する。

２０、同第２３頁１０行目の ［ｍｍｏ１＠／ｈｒ　Ｊを 「ｍ、　ｍｏｌｅｓ　／ｈｒ　Ｊ　　に訂正する。

４８１−

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　エシエリシＴ属に属する微生物から採取した
   アスパルターゼの遺伝情報を担うデオキシリポ核酸をプ
   ラスミドに組み込んだハイブリッドプラスミドを含有せ
   しめたエシエリシγ属に属する微生物。
2. （２）プラミドがｐｓｃＩｏｌである特許請求の範囲第
   １項記載の微生物。
3. （３）　　プラスミドがｐＢＲ３２２である特許請求の
   範囲第１項記載の微生物。
4. （４）　　エシエリシγ属に属する微生物から採取した
   アスパルターゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核酸をプ
   ラスミドに組み込んだハイブリッドプラスミドを含有せ
   しめたエシエリシγ属に属する微生物菌体、その培養物
   もしくは該菌体の処理物をフマール酸とアンモニアに作
   用させることを特徴　２　− とするも−アスパラギン酸の製法。 ＋５１　　フマール酸とアンモニアをフマール酸アンモ
   ニウムとして供給する特許請求の範囲第４項記載の方法