JPS59113895A - Ｌ−アスパラギン酸の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＬ−アスパラギン酸の製法に関し、更ニ詳シく
は高７スパルターゼ活性を有スルニジエリシア属に属す
る微生物を用いてＬ−アスパラギン酸を製造する方法に
関する。

従来、ニジエリシア・コリがアスパルターゼ活性ヲ［Ｌ
　７　ｂ　ｒ）、この微生物を用いてフマール酸アンモ
ニウム（又はフマール酸、とアンモニウム塩）からＬ−
アスパラギン酸を酵素的に製造する方法が知られている
Ｃ　Ｂｕｌｌ、　Ａｇｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　、
　２４　、２９６　（１９６０）　、　ＡｐｐｌｌＭｉ
ｃｏｂｉｏｌ、　、　２７．８８６（１９７４１，特公
昭５４−１２５５３号、特公昭５７−１８８６７号〕。

しかしながら上記方法で用いられているニジエリシア・
コリのアスパルターゼ活性は工業的に充分満足し得るほ
ど高いとは云えないという問題かあり”た。加えてアス
パルターゼ活性を有するニジエリシア・コリがグルコー
スの如き資化されやすい炭素源の存在下においては他の
炭素源利用に関ｔ”ｉ、する酵素の生成が抑制されると
いう、所謂カタボライト抑制をうグルコース等の資化さ
れやす゛い炭素源を培地に加えるとアスパルターゼ活性
が充分に上昇せず、従ってＬ−アスパラギン酸の生成慣
が減少するという問題もあった。

かかる状況に鑑み本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、
エシエリシＴ属に属し。アスパルターゼ活性を有する親
株に較べて極めて高いアスパルターゼ活性を有する変異
株の取得に成功し、工業的有利なＬ−アスパラギン酸の
製造法を確立するに至った。

即ち１本発明はエシヱリシγ属に属シ１０丁スパルター
ゼ活性を有する親株より誘嚇され、かつＬ−アスパラギ
ン酸を唯一の窒素源とするか、或いは窒素源および炭素
源とする培地で生育する高アスパルターゼ活性を有する
変異株の培養液、該培養液から採取した菌体もシ、＜は
該菌体の処理物をフマール酸とγンモニ了に作用させる
ことを特許とするし一アスパラギン酸の製法である。

本発明で使月する高アスパルターゼ活性を有すル微生物
は、エシエリシ下属に属し、アスパルターゼ活性をイ１
する微生物を親株とし、該親株を変異誘起処理したのち
Ｌ−アスパラギン酸を唯一の窒素源とするか、或いは窒
素源と炭素源とする培地で培養し該培地で良好に生育し
得る菌株を採取することにより取得することができる。

親株たる微生物としてはエシエリシ了属に属しアスパル
ターゼ活性を有するもｃノ）であれば特に限定されず。

例えばニジエリシア　つり（ＡＴＣＣ１１３０３）等を
好適に用いることができる。

変異誘起処理方法は通常の方法例えばＮ−メチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処理。

紫外線照射等の方法を採用することができる。

変異処理菌の培養に際し用いられる培地中のＬ−アスパ
ラギン酸を唯一の窒素源とする場合、窒素源と炭素源と
する場合のいずれも培地中濃度として約０．００５〜５
＜であるのが適当である。又り一アスパラギン酸を唯一
の窒素源とする場合には炭素源としてグルコース、シュ
クロース等を用いることができ、その濃度は例えばクル
コースでよび炭素源とするときも、培地には通常の栄養
培地に用いられる各種塩類、微咀元素等を添加すること
もできる。

培養方法は常法でよく侍に限定されないが具体的にその
１例を示せば、フラスコに変異処理菌を植菌後、一定速
度（例えば希釈率０．０５〜０．５７時ンで培地を注入
しつつ、培養液を抜き取りその条件下で速く生育する菌
体を濃縮分離する。所謂連続培養法〔［細菌、ファージ
実験法」（たん白質核酸酵素別冊）３５頁（１９７２）
］を好適に採用することができる。ついで該培養液を連
続培養法で用いた培地組成においてＬ−アスパラギン酸
を約０．１〜５％にした培地平板で生育した大きなコロ
ニーを採取することにより高アスパルターゼ活性を有す
る微生物を得ることができる。

かくして得られる高アスパルターゼ活性を有す取 る微生物としては壷体的には例えばニジエリシア・コリ
ＥＡＰＱ−２８（微工研菌寄第６７９２号ンエシエリシ
ア・コリＥＡＰＣ−１１０（微工研菌寄ｍ６７９３号）
、ニジエリシア・コリＨＡＰｏ−１３０（微工研菌寄第
６７９４号）等をあげることができ、これらの微生物は
、いずれもそのアスパルターゼ活性が親株に比して約２
．５倍以上の活性を有する。

上記の如き本発明の微生物を培養するに際しては炭素源
、窒素源、有機栄養源、無機塩類などを含む通常の栄養
培地が使用できる。培養は常法により行なうことができ
０例えば培地のｐＨを５．０〜９．０に調整し。微生物
を接種したのちｌＯ〜４５八 ℃、好ましくは２３〜３７℃で好検的に培養すればよい
。又、上記培地にお轡てＬ−アスパラギン酸を炭素源、
窒素源として用いることができその際の添加、量は約０
．１・〜５・幅であるのが適当である。

かくすることより得られる上記微生物の培養液抜培養液
から採取される菌体もしくは該菌体の処理物を基質たる
フマール酸とアンモニアに作用させることによりＬ−ア
スパラギン酸を製することができる。

菌体の処理物としては例えば洗浄菌体、乾燥菌体、菌体
磨砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物。菌体
抽出物又はこれらをゲル抱括法や吸着法等のそれ自体公
知の固定化方法により固定化したものがあげられる。

≠＃−固定化したものの具体的としては菌体等を例えば
ポリアクリルアミドゲル、含硫多糖類ゲル（カラギーナ
ン。ファーセレラン等）、コラーゲンゲル、アルギン酸
ケル、ポリビニルアルコールゲル、寒天ゲルで固定化し
たものがあげられ。

ポリアクリルアミドゲルによる場合は例えは特公昭５３
−１８３１号記載の方法により、又、含硫多糖類による
場合は例えば特開昭５３−６４８３号記載の方法により
固定化することができる。コラーゲンゲ！シ、アルギン
酸ケル、ポリビニルアルコ−ゲル 昭５１−１４４７８０号．特開昭４９−３０．５８２号
，特開昭４９−８０２８５号，特開昭５１−１　３　９
、　４　８　４号記載の方法に従って固定化することが
できる。

基質たるフマール酸とアンモニア！」種々の形で反応系
に供給することができ．例えばフマール酸アンモニウム
塩として供給してもよく，史書こけフマール酸もしくは
その塩と無機アンモニウム塩トして供給してもよい。

フマール酸塩としては例えばフマール酸ナトリウム、フ
マール酸カリウムを好Ａｉ　！ご用［、Ｎることかでき
．無機アンモニウム塩としては例えば塩化アンモニウム
、硫酸アンモニウム、リン覗アンモニウム又はこれらの
混合物を好適に用いることができる。

フマール酸もしくはその填と無機アンモニウム塩を用い
る場合には．こｎ，ら２成分のモル比はｌ：１．５〜１
：２の間にあるのが適当である。

酵素２反応は約５〜５０℃の広い温度範囲で実施するこ
とができるが微生物の酵素の安定性を考慮して２０〜４
５℃で実施するのか好ましい。又。

酵素反応に際してそのｐＨは６〜１０となるよう実施す
るのが好ましい。尚．上記酵素反応に際してはカルシウ
ム、マグネシウム、マンガン、ストロンチウム等の２価
金属イオンを添加するのが好ましい。これらの２価金属
イオンの贋度は０．　１〜ｌＯ　ミ１３モル程度でよく
．これにより酵素の安定性を高めることができる。

反応は微生物菌体を用いる場合にはバッチ法で実施する
のが好ま１−＜、培養後集菌した微生物菌体を前記した
如き基質溶液にけん濁１，かくはんすることによってＬ
−アスパラギン酸が生成する。

又，固定化微生物を用いる場合の反応は固定化微生物が
水に不溶性であるため．バッチ法によるのみならず．カ
ラム法によって連続的に実施することもできる。例えば
固定化微生物をカラムに充填し．このカラムに基質溶液
を適当な速度で流下すれば．Ｌ−アスパラギン酸のべ含
む流出液が得ら，（しる。またバッチ法による場合は基
質溶液に固定化微生物をけん副させ，かくはんすること
によってＬ−アスパラギン酸が生成する。この場合には
反応終了液から固定化微生物を口過成いは遠心分離する
ことにより収得すれば再びこれを反覆使用することがで
きる。上記反応を実施するにあたっては反応進行率は微
生物の情．温度．反応時間、基質の流速（特に線速度）
その他により影響される。例えば、カラム法による場合
は使用する固定化微生物の量に従い基質溶液の流下速度
を，またバッチ法による場合はその反応時間を適当に調
整することでこより反応進行率を１００％にまで高める
至適条件をり，出すことも容易である。

かくして反応液中に生成蓄積したＬ−アスパラギン酸の
分離精製は，ａ常のイオン交換樹脂法やその他の公知方
法を組合せて容易に行なうことができる。

以上の如き本発明方法は従来Ｌーアスパラギン酸の製造
に用いられたニジエリシア属微生物に較べてアスパルタ
ーゼ活性が格段に高いニジエリγ属微生物を用いるため
極めて高収率かつ短時間でフマール酸とアンモニアから
Ｌ−アスパラギン酸を製造することができるｂ又．本発
明に係る微生物のアスパルーゼ活性の上昇は現在、明確
ではないが恐らくアスパルターゼ生成に関与する遺伝子
の変異を生じたものと考えられる。しかもそのうち多く
のニジエリシア属微生物についてはカタボライト抑制７
１号解除されていることからグルコース・の如き資化さ
れ易い炭素源が存在しても了スパル散 ターゼ活性は低下しないという特急をも併せ有する。従
って本発明方法に係る微生物を培養するに際しては炭素
源が何であるかに左右されることなく高アスパルターゼ
活性を発現させることができ、Ｌ−アスパラギン酸を高
収亭で製造することができるものである。

以下９本発明を実験例、実施側により（に詳細に説明す
る。

尚、実験例及び実施例中のアスパルターゼ活性は０．１
Ｍ７マール酸アンモニウム（ｐＨ８，７，１ｍ！Ｊ塩化
マグネシウム含有）と菌体又は菌体処理物とを接触させ
、３７℃で１時間反応後１反応欣中のＬ−７スパラギン
酸をロイコノストリフ・メセンテロイデスＰ６０を用い
るバイオアッセイ法ＣＪ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　１７２．１５　（１９４
８）　］により測定した。

実施例 グルコース３．０％、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム０
．０１５＜、リン酸第１カリウム０．３％、リン酸第２
カリウム０．７　％　、　１ｉｌｔｆ酸マグネシウム・
７水和物０．０１％からなる培地５０，４を含む５０．
／容ベルコ社製スピナーフラスコにニジエリシア・ト コリＡＴ（：Ｃ１１３０３のＮ−メチル−Ｎ−二手培養
した。次いで培養液を生理食塩水で１０５〜ｌＯ６倍に
稀釈したのち、前記培地組成においてＬ−アスパラギン
酸ナトリウムを０．５％とし更に寒天１゜５％を加えた
平板培地に塗布した。１〜２日間で出現した大コロニー
を釣菌することによりニジエリシア・コリＥＡＰｃ−２
８（微工研菌寄第６７９２号）、ニジエリシア・コリＥ
ＡＰＯ−１１０（機工＠菌寄第６７９３号）を得た。こ
れらの微生物と親株たるニジエリシア・コリＡＴＣＣｌ
ｌ３０３についてアスパルターゼ活性を測定した。

結果は上記第】表に示す通りである。

第１表 基本＠畦；リン酸第１カリウム０．３％、リン酸第２カ
リウム０．７％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０１
％、硫酸アンモニウム０．１％、Ｌ−アスパラギン酸ナ
トリウム０．２％、（ｐＨ７，０）上記から明らかな如
（ＢＡＰａ−２８は親株たるＡＴＣＣ１１３０３に比べ
て、グルコースの存在下、不存在下のいずれの場合も３
倍のアスパルターゼ活性の上昇が見られた。このことか
らＥＡＰＩ−２８Ｌｔ７スパルターゼ活性の上昇はカタ
ボライト抑制の解除よりも、それ以外のアスパルターゼ
生成に関与する遺伝子の変異を生じた変異株であること
が認められる。

又、ＲＰＡＱ−１１０は親株たるＡＴＣＣ１１３０３に
比ベグルコース存在下で２０倍、グルコース不存在下で
２．２倍のアスパルターゼ活性の上昇が見うワた。この
ことからＥＡＰｃｌ　１０はアスパルターゼ活性の上昇
はカタボライト抑制の解除変異とともにそれ以外のアス
パルターゼ生成に関与する遺伝子の変異をも生じた変異
株であることが認められる。

実施例 Ｌ−アスパラギン酸ナトリウムＯ１＜、リン酸第１カリ
ウム０．３％、リン酸第２カリウム０．７％、硫酸マグ
ネシウム・７水ｆｌ］物０．０１＜からなＺ駿 培地に、実年例１と同様にＮ−メチル−Ｎ′−二トロー
Ｎ−二トロソグアニジンで処理したニジエリと同様に希
釈し前記培地組成に１５いてＬ−アスパラギン酸ナトリ
ウムを０．５％とし更に寒天１．５＜−を加えた平板培
地に塗布した。塗布後１〜２日間で出現する大コロニー
を釣菌することによりエシエリシγ・コ＋Ｊ　Ｗ　Ａ　
Ｐ　ｏ　−１３０（微工研菌寄第６７９４号）を得た。

この微生物と親株たるニジエリシア・コリＡＴＣＣＩ　
１３０３についてアスパルターゼ活性を測定した。

結果は下記第２表に示す１通りである。

第　２　表。

基本培地：実施例１で用いたものと同じ上記の結果から
明らかな如（ＥｉＡＰ″１９−１３０は親株たるＡＴＣ
Ｃ１１３０３に比ベグルコースの存在下で２５倍、グル
コースの不存在下で２．５倍のアスパルターゼ活性の上
昇がみられた。このことからエシエリシγ・コリＥＡＰ
ｃ−１３０はカタボライト抑制の解除変異とともにその
他のアスパルターゼ生成に関与する遺伝子の変異をも生
じた変異株であることが認められる。

実施例］ （１１フマール酸アンモニウム３幅、第］リン酸カリウ
ム０．２％、＠酸マグネシウム・７水和物０゜０５％、
コーンスチーブリ力−４幅、ミースト２鴫を含む培地（
ｐＨ７，０）５００−にニジエリシア・コリＷＡＰＣ−
２８を植菌し、３７℃で２４時間振とう培養した。この
培養液から遠心分離により集菌した菌体を生理食塩水１
６ｍ１にけん濁し。

あらかじめ４０℃に保温した３、２％ゲニューゲルＷＧ
水溶液６４−を加え４０℃の温浴中で混合した。この混
合液を１Ｍフマール酸アンモニウム水溶液（ｐＨ８，５
，１ｒｒＬＭ塩化マグネシウム含有）中に滴下すること
によ５り球状ゲル（直径３＋ｍ）のアスパルターゼ活性
を有する固定化エシエリシγ壷コ９６１ノ（湿毒量）を
得た。この固定化菌体１ｆ！のアスパルターゼ活性は８
６０μｍｏｌｅ／ｉｙであツｆ。

（２）　　上記（１）で得らｎた固定化ニジエリシア・
コＩ７６１　Ｉｆを外套管付カラム（４１Ｘ　８　Ｃ１
１）に充填し、３７℃にて４８時間インキュベートする
ことにより活性化（アスパルターゼ活性１５８６００（
Ｏμｍｏｌｅ／ｈｒ’　）後、同温度にてＩＭフマール
酸アンモニウム溶液（ｐＨ８，５，１ｍＭ塩化マグネシ
ウム含有）１０００−を５０　ｍ１ｈｒの流速で流下し
た。流出液をｐＨ２，８とすることにより結晶を析出さ
せた。析出晶をろ取することによりＬ−アスパラギン酸
１２２グを得た。

実施例２ 山　ニジエリシア・コリＩＡＰＱ−２８の菌体８グを生
理食塩水５ｍｊにけん濁し、これにあらかじめ４０℃に
保温した２、２幅ゲニューゲルＷＧ水溶液（１％ローカ
ストビーンガム含有）８０ｔｎｌを加えて混合した。こ
の混合液を冷却してゲル化させ、更に２％塩化カリウム
水／８［２５−を静かに加え３０分間静置した。得られ
たゲルを１辺３ｍの立方体に成型し２幅塩化カリウム水
溶液で洗浄した。得られゲル８９．３５’を冷エタノル
１００−に浸漬し、これｌこグルタルアルデヒドを最終
１度０．４９４になるように加え、水冷下に１５分間す 静置した。ついでゲルをろ取し２％塩化カー≠ウム水溶
液で洗浄することによりアスパルターゼ活性を有する固
定化ニジエリシア・コＩＪ　８５．６　Ｆ　（温償１１
　、４７０１３　μ＋ｎｏｌｅｓ／ｈｙ１５’閂体）を
得た。

（２）上記（１）で得られた固定化ニジエリシア・コリ
ーＩＦを外套管付カラム（１，６ａｎ　Ｘ　１２　ｃｍ
　）に充填り、３７℃にてＩＭフマール酸アンモニウム
水溶Ｈ（Ｐ＋−１８，５、ｌｙｎ＆ｌｒｎｌグネシウム
含有）ヲ６　ｍｌ／ｈｒの流速で昼夜連続して導スーし
経時的にアスパルターゼ活性を測定した。その結果２０
日間経過後もなお活性の低下は殆ど認められなかった。

実施例３ ニジエリシア・コリＫＡＰＱ−２８の菌体８　Ｐを０．
０５Ｍリン酸緩衝液１；ｐＨ８−５）　５０　ｒｎｌに
けん濁し９Ｋｃで１５分間音波処理を行なった。ついで
該けん濁液を遠心分離し得られる上澄液３８−を弱塩基
性イオン交換樹脂デュオライ）−ＡＴ（米国、ダイアモ
ンドシャムロツタ社製）６０−を充填したカラムに３０
　ｄＡｒで室温下に導通した。次に０．１闘リン酸緩衝
液（ｐｔ＋　８．５３３００−と０．４幅グルタルアル
デヒド３００−を含む溶液で３０分間架橋レグノ４ルア
ルデビドを充分洗浄して固定化酵素を調製した。この固
定化酵素を５０ｒｎ１容量のカラムに充填し、ＩＭフマ
ール酸アンモニウム（ｐ）１８．５．１１Ｍ塩化マグネ
シウム含有）５００＋ｄを２５−ｄ／ｈｒの流速で導通
した。流出液を合しｐＨ２゜８とすることによりＬ−ア
スパラキン酸６１Ｐを得る。

実施例４ ニジエリシア・コリＥＡＰＱ−２８を用いテ実施例３と
同様にして得られた上澄液を硫安分画（３０〜５０％飽
和）し得られた沈殿を水５−に溶解した。この溶液を水
に対して１夜透析し透析内股を酵素液（γスバルターゼ
標品〕とした。ついでこの酵素液２−と３．２％ゲニュ
ーゲルＷＧ水溶液１２−を３７℃の温浴中にて混合した
。該混合液を２％塩化カリウム水溶液中に滴下すること
により球状ゲル（直径約３■）を得た。得られた同であ
った。

実施例５ フマール酸了ンモニウム３＜、ｍｌＵン酸カリウム０．
２　％　、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５％、コ
ーンスチーブリ力−４％、ミースト２％をす 含む培地（ＰＨ７，０）５００−にエシェ中シア・コリ
ｇＡｐｏ−２８を植菌し、３７℃で２４時間培養した。

この培養液のｐＨをアンモニア水でｐ＋＋　ｓ、　５≠
Ｘ−１００５００〜を添加してさらに３７℃で１２時間
静置して酵素反応を行なった。反応終了液をろ過、濃縮
したのちρＦ１２．３に調整し析出晶をろ取することに
よりＬ−アスパラギン酸の粗結晶を得た。ついで該粗結
晶を水から再結晶することによりＬ−アスパラキン酸４
６．１ｙを得た。

実施例６ （１）Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム１．０％、リン酸
第１カリウム０．３％、リン酸第２刀リウム０゜７％、
硫酸マグネ、カラム・７水和物０．０１％から掖 なる培地ｌ／に実癒例１で得られたニジエリシア・コリ
ＥＡＰｃ−１１Ｑを植菌し、３０℃でｌθ時間振とう培
養したのち遠心分離により集菌する。ついで菌体を生理
食塩水にけん濁する。この菌体けん濁液１２−（湿菌体
６グ含有］に予め３７℃番こ保温した３、２呪ゲニユー
ゲルＷＧ（コペンハーゲンペクチンファクトリー社製の
カラギーナン）水溶液４８−を加えてよく混合する。該
混合液を］Ｍ７マール酸７ンモニウム水溶液（ｐＨ８，
５。

１　ｙｒＬＭ塩化マグネシウム含有）中に滴下すること
にヨｔ）球状ゲル（直径約３　ｒｅ　）のアスパルター
ゼ活性を有する固定化ニジエリシア・コリｓｃ＋、ｓｙ
（湿菌叡Ｆｊ）を得た。この固定化菌体１グのアスパル
ターゼ活性は８６．１μｍｏｌθ８　／ＦＬｒであった
。

１２）　　上記で得た固定化ニジエリシア・コリ５９゜
５グを外套管付カラム（４ａｍ　Ｘ　８　ａｎ　）に充
填し。

３７℃にて４８時間インキュベートすることにより活性
化（アスパルターゼ活性、１６２０００μｍ０１ｅａ　
／ｈｒ　）後、同温度にてＩＭ−／７−ル酸アンモニウ
ム溶液（ｐ）１８．５．１−塩化マグネシウム含有）る
ことによりＬ−アスパラギン酸１２０５’を得た実施例
７ ら （１）　　実施例椿で用いた培地１１！１こニジエリシ
ア・コ＋１　ａＡｐｃ−１３０を１ａｔＪＬ−実施例３
と同様にして固定化ニジエリシア・コリ６０ｙ（湿噛直
ｆａ）を得た。この固定化菌体ｌグのＴスノ櫂ルターゼ
活性は１１４．５μｌ１ｌｌＯ１ｅ／ｈｒであった。

ζ２）上記（１）で得た固定化ニジエリシア・コリ６０
７を外套管付カラム（４Ｇ×８１）に充填し。

３７℃にて４８時間インキュベートすることによす活性
化（アスパルターゼ活ｇｌ　、　２０６１００μωＯ１
ｅ／ｆＬｒ）後、同温度にてＩＭフマール酸アンモニウ
ム溶欣（ρｔ１３，５，１ηＬＭ塩比マグネシウム含有
〕１０００−を５０　ｍｌ／ｈｒの流速で流下し１こ。

流出液をｐ）ｌ　２．８とすることにより結晶を析出さ
せた。≠、・−−析出晶 をろ取することによりムーアスパラギン酸１２１ｖ　８
　得　に。

自発手続゛補正書 昭和９年く」２６日 特許庁長官殿 ２、発明の名称 ３、補市をする者 事件との関係　特許出願人 大阪府大阪市東区道修町３丁目２１番地（〒５４１）（
２９５）ｎ１辺製薬株式会社 代表者松原一部 ４、代理人 大ｗｉ、Ｍｆ大阪市淀用区加島３丁［＋６ＪＨ＋９号（
〒５３２）５、補正により増加する発明の数 補　　旧　　の　　内　　容 １、明細書第６頁３行目、同第１２頁下から４乃至３行
目の 「微工研菌寄第６７９２号」　を 「微工研条寄第３８８号」　に訂正する。

２、同＠６頁４乃至５行目、同第１２頁下から２行目の 「政工研菌寄第６７９３号」　を 「微工研条寄第３８９号」　に訂正する。

３、同第６頁６行目、同第１５頁４乃至５行目の「微工
研菌寄第６７９４号」　を 「微工研条寄＠３９０号」　に訂正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ＋１）　　ニジエリシア属に属し、アスパルターゼ活性
   を有する親株より誘導され、かつＬ−７スパラギン酸を
   唯一の窒素源とするか、或いは窒素源および炭素源とす
   る培地で生育する高アスパルターゼ活性を有する変異株
   の培養液、該培養液から採取した菌体もしくは該菌体の
   処理物をフマール酸とアンモニアに作用させることを特
   徴とするＬ−アスパラギン酸の製法。 （２）　　変異株がアスパルターゼ活性を有する親株よ
   り誘導され、かつＬ−了スパルギン酸を唯一の窒素源と
   するか、或いは窒素源および炭素源とする培地で生育す
   る高アスパルターゼ活性を有するニジエリシア・コリで
   ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 １３）　　７マール酸とアンモニアをフマール酸アンモ
   ニウムとして供給する特許請求の範囲第１項記載の方法
   。