JPS6254471B2 - - Google Patents

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JPS6254471B2
JPS6254471B2 JP60036231A JP3623185A JPS6254471B2 JP S6254471 B2 JPS6254471 B2 JP S6254471B2 JP 60036231 A JP60036231 A JP 60036231A JP 3623185 A JP3623185 A JP 3623185A JP S6254471 B2 JPS6254471 B2 JP S6254471B2
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JP
Japan
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lactase
cells
protease
solution
aqueous solution
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JP60036231A
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Maikeru Fuenton Denisu
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Original Assignee
Pfizer Inc
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Publication date
Application filed by Pfizer Inc filed Critical Pfizer Inc
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Publication of JPS6254471B2 publication Critical patent/JPS6254471B2/ja
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
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    • C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はラクターゼ調製物の精製に関連してい
る。ラクターゼ又はベータ−ガラクトシダーゼは
ラクトースをグルコースとガラクトースに加水分
解するのに効果的な酵素である。従つてラクター
ゼは酪農工業において有益である。例えばチーズ
製造においてチーズ乳にラクターゼを添加する
と、ラクトース加水分解の速度がはやまり熟成時
間が短縮され、生成能が増加し、改良された生成
物ができる。ラクターゼは又、ラクトースに対し
生理的に不耐性の人に投与するのに有益である。 ラクターゼは従来の醗酵法で容易に生産される
数種の微生物における細胞内成分である。これら
の微生物の例としては、クルイベロマイセス
（Kluyveromyces）（従来からサツカロマイセス
（Saccharomyces）と考えられていたもの）属、
特にクルイベロマイセス フラギリス
（Kluyveromyces Fragilis）、クルイベロマイセ
ス ラテイス（Kluyveromyces latis）、の種及
び、カンジダ（Candida）、トルーラ（Torula）
またはトルロピス（Torulopis）の属である。過
去においてこのような微生物の細胞は、適当な栄
養培地中で培養し、収穫し乾燥した後全乾燥細胞
を、目的の適応物にラクターゼ活性を与えるため
に用いられた。この方法は、他の細胞成分もチー
ズ乳に加えられる事になり、望ましくない味と香
りを与えてしまうので良い方法ではない。この問
題点を克服するための従来の方法は、細胞の内部
からラクターゼを放出させる方法であり、特に細
胞壁をホモジエナイズ、粉砕、又は化学的な手段
を用いて破壊していた。しかしながら、これらの
方法は一般に長時間を必要とし、高価であつて、
この方法によりラクターゼばかりでなく他の細胞
内酵素、タンパク質及びそれらの分解生成物等も
放出されるためラクターゼを分離せねばならな
い。この点に関して、微生物細胞から分子内ラク
ターゼの放出においてプロテアーゼも同時に放出
され、このラクターゼ調製物中からプロテアーゼ
活性を除去するのが困難であるという問題があつ
た。チーズ熟成を促進させるためにチーズ乳に加
えたラクターゼ調製物中にプロテアーゼが混在し
ていれば、乳タンパク質のタンパク分解によりペ
プチドが形成されるために、不快な苦味で香りの
ないものが生成してしまう。従つて、上述の見解
において、微生物中からラクターゼを放出せしめ
る改良法が必要であり、更に、こうして製したラ
クターゼ調製物の精製、とくにラクターゼ調製物
中からプロテアーゼ活性を選択的に除去する方法
が必要である。 ラクターゼ含有イースト細胞からラクターゼ
を、好収率で、しかも比較的短時間で好純度で放
出せしめる方法は下記工程からなる。すなわち(a)
ラクターゼ含有イースト細胞を、約20〜95重量パ
ーセントの、炭素数１−４のアルキル、各アルキ
ルが炭素数１−４のジアルキルケトン、より選ん
だ化合物（この場合、上述の細胞とアルコール又
はケトンの全重量に基ずく濃度である）と、約５
〜35℃、（20〜30℃が良好）で接触せしめる。(b)
アルコール又はケトン処理細胞をPH約5.5〜8.0
（約6.4〜7.0が良好）を有する水溶液と約５〜35
℃（約20〜30℃が良好）で接触せしめる。工程(a)
で用いる良好な化合物はメタノール、エタノー
ル、イソプロパノール、又はそれらの混合物で、
最も良好なものは、エタノールである。アルコー
ル又はケトンは全重量の約60〜90重量パーセント
の範囲で用いる。この方法に用いる良好なイース
ト細胞は、次の属のものである。すなわち、クル
イベロマイセス（Kluyveromyces）、カンジダ
（Candida）、トルーラ（Torula）である。良好な
種は、クルイベロマイセス フラギリス
（Kluyueromyces fragilis）、クルイベロマイセ
ス ラクテイス（Kluyveromyces lactis）、ト
ルーラ クレモリス（Torula cremoris）、カン
ジダ プソイドトロピカリス（Candida
pseudotropicalis）である。 本発明はラクターゼ調製物を含有する水溶液を
約30〜90重量パーセント（40〜60重量パーセント
が良好）のグリセロール（水−グリセロール溶液
の全重量に基づいた濃度）と約35〜60℃（45〜55
℃が良好）で、PH約5.5〜8.0（6.4〜7.0が良好）
で、プロテアーゼ活性が本質的に無くなるまで加
熱する事を特徴とするプロテアーゼ含有ラクター
ゼ調製物中よりプロテアーゼ活性を選択的に無く
す方法を供給する。もしも必要なら、水−グリセ
ロール溶液にマンガンイオンを10-4〜10-2濃度で
加え、加熱工程中のラクターゼの安定性を高める
事ができる。 本発明の方法は、この分野で良く知られたラク
ターゼ含有イースト細胞から放出せしめたラクタ
ーゼを精製するのに利用する事ができる。適当な
微生物は、クルイベロマイセス
（Kluyveromyces）属、特にクルイベロマイセス
フラギリス（Kluyveromyces fragilis）、一般
にカルチヤーコレクシヨンより入手できるような
多くの菌株、例えば、クルイベロマイセス フラ
ギリス（Kluyveromyces fragilis）
ATCC10022、ATCC8608、ATCC8582、
ATCC12424、及びクルイベロマイセス ラクテ
イス（Kluyveromyces lactis）である。ラクタ
ーゼを放出せしめる事のできる他の微生物はカン
ジダ（Candida）、トルーラ（Torula）の属で特
に、米国カリフオルニア州のカリフオルニア大学
デービス校から一般に入手できる培養番号
UCD55−31の株菌であるトルーラ クレモリス
（Torula cremoris）である。良好なイースト細
胞はクルイベロマイセス（Kluyveromyces）
属、特にクルイベロマイセス フラギリス
（Kluyveromyces fragilis）、クルイベロマイセ
ス ラクテイス（Kluyveromyces lactis）、ト
ルーラ クレモリス（Torula cremoris）、カン
ジダ プソイドトロピカリス（Candida
pseudotropicalis）の種である。これら既知で、
一般に入手できるものの変異株で、従来のＸ線照
射、UV光照射、ナイトロ−ジエンマスタード処
理して得るような変異株を用いるのも良好である
事を理解されたい。 ラクターゼ含有イースト細胞は一般に、適当な
栄養培地、例えば、ラクトーズ含有の水性培地
で、リン酸アンモニウム、リン酸カリウム、等の
リン、窒素及びカルシウム源と共に乳しようを含
んだ培地中通気培養することにより得られる。こ
のような栄養培地はこの分野に精通する者にとつ
てはよく知られた培地である。 この分野で既知の従来からの醗酵法を用い、イ
ースト細胞を、十分な濃度の細胞がこの栄養培地
中で得られるまで培養する。例えば、栄養培地
中、約20〜35℃（25℃〜35℃が良好）で約48〜
100時間培養する。次に細胞を、過又は遠心分
離等の方法で取る。 分子内ラクターゼを放出せしめるために、初
め、イースト細胞を炭素数１−４のアルキルアル
コール、炭素数１−４のアルキル基を持つジアル
キルケトンと、５℃〜35℃（20℃〜30℃が良好）
で接触せしめる。アルコール又はケトンは、細胞
とアルコール又はケトンの全重量に基づき、20〜
90重量パーセント（60〜90重量パーセントが良
好）濃度用いる。細胞はアルコール、又はケトン
と２分〜20時間（30分〜２時間）接触せしめる。
次にアルコール又はケトンを細胞から、細胞の
過、溶媒留去、凍結乾燥等により分離する。しか
しアルコール、ケトンを約75〜80重量パーセント
以下用いた場合、アルコール又はケトンの除去は
本質的でなく、この細胞を次の工程で、アルコー
ル又はケトンの存在のまま、PH約5.5〜8.0の水溶
液と処理する事ができる。 上記方法において、細胞をアルキルアルコー
ル、又はジアルキルケトンと処理する場合、これ
はアルコール又はケトンにより分子内ラクターゼ
を溶媒抽出するのではない事を認められたい。本
方法の条件下では、ラクターゼは、殆んど、アル
コールやケトンにより細胞中から抽出されない。
本方法の機構を理論と結びつけるつもりはないが
アルコール又はケトンは、細胞壁の透過性をより
良くし、以後に述べる如くPH約5.5〜8.0の水溶液
中に細胞を懸濁させた場合に分子内ラクターゼを
放出せしめるように作用するものと考えられる。 上述の如くアルコール又はケトンと処理した後
アルコール又は、ケトン−処理細胞をPH約5.5〜
8.0の水溶液（約6.4〜7.0が良好であり6.6が最も
良い）中に懸濁せしめる。この場合、例えば、
0.1Mリン酸ナトリウム又はカリウム水溶液又は
0.1Mクエン酸−リン酸水溶液等の適当な緩衝液
を用いる方が良い。溶液は撹拌、振とう、等によ
りラクターゼの放出を促進させるのが良好であ
る。この溶液は約５℃〜35℃（20℃〜30℃）に保
つ。水溶液中の細胞の濃度は限定されないが１リ
ツトル中、約10〜80グラム（約30〜50グラム／リ
ツトルが良好）の範囲が良い。細胞は水溶液中に
懸濁させるが0.1Mリン酸ナトリウム、カリウム
等の緩衝液が良く、約１〜20時間、特に約10〜20
時間で放出によるラクターゼの収量が最大にな
る。これが約20時間以上になると酵素による微生
物分解が起きるためラクターゼの収量が悪くな
る。このようなラクターゼ損失は無菌条件下又は
防腐剤の使用で最少にする事ができる。ラクター
ゼは細胞から他の細胞内酵素又はタンパク質（例
えばプロテアーゼ）と共に水溶液中に放出される
が、これら、望ましくない細胞構成体の抽出量は
細胞壁を機械的に破壊するためのホモゲナイズ、
細胞の機械的粉砕等による従来のラクターゼ放出
法より本質的に少い。 細胞中から放出されるラクターゼの量は従来か
ら用いられている如くラクターゼ単位で測定され
る。ｏ−ニトロフエニル−ベータ−Ｄ−ガラクト
ピラノシド（ONPG）のｏ−ニトロフエニル
（ONP）及びＤ−ガラクトピラノシドへの分解速
度でラクターゼ単位を決定する。例えばウエンド
ルフ（Wendorf）等のJ.Milk Food Tech.34、
451（1971）を参照の事。さらに特異的に言え
ば、本発明の目的のために、0.1％牛血清アルブ
ミンを含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液７ml、
10-3M硫酸マンガン１水和物の水溶液１ml、
0.02MのONPG溶液２ml、検定用のラクターゼ含
有溶液、を混合して製した溶液中で420nｍでの
吸収を分光光度計で、ONPGの分解速度を決定す
る。検定は37℃で20分間行い、反応は２×
10-3MEDTAジナトリウム、を含む2M水酸化ア
ンモニウム水１mlを加えて止める。ラクターゼ単
位は420nｍでの吸収における変化により決定す
る。１ラクターゼ単位は１分間に生成するONP
の１マイクロモルに等しい。溶液中のプロテアー
ゼの量は、同様に、本発明の目的のために、染色
コラーゲンポリマーであるアゾコールの分解速度
として測定したプロテアーゼ単位として表わされ
る。例えばヘイム（Heym）によるArch.
Biochem.Biophys.127、89（1962）の報告を参照
せよ。さらに特異的に言えば、アゾコールの分解
速度は分光光度計を用い520nｍの吸収変化を３
mlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、10mlのアゾ
コール、１mlのプロテアーゼ含有検定溶液の混合
により製した溶液中で測定して決定する。この溶
液を37℃で30分間振とうしてインキユベートし、
残りのアゾコールを過して反応を止める。次に
１分間当りの520nｍにおける吸光度の変化から
プロテアーゼ単位を決定する。 イースト細胞中から抽出水溶液中にラクターゼ
及び少量のプロテアーゼ及び他のタンパク質が放
出された後、残りの固形細胞物質を過して除き
ラクターゼと少量のプロテアーゼ不純物を含む溶
液を得る。必要ならラクターゼは従来の、凍結乾
燥、アセトンの如き非溶媒を加えてラクターゼを
沈澱させるか蔗糖を加えてスプレー乾燥等の方法
で単離する事ができる。しかしこれらの方法で単
離したラクターゼはプロテアーゼ不純物を含んで
おり、これをチーズ製造に用いると望ましくない
香と味になる事は明らかである。従つて、イース
ト細胞から本発明の方法で得たラクターゼは上述
の如くプロテアーゼ活性を除かねばならない。 本発明によれば、これらプロテアーゼ活性はプ
ロテアーゼ不純物を含むラクターゼ調製物の水溶
液を約30〜90重量パーセントのグリセロール（こ
の場合水−グリセロール溶液の全重量にもとずく
濃度）と約35〜60℃でPH約5.5〜8.0で加熱して除
く事ができる。それ故、アルコール−又はケトン
−処理イースト細胞から上述の方法に従つて得た
ラクターゼ及びプロテアーゼ不純物を含む水溶液
はグリセロールを加え、加熱する事によつて、水
溶液中からラクターゼを単離せずに直接精製する
事ができる。精製工程における水−グリセロール
溶液中のラクターゼの濃度は限定されないが一般
的には１ml当り約1000〜25000ラクターゼ単位
（約2000〜25000単位／mlが良好）の範囲である。
それ故、前述のアルコール−又はケトン−処理細
胞の抽出工程で得た、ラクターゼ含有水溶液はグ
リセロールを加える前に、濃縮して適当な濃度に
するのが良い。 精製工程は約45〜55℃でPH6.4〜7.0（約6.6が最
も良好である）にて行うのが良く、この条件下で
はラクターゼは安定である。精製工程でのラクタ
ーゼの安定性は、もし必要なら、例えば塩化マン
ガン、硝酸マンガン、硫酸マンガン等可溶性二価
マンガン塩を、10-4〜10-2Mマンガンイオン濃度
にするのに十分な量加えると、これが促進され
る。 ラクターゼ含有水−グリセロール溶液はプロテ
アーゼ活性が本質的に減少するまで加熱する。こ
れに必要な時間は反応温度に依存するが、一般に
は、60℃で約３時間〜35℃で約10日間であり、50
℃で約６〜12時間が最適である。この条件下でプ
ロテアーゼ不純物は急速に不活性化され、プロテ
アーゼ活性は初期の10％以下になる。これに比し
てラクターゼはグリセロールで選択的に安定化さ
れ、マンガンイオンを加えると、初期のラクター
ゼ活性の90％以上が保持される。加熱中に、不活
性化されたプロテアーゼを含む不活性化されたタ
ンパク質の沈澱ができ、これを例えば過して除
き目的のラクターゼ精製溶液を得る。ラクターゼ
は所望なら溶液から慣用的な方法により単離する
ことができる。 グリセロールの存在下で加熱する事によりプロ
テアーゼ活性を選択的に減少せしめる、上述の精
製工程は、アルコール又はケトンでイースト細胞
を処理し、PH5.5〜8.0で水溶液中に抽出せしめて
得たラクターゼの精製には特に適当である事は明
白である。しかしプロテアーゼ活性を選択的に減
少せしめるこの方法は、上述以外の方法、例えば
従来の機械的破壊又はホモゲナイズ等により得た
ラクターゼ調製物中のプロテアーゼ活性を減ずる
のに用いることができる。 本発明は次の実施例で例示するが、本発明はこ
れらの実施例の特異的詳細に限定するものでない
ことを理解されたい。 参考例 １ 米国カリフオルニア州、カリフオルニア大学デ
ービス校、から得た培養番号UCD55−31のトル
ーラ クレモリス（Torula cremoris）（カンジ
ダ プソイドトロピカリス（Candida
pseudtropicalis）を次に示す組成の栄養培地１
リツトル中に接種し12時間28℃で培養する。 乳しよう 40.0ｇ／ （NH4）2SO4 5.0〃 K2HPO4 5.0〃 トウモロコシ浸出液 1.0〃 MgSO4・7H2O 0.5〃 硫酸でPH4.5に調節しオートクレーブ中110℃で
45分間滅菌する。 14リツトルフアーメンター中に８リツトルの次
の組成の培地を入れる。 KH2PO4 1.8ｇ／ NH4H2PO4 1.0〃 （NH4）2HPO4 1.0〃 MgSO4・7H2O 0.1〃 FeSO4・7H2O 5.0mg／ MnSO4・7H2O 5.0〃 これを121℃、30分間滅菌し上述の前培養菌を
入れる（10％ｖ／ｖ）。 組 成： ラクトーズ 363ｇ／ イースト抽出物 6.0ｇ／ トウモロコシ浸出液 3.0ｇ／ ニコチン酸 6.0mg／ を有する培地（2.6リツトル）を110℃で45分間滅
菌し、これを60時間以上連続的に加えて培養す
る。溶存酸素は培養中空気を送り込み0.5容量／
容量／分から0.75容量／容量／分に増加させ、撹
拌を310RPMから380RPMに増加させる事により
約10％に保つ。培養温度は30℃でPHは4.5に保
つ。 60時間後、細胞濃度は18ｇ／、細胞中のラク
ターゼ含量は4200単位／グラムである。ラクター
ゼの多くなつた細胞を過して取る。 上述の培養から得た1.8グラムの細胞を含むイ
ースト細胞ペーストを6.3グラムのエタノールで
処理する。90分後エタノールを過して除き、細
胞を0.1Mリン酸カリウム緩衝液、PH6.6、中に再
び懸濁せしめる。この緩衝液中の細胞濃度は40
ｇ／に調節する。エタノール処理細胞を抽出緩
衝液中で15時間撹拌してラクターゼを放出せしめ
る。次に、抽出した細胞をラクターゼに富む緩衝
液中から過して除き、約６mg／mlタンパク質と
65単位／mlのラクターゼ活性を有する酵素溶液を
最終的に得る。収率は培養して得た細胞の分子内
ラクターゼ含有量に、もとづき45％である。 参考例 ２ 参考例１で用いたエタノールによる細胞処理の
代りに、他のアルコール類又はケトン類を用い、
実施例１で得た他の細胞群で、参考例１の方法を
くり返し次の結果を得た。 【表】 【表】 参考例 ３ 参考例１で述べた方法に従い、細胞をエタノー
ルで処理し0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液で抽出
する事によるラクターゼ放出を菌株クルイベロマ
イセス フラギリス（Kluyveromyces
fragilis）を用いて行う。２リツトルフラスコ
中、参考例１の接種培地１リツトル中で30℃、24
時間培養し、細胞を過して取る。細胞1.5グラ
ムを参考例１の方法に従いエタノール処理し、次
に0.1Mリン酸カリウム緩衝液で抽出して放出せ
しめたラクターゼの量は次のとおりである。 【表】 実施例 １ 3000単位／mlのラクターゼ、0.24プロテアーゼ
単位／ml及び硫酸マンガンとして加えた10-3Mマ
ンガンイオンを含む３リツトルの１：１グリセロ
ール：0.1Mリン酸カリウム溶液（PH6.6）を50℃
で６時間加熱する。加熱中に不活性化したタンパ
ク質の白色沈澱ができ、これを過して除く。溶
液中に残存するプロテアーゼ活性は0.03単位／ml
であり初期のプロテアーゼ活性の90％が除去され
た事を示す。これに比べ、溶液中のラクターゼ活
性は、2760単位／mlであり、初期のラクターゼ活
性の90％以上が保持されている事を表わしてい
る。 実施例 ２ 実施例１の方法を用い温度を50℃の代りに37℃
で行う。９日間加熱後、初期のプロテアーゼ活性
の90％が除去され、初期のラクターゼ活性の95％
（2850単位／ml）が保持される。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ プロテアーゼ含有ラクターゼ調製物及びグリ
    セロール約30〜90重量パーセント（溶液の全重量
    に基づく）を含有する水溶液を約35℃〜約60℃で
    PH約5.5〜８にてプロテアーゼ活性が充分に低下
    するまで加熱することを特徴とするプロテアーゼ
    含有ラクターゼ調製物中からプロテアーゼ活性を
    選択的に低下せしめる方法。 ２ 温度が約45〜約55℃であり上記溶液中のグリ
    セロール濃度が約40−60重量パーセントで、PHが
    約6.4〜7.0である特許請求の範囲第１項の方法。 ３ 上記溶液がマンガンイオンを10-4〜10-2モル
    の濃度で含有する特許請求の範囲第１項の方法。
JP3623185A 1980-03-24 1985-02-25 ラクタ−ゼ調製物の精製方法 Granted JPS6128389A (ja)

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US06/133,036 US4329429A (en) 1980-03-24 1980-03-24 Lactase preparation
US133036 1980-03-24

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JPS6128389A JPS6128389A (ja) 1986-02-08
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