JPS5910191B2 - ラクタ−ゼ調製物の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はラクターゼの調製及び精製に関連している。

ラクターゼ又はベーターガラクトシダーゼはラクトース
をグルコースとガラクトースに加水分解するのに効果的
な酵素である。

したがってラクターゼは酪農工業において有益である。

例えばチーズ製造においてチーズ乳にラクターゼを添加
すると、ラクトース加水分解の速度がはやまり熟成時間
が短縮され、生成能が増加し、改良された生成物が出来
る。

ラクターゼは又、ラクトースに対し生理的に不耐性の人
に投与するのに有益である。

ラクターゼは従来の醗酵法で容易に生産される数種の微
生物における細胞内成分である。

これらの微生物の例としては、クルイベロマイセス（
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ） （従来からサツカロ
マイセス（ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ）と考えら
れていたもの）属、特にクルイベ口マイセス フラギリ
ス（ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ
） 、クルイベロマイセス ラテイス（ Ｋｌｕｙｖ
ｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｔｉｓ ）、の種及び、カンジ
ダ（ Ｃａｎｄｉｄａ ）、トルーラ（ Ｔｏｒｕｌａ
）またはトルロピス（ Ｔｏｒｕｌｏｐｉｓ ）の属
である。

過去においてこのような微生物の細胞は、適当な栄養培
地中で培養し、収穫し乾燥した後全乾燥細胞を、目的の
適応物にラクターゼ活性を与えるために用いられた。

この方法は、他の細胞成分もチーズ乳に加えられる事に
なり、望ましくない味と香りを与えてしまうので良い方
法ではない。

この問題点を克服するための従来の方法は、細胞の内部
からラクターゼを放出させる方法であり、特に細胞壁を
ホモジエナイズ、粉砕、又は化学的な手段を用いて破壊
していた。

しかしながら、これらの方法は一般に長時間を必要とし
、高価であって、この方法によりラクターゼばかりでな
く他の細胞内酵素、タンパク質及びそれらの分解生成物
等も放出されるためラクターゼを分離せねばならない。

この点に関して、微生物細胞から分子内ラクターゼの放
出においてグロテアーゼも同時に放出され、このラクタ
ーゼ調製物中からプロテアーゼ活性を除去するのが困難
であるという問題があった。

チーズ熟成を促進させるためにチーズ乳に加えたラクタ
ーゼ調製物中にプロテアーゼが混在していれば、乳タン
パク質のタンパク分解によりペフチドが形成されるため
に、不快な苦味で香りのないものが生成してしまう。

したがって、上述の見解において、微生物中からラクタ
ーゼを放出せしめる改良法が必要であり、さらに、こう
して製したラクターゼ調製物の精製、特にラクターゼ調
製物中からプロテアーゼ活性を選択的に除去する方法が
必要である。

本発明はラクターゼ含有イースト細胞からラクターゼを
、好収率で、しかも比較的短時間で好純度で放出せしめ
るだめの改良法を供給する。

この方法は以下の事を特徴としている。

すなわ’Ｍａ）ラクターゼ含有イースト細胞を、約２０
〜９５重量パーセントの、炭素数１−４のアルキル、各
アルキルが炭素数１−４のジアルキルケトン、より選ん
だ化合物（この場合、上述の細胞とアルコール又はケト
ンの全重量に基ずく濃度である。

）と、約５°〜３５℃、（２０°〜３０℃が良好）で接
触せしめる。

（ｂ）アルコール又はケトン処理細胞をｐＨ約５．５〜
８．０（約６．４〜７．０が良好）を有する水溶液と約
５°〜３５℃（約２０°〜３０゜Ｃが良好）で接触せし
める。

工Ｓａ）で用いる良好な化合物はメタノール、エタノー
ル、イソプロパノール、又はそれらの混合物で、最も良
好なものは、エタノールである。

アルコール又はケトンは全重量の約６０〜９０重量パー
セントの範囲で用いる。

この方法に用いる良好イースト細胞は、次の属のもので
ある。

すなわち、クルイベ口マイセス（ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍ
ｙｃｅｓ ）、カンジダ（ Ｃａｎｄｉｄａ ）、トル
ーラ（ Ｔ ｏｒｕｌａ ）である。

良好な種は、クルイベロマイセス フラギリス（ Ｋｌ
ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ ） 、クル
イベロマイセス ラクテイス（ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ）、トルーラ クレモリス（
Ｔｏｒｕｌａ ｃｒｅｍｏｒｉｓ ）、カンジダ プソ
イドトロピカリス（ Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔ
ｒｏｐｉｃａｌｉｓ ）である。

本発明はさらにラクターゼ調製物を含有する水溶液を約
３０〜９０重量パーセント（４０〜６０重量パーセント
が良好）のグリセロール（水一グリセロール溶液の全重
量に基づいた濃度）と約３５°〜６０℃（４５°〜５５
℃が良好）で、ｐＨ約５．５〜８．０（６．４〜７．０
が良好）で、プロテアーゼ活性が本質的に無くなるまで
加熱する事によってプロテアーゼ含有ラクターゼ調製物
中よりプロテアーゼ活性を選択的に無くすことを包含す
る方法を供給する。

もしも必要なら、水−グリセロール溶液にマンガンイオ
ンを１０−４〜１０−２濃度で加え、加熱工程中のラク
ターゼの安定性を高める事が出来る。

本発明の方法は、この分野で良《知られたラクターゼ含
有イースト細胞から、ラクターゼを放出せしめるのに利
用する事が出来る。

適当な微生物は、クルイベ口マイセス（ Ｋｌｕｙｖｅ
ｒｏｍｙｃｅｓ ）属％Ｋクルイベロマイセス フラキ
リス （ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ
） 、一般にカルチャーコレクションより入手出来るよ
うな多くの菌株、例えば、クルイベロマイセス フラギ
リス（ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉ
ｓ ）Ａ Ｔ Ｃ Ｃ ８ ６ ０ ８、ＡＴＣＣ８５
８２、ＡＴＣＣ１２４２４、及びクルイベロマイセス
ラクテイス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏ ｍｙｃｅｓｌａｃｔｉ
ｓ ） である。

本方法でラクターゼを放出せしめる事の出来る他の微生
物はカンジダ （ Ｃａｎｄｉｄａ ）、トルーラ（ Ｔｏｒｕｌａ
）の属で特に、米国カリフォルニア州のカリフォルニア
大学デービス校から一般に入手出来る培養番号ＵＣＤ５
５−３１株菌であるトルーラ クレモリス （ Ｔｏｒｕｌａ ｃｒｅｍｏｒｉｓ ）である。

本方法に用いる良好なイースト細胞はクルイベロマイセ
ス（ Ｋ ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ）属、特にクル
イベロマイセス フラギリス（ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ）、クルイベロマイセス
ラクテイス （ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ）、
トルーラ クレモリス（ Ｔｏｒｕｌａ ｃｒｅｍｏｒ
ｉｓ ）、カンジダ プソイドトロピカリス（ Ｃ ａ
ｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ）の
種である。

これら既知で、一般に入手出来るものの変異株で、従来
のＸ線照射、ＵＶ光照射、ナイトロージエンマスタード
処理して得るような変異株においても本方法を用いるの
が良好である事を理解されたい。

ラクターゼ含有イースト細胞は一般に、適当な栄養培地
、例えば、ラクトーズ含有の水性培地で、リン酸アンモ
ニウム、リン酸カリウム、等のリン及び窒素源と共に乳
しようを含んだ培地である。

このような栄養培地はこの分野に精通する者にとっては
よく知られた培地である。

この分野で既知の従来からの醗酵法を用い、イースト細
胞を、十分な濃度の細胞がこの栄養培地中で得られるま
で培養する。

例えば、栄養培地中、約２０°〜３５℃（２５℃〜３５
℃が良好）で約４８〜１００時間培養する。

次に細胞を、沢過又は遠心分離等の方法で取る。

分子内ラクターゼを放出せしめるために、初め、イース
ト細胞を炭素数１−４のアルキルアルコール、炭素数１
−４のアルキル基を持つジアルキルク゛トンと、５℃〜
３５℃（２０℃〜３０℃が良好）で接触せしめる。

アルコール又はケトンは、細胞とアルコール又はケトン
の全重量に基づき、２０〜９０重量パーセン｝（６０〜
９５重量パーセントが良好）濃度用いる。

細胞はアルコール、又はケトンと２分〜２０時間（３０
分〜２時間）接触せしめる。

次にアルコール又はケトンを細胞から、細胞のｆ過、溶
媒留去、凍結乾燥等により分離する。

しかしアルコール、ケトンを約７５〜８０重量パーセン
ト以下用いた場合、アルコール又はケトンの除去は本質
的でなく、この細胞を次の工程で、アルコール又はケト
ンの存在のまま、ｐＨ約５．５〜８．０の水溶液と処理
する事が出来る。

本発明の方法に従って、細胞をアルキルアルコール、又
はジアルキルケトンと処理する場合、これはアルコール
又はケトンにより分子内ラクターゼを溶媒抽出するので
はない事を認められたい。

本方法の条件下では、ラクターゼは、ほとんど、アルコ
ールやケトンにより細胞中から抽出されない。

本方法の機構を理論と結びつげるつもりはないがアルコ
ール又はケトンは、細胞壁の透過性をより良くし、以後
に述べる如＜ｐＨ約５．５〜８．０の水溶液中に細胞を
懸濁させた場合に分子内ラクターゼを放出せしめるよう
に作用するものと考えられる。

上述の如くアルコール又はケトンと処理した後アルコー
ルー又は、ケトンー処理細胞をｐＨ約５．５〜８．０の
水溶液（約６．４〜７．０が良好であり６，６が最も良
い）中に懸濁せしめる。

この場合、例えば、０．１Ｍリン酸ナトリウム又はカリ
ウム水溶液又は０．１Ｍクエン酸−リン酸水溶液等の適
当な緩衝液を用いる方が良い。

溶液は攪拌、振とう、等によりラクターゼの放出を促進
させるのが良好である。

この溶液は約５℃〜３５℃（２０℃〜３０℃）に保つ。

水溶液中の細胞の濃度は限定されないが１リットル中、
約１０〜８０グラム（約３０〜５０グラム／リットルが
良好）の範囲が良い。

細胞は水溶中に懸濁させるが０． １ Ｍ ！Ｊン酸ナ
トリウム、カリウム等の緩衝液が良く、約１〜２０時間
、特に約１０〜２０時間で放出によるラクターゼの収量
が最大になる。

これが約２０時間以上になると酵素による微生物分解が
起きるためラクターゼの収量が悪くなる。

このようなラクターゼ損失は無菌条件下又は防腐剤の使
用で最少にする事が出来る。

ラクターゼは細胞から他の細胞内酵素又はタンパク質（
例えばプロテアーゼ）と共に水溶中に放出されるが、こ
れら、望まし《ない細胞構成体の抽出量は細胞壁を機械
的に破壊するためのホモゲナイズ、細胞の機械的粉砕等
による従来のラクターゼ放出法より本質的に少い。

細胞中から放出されるラクターゼの量は従来から用いら
れている如くラクターゼ単位で測定される。

本発明の目的のためには、０−ニトロフエニルーベータ
ーＤ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）の０−ニトロフ
エニル（ＯＮＰ）及びＤ−ガラクトピラノシドへの分解
速度でラクターゼ単位を決定する。

例えばウエンドルフ（ Ｗｅｎｄｏｒｆ ）等のＪ．Ｍ
ｉｌｋＦｏｏｄＴｅｃｈ．３ ４、４５１（１９７１）
を参照の事。

さらに特異的に言えば、本発明の目的のために、０．１
％牛血清アルブミンを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝
液７−、１０ ”Ｍ硫酸マンガン１水和物の水溶液１
ｍｌ，０．０２ＭのＯＮＰＧ溶液２ｍｌ、検定用のラク
ターゼ含有溶液、を混合して製した溶液中で４２０ｎｍ
での吸収を分光光度計で、ＯＮＰＧの分解速度を決定す
る。

検定は３７℃で２０分間行い、反応は２Ｘ１０−３ＭＥ
ＤＴＡジナトリウム、を含む２Ｍ水酸化アンモニウム水
１ ｍｌを加えて止める。

ラクターゼ単位は４２０ｎｍでの吸収における変化によ
り決定する。

１ラクターゼ単位は１分間に生成するＯＮＰの１マイク
ロモルに等しい。

溶液中のプロテアーゼの量は、同様に、本発明の目的の
ために、染色コラーゲンポリマーであるアゾコールの分
解速度として測定したグロテアーゼ単位として表わされ
る。

例えばヘイム（Ｈｅｙｍ）によるＡｒｃｈ ．１３ ｉ
ｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ， １ ２ ７、８９（１
９６２）の報告を参照せよ。

さらに特異的に言えば、アゾコールの分解速度は分光光
度計を用い５２０ｎｍの吸収変化を３ｍｌの０．１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液、１０ｍｌのアゾコール、ｌｍｌ
のグロテアーゼ含有検定溶液の混合により製した溶液中
で測定して決定する。

この溶液を３７℃で３０分間振とうしてインキユベート
し、残りのアゾコールを沢過して反応を止める。

次に１分間当りの５２０ｎｍにおける吸光度の変化から
プロテアーゼ単位を決定する。

イースト細胞中から抽出水溶液中にラクターゼ及び少量
のプロテアーゼ及び他のタンパク質が放出された後、残
りの固形細胞物質を沢過して除きラクターゼと少量のプ
ロテアーゼ不純物を含む溶液を得る。

必要ならラクターゼは従来の、凍結乾燥、アセトンの如
き非溶媒を加えてラクターゼを沈澱させるか蔗糖を加え
てスプレー乾燥等の方法で単離する事が出来る。

しかしこれらの方法で単離したラクターゼはプロテアー
ゼ不純物なを含んでおり、これをチーズ製造に用いると
望ましくない香と味になる事は明らかである。

したがって、イースト細胞から本発明の方法で得たラク
ターゼは上述の如くプロテアーゼ活性を除かねばならな
い。

これらプロテアーゼ活性はプロテアーゼ不純物を含むラ
クターゼ調製物の水溶液を約３０〜９０重量パーセント
のグリセロール（この場合水一グリセロール溶液の全重
量にもとすく濃度）と約３５°〜６０℃でｐＨ約５．５
〜８．０で加熱して除く事が出来る。

それ故、アルコールー又はケトンー処理イースト細胞か
ら本発明の方法に従って得たラクターゼ及びプロテアー
ゼ不純物を含む水溶液はグリセロールを加え、加熱する
事によって、水溶液中からラクターゼを単離せずに直接
精製する事が出来る。

精製工程における水一グリセロール溶液中のラクターゼ
の濃度は限定されないが一般的には１ｒｒＬｌ当り約１
０００〜２５０００ラクターゼ単位（約２０００〜２５
０００単位／ｒｒＬｌが良好）の範囲である。

それ故、前述のアルコールー又はケトンー処理細胞の抽
出工程で得た、ラクターゼ含有水溶液はグリセロールを
加える前に、濃縮して適当な濃度にするのが良い。

精製工程は約４５°〜５５℃でｐＨ６、４〜７．０（約
６．６が最も′良好である。

）にて行うのが良く、この条件下ではラクターゼは安定
である。

精製工程でのラクターゼの安定性は、もし必要なら、例
えば塩化マンガン、硝酸マンガン、硫酸マンガン等可溶
性二価マンガン塩を、１０−４〜１０−２Ｍマンガンイ
オン濃度にするのに十分な量加えると、これが促進され
る。

ラクターゼ含有水−グリセロール溶液はプロテアーゼ活
性が本質的に減少するまで加熱する。

これに必要な時間は反応温度に依存するが、一般には、
６０℃で約３時間〜３５℃で約１０日間であり、５０℃
で約６〜１２時間が最適である。

この条件下でプロテアーゼ不純物は急速に不活性化され
、プロテアーゼ活性は初期の１０％以下になる。

これに比してラクターゼはグリセロールで選択的に安定
化され、マンガンイオンを加えると、初期のラクターゼ
活性の９０％以上が保持される。

加熱中に、不活性化されたプロテアーゼを含む不活性化
されたタンパク質の沈澱が出来、これを例えば沢過して
除き目的のラクターゼ精製溶液を得る。

グリセロールの存在下で加熱する事によりプロテアーゼ
活性を選択的に減少せしめる、上述の精製工程は、アル
コール又はケトンでイースト細胞を処理し、ｐＨ５．５
〜８．０で水溶液中に抽出せしめて得たラクターゼの精
製には特に適当である事は明白であるしかしグロテアー
ゼ活性を選択的に減少せしめるこの方法は、他の方法、
例えば従来の機械的破壊又はホモゲナイズ等により得た
ラクターゼ調製物中のプロテアーゼ活性を減ずるのに用
いる事が出来る。

本発明は次の実施例で例示するが、本発明はこれらの実
施例の特異的詳細に限定するものでない事を理解された
い。

実施例 １ 米国カリフォルニア州、カリフォルニア大学デービス校
、から得た培養番号ＵＣＤ５５−３１のトルーラ クレ
モリス（ Ｔｏｒｕｌａ ｃｒｅｍｏｒｉｓ ）（カン
ジダ プソイドトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｐｓｅｕ
ｄｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ）を次に示す組成の栄養培地
１リットル中に接種し１２時間２８℃で培養する。

乳しよう ４０．０’？／７３（ＮＨ
，）２８０， ５．０ ／／Ｋ２ＨＰ
Ｏ４ ５．０ 〃トウモロコシ侵出
液 １．０〃 ＭｇＳ０４・７Ｈ２０ ０．５ ／／硫酸
でｐＨ４．５に調節しオートクレープ中１１０℃で４５
分間滅菌する。

１４リットルファーメンター中に８リットルの次の組成
の培地を入れる。

ＫＨ２ＰＯ４１． ８ ｒ ／ｌ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１．０〃 （ ＮＨ４ ） ２ ＨＰＯ４ １， Ｏ
ｔｔＭｇＳ０４・７Ｈ２０ ０．１ ／
／Ｆｅ ＳＯ４・７Ｈ２０ ５． Ｏ ｍ９
／ ｌＭｎＳＯ４ ・７Ｈ２０ ５．Ｏ
ｔｔこれを１２１℃、３０分間滅菌し上述の前培養菌を
入れる。

（１０％ｖ／ｖ）組成： ラクトーズ ３６３ ？／ｌイースト抽出
物 ６．Ｏｆ？／７３トウモロコシ侵出液
３．ｏ？／１ニコチン酸 ６．０
ダ／ｌを有する培地（２．６リットル）を１１０℃で４
５分間滅菌し、これを６０時間以上連続的に加えて培養
する。

溶存酸素は培養中空気を送り込み０．５容量／容量／分
から０．７５容量／容量／分に増加させ、攪拌を３１Ｏ
ＲＰＭから３ ８ Ｏ ＲＰＭに増加させる事により約
１０％に保つ。

培養温度は３０℃でｐＨは４．５に保つ。

６０時間後、細胞濃度は１８Ｓｉ’／Ｊ、細胞中のラク
ターゼ含量は４２００単位／グラムである。

ラクターゼの多くなった細胞を沢過して取る。

上述の培養から得た１．８グラムの細胞を含むイースト
細胞ペーストを６．３グラムのエタノールで処理する。

９０分後エタノールをＰ過して除き、細胞を０．１Ｍリ
ン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．６、中に再び懸濁せしめ
る。

この緩衝液中の細胞濃度は４０ｒ／Ｊに調節する。

エタノール処理細胞を抽出緩衝液中で１５分間攪拌して
ラクターゼを放出せしめる。

次に、抽出した細胞をラクターゼに富む緩衝液中から沢
過して除き、約６〜／ｒｎｌタンパク質と６５単位／ｍ
ｌのラクターゼ活性を有スる酵素溶液を最終的に得る。

収率は培養して得た細胞の分子内ラクターゼ含有量に、
もとずき４５％である。

実施例 ２ 実施例１で用いたエタノールによる細胞処理の代りに、
他のアルコール類又はケトン類を用い、実施例１で得た
他の細胞群で、実施例１の方法をくり返し次の結果を得
た。

ラクター ゼ活性 化合物 輔％（単位／ｍｌ ） メタノール ４５ ６６イソプロパノ
ール ３７ ５２ブタノール
１１．５ ｔ−ブタノール ４５ ６６アセトン
１０ １３メテルエチルケトン
１０ １３メチルイソブチルケトン ７．
５ １０？施例 ３ 実施例１で述べた方法に従い、細胞をエタノールで処理
し０． １ Ｍ ！Ｊン酸ナトリウム緩衝液で抽出する
事によるラクターゼ放出を菌株クルイベロマイセス フ
ラギリス（ Ｋ ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇ
ｉ ｌｉｓ ）を用いて行う。

２リットルフラスコ中、実施例１の接種培地１リットル
中で３０℃、２４時間培養し、細胞を沢過して取る。

細胞１．５グラムを実施例１の方法に従いエタノール処
理し、次に０，ＩＭリン酸カリウム緩衝液で抽出して放
出せしめたラクターゼの量は次のとおりである。

ラクターゼ 微 生 物 単位／ｗＬＩ Ｋ．フラギリス（ ｆｒａｇｉｌｉｓ ）
５，ＡＴＣＣ８６０８ Ｋ６フラギリス（ ｆｒａｇｉｌｉｓ ）
．５ＡＴＣＣ−８５８２ Ｋ．フラギリス（ ｆｒａｇｉｌｉｓ ）
１．ｓＡＴＣＣ１００２２ Ｋ．フラギリス（ ｆｒａｇｉｌｉｓ ）
２．ｏＡＴＣＣ １ ２ ４ ２４ 実施例 ４ ３０００単位／ｒ／Ｌｌのラクターゼ、０．２４グロテ
アーゼ単位／ｍｌ及び硫酸マンガンとして加えた１０−
３Ｍマンガンイオンを含む３リットルのｌ：１グリセロ
ール：０．１Ｍリン酸カリウム溶液を５０℃で６時間加
熱する。

加熱中に不活性化したタンパク質の白色沈澱が出来、こ
れを沢過して除く。

溶液中に残存するグロテアーゼ活性は０．０３単位／ｍ
ｌであり初期のグロテアーゼ活性の９０％が除去された
事を示す。

これに比べ、溶液中のラクターゼ活性は、２７６０単位
／ｍｌであり、初期のラクターゼ活性の９０％以上が保
持されている事を表わしている。

実施例 ５ 実施例４の方法を用い温度を５０℃の代りに３７゜Ｃで
行う。

９日間加熱後、初期のプロテアーゼ活性の９０％が除去
され、初期のラクターゼ活性の９５％（２８５０単位／
ｍｌ ）が保持される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １（ａ）ラクターゼ含有酵母細胞を炭素数１〜４のアル
   キルアルコール及び炭素数１〜４の各々のアルキル基を
   持つジアルキルケトンより選択した化合物約２０〜９５
   重量％（この場合用いた細胞と化合物の全重量に基づ《
   ）と５℃〜３０℃で接触せしめ、（ｂ）上述の細胞をｐ
   Ｈ約５．５〜８．０の水溶液と約５℃〜３５℃で接触せ
   しめ、得られたラクターゼ含有溶液から細胞を分離する
   ことを特徴とするラクターゼ含有イースト細胞中よりラ
   クターゼを放出せしめる方法。 ２ 上述の細胞がクルイベロマイセス （ Ｋ ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ）、カンジタ（
   Ｃａｎｄｉｃｈ ）またはトルーラ（ Ｔｏｒｕｌａ
   ）の属の細胞である特許請求の範囲第１項の方法。 ３ 上述の工ｍａ）及び（ｂ）の各々の温度が約２０℃
   〜３０℃、上述水溶液のｐＨが６．４〜７．０である特
   許請求の範囲第２項の方法。 ４ 上述の工程（ａ）の化合物がメタノール、エタノー
   ル、イソプロパノール又はそれらの混合物である特許請
   求の範囲第２項の方法。 ５ 上述の化合物が６０〜９０重量％のエタノールであ
   る特許請求の範囲第４項の方法。 ６ 上述の細胞がクルイベロマイセス フラギリス（
   Ｋ ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉ ｌｉｓ
   ） 、クルイベ口マイセス ラクテイス（ Ｋｌｕｙｖ
   ｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ）またはトルーラ
   クレモリス（ Ｔｏｒｕｌａｃｒｅｍｏｒｉｓ ）の種
   である特許請求の範囲第５項の方法。 ７（ａ）ラクターゼ含有酵母細胞を炭素数１〜４のアル
   キルアルコール及び炭素数１〜４の各々のアルキル基を
   持つジアルキルケトンより選択した化合物約２０〜９５
   重量％（この場合用いた細胞と化合物の全重量に基づく
   ）と５゜Ｃ〜３５゜Ｃで接触せしめ、（ｂ）上述の細胞
   をｐＨ約５．５〜８．０の水溶液と約５℃〜３５℃で接
   触せしめ得られたラクターゼ含有溶液から細胞を分離し
   このようにして放出せしめたラクターゼとグリセロール
   約３０〜９０重量％（この場合、上記溶液の全重量に基
   づく）の水溶液を約３５℃〜約６０℃、ｐＨ約５．５〜
   ８．０で、上記水溶液中のグロテアーゼ活性が充分に減
   少するまで加熱することを特徴とするラクターゼ含有イ
   ースト細胞中よりラクターゼを放出せしめる方法。