DK167124B1 - Fremgangsmaade til udvinding af lactase fra lactaseholdige gaerceller - Google Patents

Description

i DK 167124 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til udvinding af lactase fra lactaseholdige gærceller.

Lactase eller Ø-galactosidase er et enzym, der er virk-5 ningsfuldt ved hydrolyse af lactose til glucose og galactose. Lactase er derfor nyttigt inden for mejeri-industrien, f.eks. ved fremstilling af ost, hvor tilsætning af lactase til ostemælken forøger hastigheden af lacto-sens hydrolyse og derved forkorter modningstiden for 10 ostene, forøger produktionskapaciteten og tillader fremstilling af forbedrede produkter. Lactase er ligeledes nyttigt ved indgift til individer, der fysiologisk er intolerante over for lactose.

15 Lactase er en intracellulær bestanddel af visse mikroorganismer, der let fremstilles ved konventionelle fermenteringsmetoder , omfattende f.eks mikroorganismer tilhørende slægten Kluyveromyces, som tidligere blev betragtet som tilhørende Saccharomyces, især Kluyveromyces fragilis 20 og Kluyveromyces lactis samt andre gærarter, såsom dem, der tilhører slægterne Candida, Torula og Torulopis, og lignende. Man har tidligere dyrket celler af sådanne mikroorganismer i et passende næringssubstrat, indhøstet dem og tørret dem, hvorefter de komplette, tørrede celler 25 blev anvendt til tilførelse af lactaseaktivitet ved den ønskede anvendelse. Denne metode er ikke ønskværdig derved, at man ligeledes tilsætter andre cellebestanddele til ostemælken, og disse kan medføre uønskede smags- og lugtkarakteristika. Metoder til løsning af dette problem 30 har ifølge den kendte teknik indbefattet metoder til frigørelse af lactasen fra cellernes indre især ved nedbrydning af cellevæggene ved mekanisk homogenisering, ved formaling eller ved kemiske midler. Disse metoder kræver imidlertid i almindelighed lange bearbejdningstider, de 35 er kostbare, og de vil frigøre ikke alene lactase, men også andre intracellulære enzymer og proteiner samt disses nedbrydningsprodukter, fra hvilke lactasen helst bør DK 167124 B1 2 frasepareres. Et særligt problem i denne henseende har været, at ved frigørelsen af intracellulær lactase fra mikroorganismecellerne frigøres ligeledes enzymet protease, og det har været vanskeligt at fjerne protease-akti-5 viteten fra lactasepræparaterne. Når protease er til ste de i det lactasepræparat, der sættes til ostemælken til fremskyndelse af ostens modning, kan der fremkomme uønskede, bitre smagsdefekter, som tilskrives peptiddannelsen ved proteolytisk nedbrydning af mælkeproteinerne.

10 Der har således på grund af det oven for omtalte været behov for forbedrede fremgangsmåder til udvinding af lactase fra mikroorganismer, og der har yderligere været behov for fremgangsmåder til oprensning af således opnåede lactasepræparater, især for fremgangsmåder til selektiv 15 fjernelse af protease-aktivitet fra lactasepræparater.

Fra US patentskrift nr. 2 715 601 kendes en fremgangsmåde til fremstilling af et lactaseenzympræparat, hvorved en lactaseproducerende gærstamme dyrkes i et næringsmedium, 20 hvori lactose er den hovedsagelige carbonkilde, og gærcellerne derpå dræbes ved behandling med vandig ethylal-kohol og, efter separering fra alkoholen ved filtrering eller centrifugering, tørres til opnåelse af et tørt produkt, som indeholder et minimum af levedygtige organis-25 mer, men hvis lactaseaktivitet er i det væsentlige uskadt, mens zymaseaktiviteten er ubetydelig. Der er altså her ikke tale om nogen ekstraktion af lactaseenzymet, men kun om dræbning af gærcellerne ved hjælp af alkohol.

30 Chemical Abstrats, Vol. 64 (1965), spalte 10241a, angiver, at proteinase og e-amylase var mere stabile over for varme i 70% sorbitol end i 90% glycerol; og US patentskrift nr. 2 979 440 angiver, at den stabiliserende virkning af glycerol er mere væsentlig på diastaser end på 35 proteaser. Imidlertid kan der ikke heraf udledes noget om glycerols indvirkning på lactaseaktivitet i forhold til proteaseaktivitet.

DK 167124 B1 3

Den foreliggende opfindelse angår en forbedret fremgangsmåde til frigørelse af lactase fra lactaseholdige gærceller med godt udbytte og med høj renhed på forholdsvis korte behandlingstider.

5

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er særegen ved, at man (a) bringer lactaseholdige gærceller i kontakt med fra ca. 20 til ca. 95 vægt-% af en forbindelse valgt blandt alkylalkoholer med 1-4 carbonatomer og dialkylketoner med 10 1-4 carbonatomer i hver alkylgruppe, beregnet på den sam lede vægt af cellerne og alkoholen eller ketonen, ved en temperatur på fra ca. 5 til ca. 35 °C, fortrinsvis ved 20-30 °C, og derpå (b) bringer de alkohol- eller ketonbehandlede celler i kontakt med en vandig opløsning med en 15 pH-værdi på fra ca. 5,5 til ca. 8,0, fortrinsvis fra ca.

6,4 til ca. 7,0, ved en temperatur på fra ca. 5 til ca.

35 °C, fortrinsvis fra ca. 20 til ca. 30 °C, hvorpå man fjerner cellerne fra den resulterende lactaseholdige opløsning og, om ønsket, reducerer proteaseaktiviteten i 20 opløsningen.

Foretrukne forbindelser til anvendelse i trin (a) er methanol, ethanol og 2-propanol eller blandinger deraf, mest foretrukket ethanol. Alkoholen eller ketonen anven-25 des fortrinsvis i en mængde på fra ca. 60 til ca. 90 vægt-%. Foretrukne gærceller til anvendelse ved denne fremgangsmåde er de, der tilhører slægterne Kluyveromy-ces, Candida og Torula. Foretrukne arter omfatter Kluyve-romyces fragilis, Kluyveromyces lactis og Torula cremo-30 ris, der også er kendt under betegnelsen Candida pseudo-tropicalis.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan omfatte et yderligere trin til reduktion af protease-aktiviteten i den 35 lactaseholdige vandige opløsning, som består i, at man opvarmer opløsningen og fra ca. 30 til ca. 90 vægt-%, fortrinsvis 40-60 vægt-%, glycerol, beregnet på den tota- DK 167124 B1 4 le vægt af vand/glycerol-opløsningen, til en temperatur på fra ca. 35 til ca. 60 °C, fortrinsvis 45-55 °C, ved en pH-værdi på fra ca. 5,5 til ca. 8,0, fortrinsvis 6,4-7,0, indtil opløsningens proteaseaktivitet er væsentligt redu-5 ceret. Man kan, om ønsket, sætte manganioner til den vandige glycerolopløsning i en koncentration på fra ca. 10-4 _2 til ca. 10 M for at forhøje lactasens stabilitet under varmebehandlingen.

10 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes til udvinding af lactase fra lactaseholdige gærceller, der er velkendte inden for teknikken. Egnede mikroorganismer inkluderer dem af slægten Kluyveromyces, især Kluyveromyces fragilis, hvoraf mange stammer er tilgængelige for of-15 fentligheden fra samlinger af mikroorganismekulturer, f.eks. Kluyveromyces fragilis ATCC 10022, ATCC 8608, ATCC 8582, ATCC 12424, og ligeledes Kluyveromyces lactis. Andre mikroorganismer, hvorfra lactase kan udvindes under anvendelse af den ovennævnte fremgangsmåde, inkluderer 20 dem af slægterne Candida og Torula, især Torula cremoris, hvoraf en stamme er tilgængelig for offentligheden fra University of California i Davis, Californien, kultur nr. UCD55-31, og lignende. Foretrukne gærceller til anvendelse ved den ovennævnte fremgangsmåde er dem af slægten 25 Kluyveromyces, især dem af arterne Kluyveromyces fragilis og Kluyveromyces lactis, samt Torula cremoris, der også er kendt som Candida pseudotropicalis. Mutanter af disse kendte offentligt tilgængelige mikroorganismer, fremstillet ved konventionel teknik såsom bestråling med røntgen-30 stråler eller ultraviolet lys, behandling med sennepsgaslignende forbindelser eller lignende, vil også være egnede til anvendelse ved den ovennævnte fremgangsmåde.

De lactaseholdige gærceller opnås i almindelighed ved 35 aerob dyrkning i et passende næringssubstrat, f.eks. i et vandigt substrat indeholdende lactose, herunder indbefattet substrater indeholdende valle, sammen med kilder til DK 167124 B1 5 phosphor, nitrogen og kalium, f.eks. ammoniumphosphat, kaliumphosphat og lignende salte. Sådanne næringssubstrater er velkendte for fagmanden.

5 Under anvendelse af konventionelle fermenteringsmetoder velkendte for fagmanden dyrkes gærcellerne, indtil man opnår en tilstrækkelig høj koncentration af cellerne i næringssubstratet, f.eks. ved, at man gennemfører fermenteringen i et næringssubstrat ved en temperatur på fra 10 ca. 20 til ca. 35 °C, fortrinsvis ved 25 til 30 °C, i et tidsrum på fra ca. 48 til ca. 100 timer. Cellerne indhøstes derpå, f.eks. ved filtrering eller ved centrifugering.

15 For at frigøre den intracellulære lactase bringer man først gærcellerne i kontakt med en alkylalkohol med 1-4 carbonatomer eller en dialkylketon med 1-4 carbonatomer i hver alkylgruppe ved en temperatur 5-35 °C, fortrinsvis 20-30 °C.

20

Alkoholen eller ketonen anvendes i en mængde på fra ca.

20 til ca. 95 vægt-%, fortrinsvis fra 60 til 90 vægt-%, baseret på den samlede vægt af celler og alkohol eller keton. Cellerne bringes i kontakt med alkoholen eller ke-25 tonen i et tidsrum på fra ca. 2 minutter til ca. 20 timer, fortrinsvis 30 minutter til 2 timer. Alkoholen eller ketonen fjernes derpå fortrinsvis fra cellerne, f.eks. ved filtrering af cellerne, afdampning af opløsningsmidlet, frysetørring eller lignende. Når alkoholen eller ke-30 tonen imidlertid anvendes i en mængde på mindre end ca.

75 til 80 vægt-%, er fjernelse af alkoholen eller ketonen ikke absolut nødvendig, og cellerne kan behandles i det efterfølgende behandlingstrin med en vandig opløsning ved en pH-værdi på fra ca. 5,5 til 8,0 i nærvær af alkoholen 35 eller ketonen.

DK 167124 B1 6

Behandlingen af celler med en alkylalkohol eller dialkyl-keton i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen udgør ikke en opløsningsmiddel-ekstraktion af den intracellulære lactase ved hjælp af alkoholen eller 5 ketonen. Under betingelserne for den foreliggende fremgangsmåde ekstraheres kun lidt eller slet ingen lactase fra cellerne ved hjælp af alkoholen eller ketonen. Man formoder, at alkoholen eller ketonen virker således, at den gør cellevæggene mere permeable og således tillader 10 frigørelsen af den intracellulære lactase, når cellerne derpå bringes i suspension i en vandig opløsning ved en lille pH-værdi på ca. 5,5 til 8,0, således som det beskrives mere detaljeret i det følgende.

15 Efter behandling med alkoholen eller ketonen som ovenfor beskrevet bringes de alkohol- eller ketonbehandlede celler i suspension i en vandig opløsning med en pH-værdi på fra ca. 5,5 til 8,0, fortrinsvis fra ca. 6,4 til 7,0, og mest foretrukket ved ca. 6,6, idet man fortrinsvis anven-20 der en passende buffer-opløsning, f.eks. en 0,1 M natrium- eller kaliumphosphatopløsning, eller en 0,1 M citrat-phosphatopløsning eller lignende. Opløsningen holdes fortrinsvis i bevægelse, f.eks. ved omrøring eller ved rystning til fremme af frigørelsen af lactasen. Opløsningen 25 holdes ved en temperatur på fra ca. 5 °C til ca. 35 °C, fortrinsvis fra 20 °C til 30 °C. Cellekoncentrationen i den vandige opløsning er ikke kritisk; men den befinder sig fortrinsvis i området fra ca. 10 til 80 gram pr. liter, fortrinsvis ca. 30 til 50 gram pr. liter. Cellerne 30 holdes i suspension i den vandige opløsning, fortrinsvis en 0,1 M natrium- eller kaliumphosphat-bufferopløsning, i tidsrum på ca. 1 til 20 timer, idet tider på ca. 10 til • 20 timer er optimale for det maksimale udbytte af ekstraheret lactase. Dersom man anvender tider på mere end ca.

35 20 timer, kan der forekomme noget tab i udbyttet af udvundet lactase på grund af mikrobiologisk nedbrydning af enzymet, skønt man kan nedbringe sådanne tab til det DK 167124 B1 7 mindst mulige ved at arbejde under sterile betingelser eller ved tilsætning af konserveringsmidler. Lactase frigives fra cellerne over i den vandige opløsning sammen med visse mængder af andre intracellulære enzymer eller 5 proteiner, inklusive protease, skønt ekstraktionen af de uønskede bestanddele er væsentlig mindre end ved andre metoder ifølge den kendte teknik til frigørelse af lactase, f.eks. ved homogenisering eller mekanisk formaling af cellerne til mekanisk sprængning af cellevæggene.

10

Den mængde lactase, der frigøres fra cellerne, måles og udtrykkes som lactaseenheder, således som det sædvanligvis gøres. Lactaseenhederne er således i forbindelse med den foreliggende opfindelse bestemt ved hastigheden af 15 nedbrydningen af o-nitrophenyl-beta-D-galactopyranosid (ONPG) til o-nitrophenyl (ONP) og D-galactopyranosid, se f.eks. Wendorf et al., J. Milk Food Tech. 34, 451 (1971).

Under de foreliggende omstændigheder måler man mere specifikt hastigheden af nedbrydningen af ONPG ved at måle 20 med et spektrofotometer absorptionen ved 420 nm i en opløsning, der fremstilles ved at blande 7 ml 0,1 M kalium-phosphat-bufferopløsning indeholdende 0,1% bovint serum- _3 albumin, 1 ml af en 10 molær opløsning af mangansulfat, monohydrat, 2 ml af 0,2 M opløsning af ONPG samt 1 ml af 25 den lactaseholdige opløsning, der skal afprøves. Analysen udføres i 20 minutter ved 37 °C, og omsætningen stoppes derpå ved tilsætning af 1 ml 2 M ammoniumhydroxid-opløs- -3 ning indeholdende 2 x 10 M dinatrium-EDTA. Antallet af lactaseenheder bestemmes derpå ved ændringen i absorptio-30 nen ved 420 nm, idet en lactaseenhed er lig med et mikro-mol ONP fremstillet pr. minut. På tilsvarende måde kan man måle mængden af protease i opløsningen, udtrykt som proteaseenheder, som nedbrydningshastigheden for azocoll, der er en indfarvet collagen-polymer, se f.eks. Heym, 35 Arch. Biochem. Biophys. 127, 89(1962). I den foreliggende sammenhæng bestemmes nedbrydningshastigheden for azocoll mere specifikt ved måling af ændringen i absorptionen ved DK 167124 B1 8 520 nm under anvendelse af et spektrofotometer og i en opløsning, der er fremstillet ved blanding af 3 ml 0,1 M natriumphosphat-bufferopløsning, 10 mg azocoll og 1 ml af den proteaseholdige opløsning, der skal afprøves. Opløs-5 ningen inkuberes i 30 minutter ved 37 °C under omrystning, og reaktionen stoppes derpå ved frafiltrering af det tilbageværende azocoll. Antallet af proteaseenheder bestemmes derpå ud fra ændringen i absorptionen ved 520 nm udtrykt pr. minut.

10

Efter frigørelsen af lactasen sammen med mindre mængder protease og andre proteiner fra gærcellerne og over i det vandige ekstraktionsmedium fjernes det tilbageværende faste cellemateriale, f.eks. ved filtrering, til dannelse 15 af et vandigt lactasepræparat bestående af en opløsning af lactase sammen med mindre mængder af protease-urenhe-der. Man kan om ønsket isolere lactasen fra denne opløsning ved konventionelle fremgangsmåder, f.eks. frysetørring eller ved tilsætning af et ikke-opløsningsmiddel, 20 såsom acetone, til udfældning af lactasen, ved tilsætning af saccharose efterfulgt af forstøvningstørring og lignende. Lactase, der er isoleret fra det vandige ekstraktionsmedium ifølge den foreliggende opfindelse ved sådanne midler, vil indeholde protease-urenheder, hvilket vil 25 bidrage til uønskede smags- og lugt-karakteristika, når lactasepræparatet anvendes til fremstilling af ost. Det foretrækkes derfor, at den lactase, der er opnået ud fra gærceller ved den oven for beskrevne fremgangsmåde, ifølge opfindelsen, oprenses til fjernelse af protease-akti-30 viteten.

Sådan protease-aktivitet kan ved et yderligere trin fjernes fra lactase-præparater ved, at man opvarmer en vandig opløsning af lactase-præparatet indeholdende protease-35 urenheder sammen med fra ca. 30 til ca. 90 vægt-% glycerol baseret på den samlede vægt af vand-glycerolopløs-ningen, og ved en temperatur på fra ca. 35 °C til 60 °C

DK 167124 Bl 9 samt ved en pH-værdi på fra ca. 5,5 til 8,0. Den vandige opløsning indeholdende den udvundne lactase og protease-urenhederne, som er opnået ved ekstraktion af de alkoholeller ketonbehandlede gærceller i overensstemmelse med 5 den foreliggende opfindelse, kan oprenses direkte ved tilsætning af glycerol og ved opvarmning uden behov for isolering af lactasen fra det vandige ekstraktionsmedium. Koncentrationerne af lactase i vand-glycerolopløsningen ved oprensningsbehandlingen er ikke kritisk; men de er i 10 almindelighed i området fra ca. 1000 til 25000 lactase-enheder pr. ml, fortrinsvis fra ca. 2000 til 25000 enheder/ml. Den lactaseholdige vandige opløsning, der er opnået ved den ovenfor beskrevne ekstraktionsbehandling af alkohol- eller ketonbehandlede celler, opkoncentreres 15 derfor fortrinsvis til dannelse af en passende lactase-koncentration forud for tilsætning af glycerol til opløsningen.

Oprensningsbehandlingen udføres fortrinsvis ved en tempe- 20 ratur på fra ca. 45 °C til 55 °C, fortrinsvis ved en pH- værdi i området 6,4 til 7,0, især fortrinsvis ved ca.

6,6, hvor lactasen er mest stabil. Lactasens stabilitet under oprensningsbehandlingen kan om ønsket yderligere forstærkes ved tilsætning af et opløseligt divalent man- 25 gansalt til opløsningen, f.eks. mangansulfat, manganchlo- rid, mangannitrat eller lignende, i en mængde, der er tilstrækkelig stor til at tilvejebringe en manganionkon- -4 -2 centration på fra ca. 10 til 10 M.

30 Den lactaseholdige vand-glycerolopløsning opvarmes, indtil protease-aktiviteten er i væsentlig grad reduceret.

Den dertil nødvendige tid vil afhænge af reaktionstemperaturen; men den vil i almindelighed strække sig fra ca.

3 timer ved 60 °C til ca. 10 dage ved 35 °C, med optimale 35 tider på ca. 6 til 12 timer ved en temperatur på 50 °C.

Under behandlingsbetingelserne ifølge fremgangsmåden denatureres protease-urenhederne hurtigt, og protease-akti- DK 167124 B1 10 viteten kan reduceres til 10% eller mindre af den oprindelige værdi under anvendelse af den foreliggende behandling. I modsætning hertil stabiliseres lactasen selektivt ved glycerolen og ved manganionen, dersom denne tilsæt-5 tes, og man bibeholder mere end 90% af den oprindelige lactase-aktivitet. Under varmebehandlingen dannes et bundfald af denatureret protein, inkluderende denatureret protease, og dette fjernes fra opløsningen, f.eks. ved filtrering til dannelse af en renset opløsning af den 10 ønskede lactase. Lactasen kan derpå, om ønsket, isoleres fra denne opløsning ved for fagmanden kendte metoder.

Opfindelsen belyses ved de følgende eksempler.

15 EKSEMPEL 1

Man fremstillede en kultur af Torula cremoris (Candida pseudotropicalis), der var fremskaffet fra University of California i Davis, California, kultur nr. UCD-55-31, 20 ved, at man dyrkede cellerne i 12 timer ved 28 °C i 1 liter næringssubstrat med følgende sammensætning: valle 40,0 g/1 (NH4)2S04 5,0 " 25 K2HP04 5,0 " maj sstøbevand 1,0 "

MgS04,7H20 0,5 " hvis pH-værdi blev justeret til 4,5 med svovlsyre, og 30 substratet blev autoklaveret ved 110 °C i 45 minutter.

En 14-liters fermenteringsbeholder indeholdende 8,0 liter af et substrat med følgende sammensætning: 35 DK 167124 B1 11 KH2P04 1,8 g/1 NH4H2P04 lr° " (NH4)2HP04 1,0 -

MgS04,7H20 0,1 5 FeS04,7H20 5,0 mg/1

MnS04,7H20 5,0 " som forinden var blevet autoklaveret i 30 minutter ved 121 °C, blev podet (10% v/v) med det ovenfor beskrevne 10 podemateriale.

En næringsvæske (2,6 liter) med følgende sammensætning: lactose 363 g/1 15 gærekstrakt 6,0 " majsstøbevand 3,0 " nicotinsyre 6,0 mg/1 som forinden var blevet autoklaveret i 45 minutter ved 20 110 °C, blev tilsat kontinuert igennem 60 timers fermen tering.

Mængden af opløst oxygen blev holdt over 10% under fermenteringens forløb ved beluftning og omrøring stigende 25 fra 0,5 vol/vol/min til 0,75 vol/vol/min og 310 o/m til 380 o/m henholdsvis. Fermenteringstemperaturen var 30 °C, og pH blev holdt på 4,5.

Efter 60 timers forløb var cellekoncentrationen 18 g/1, 30 og lactaseindholdet i cellerne blev målt som værende 4200 enheder/gram. De stærkt lactaseholdige celler blev indhøstet ved filtrering.

Pastaen af gærceller, som indeholdt 1,8 gram celler op-35 nået ud fra fermenteringsvæsken, blev behandlet med 6,3 g ethanol. Efter 90 minutters forløb blev ethanolet fjernet ved filtrering, og cellerne blev igen suspenderet i 0,1 M

DK 167124 B1 12 kaliumphosphat-buffer, pH 6,6. Cellekoncentrationen i denne buffer blev justeret til ca. 40 g/1. Lactase-frigørelse blev fremkaldt ved omrøring af de ethanol-behandlede celler i ekstraktionsbufferen igennem 15 ti-5 mer. De ekstraherede celler blev derpå fjernet ved filtrering fra den lactaseberigede buffer. Den endelige enzymopløsning indeholdt ca. 6 mg/ml protein og 65 enheder/ml laetase-aktivitet, hvilket svarer til et udbytte på ca. 45% baseret på det intracellulære lactase-10 indhold i de indhøstede celler.

EKSEMPEL 2

Fremgangsmåden i eksempel 1 blev gentaget på andre por-15 tioner indhøstede celler fremstillet i eksempel 1 under anvendelse af forskellige alkoholer og ketoner i stedet for ethanol til behandling af celler. De således opnåede resultater var som følger: 20 Udbytte Lactase-aktivitet

Forbindelse % (enheder/ml) methanol 45 66 2-propanol 37 52 25 butanol 1 1,5 t-butanol 45 66 acetone 10 13 methylethylketon 10 13 methylisobutylketon 7,5 10 30 EKSEMPEL 3

Frigørelsen af lactase ved behandling af celler med ethanol efterfulgt af ekstraktion med 0,1 M natriumphosphat-35 bufferopløsning analogt med den fremgangsmåde, der er beskrevet i eksempel 1, blev demonstreret over for stammer af Kluyveromyces fragilis. Cellerne blev dyrket i 24 ti- DK 167124 B1 13 mer i 1 liter af det pode-substrat, der er beskrevet i eksempel 1, i en 2-liters kolbe ved 30 °C, og de blev derpå indsamlet ved filtrering. Mængden af lactase frigjort fra ca. 1,5 g celler ved behandling med ethanol og 5 påfølgende ekstraktion med 0,1 M kaliumphosphatbuffer, analogt med fremgangsmåden i eksempel 1, var som følger:

Mikroorganisme Lactase (enheder/ml) 10 K. fragilis ATCC 8608 5,0 K. fragilis ATCC 8582 1,5 K. fragilis ATCC 10022 1,5 K. fragilis ATCC 12424 2,0 15 EKSEMPEL 4

Tre liter af en blanding 1:1 glycerol:0,1 M kaliumphos-phatopløsning, pH 6,6, der indeholdt 3000 enheder/ml lac- _3 tase og 0,24 proteaseenheder/ml, og som indeholdt 10 M 20 manganioner, der var tilsat i form af mangansulfat, blev opvarmet ved 50 °C i 6 timer. Under opvarmningen blev dannet et hvidt bundfald af denatureret protein, og dette blev frafiltreret. Den i opløsningen tilbageværende protease-aktivitet var 0,03 enheder/ml, hvilket svarer til 25 fjernelse af ca. 90% af den oprindelige protease-aktivi-tet. I modsætning hertil blev lactase-aktiviteten af den således fremstillede opløsning målt til 2760 enheder/ml, hvilket svarer til bibeholdelse af mere end 90% af den oprindelige lactase-aktivitet.

30 EKSEMPEL 5

Den i eksempel 4 beskrevne fremgangsmåde blev gentaget, idet man dog anvendte en temperatur på 37 °C i stedet for 35 50 °C. Efter 9 dages opvarmning var ca. 90% af den oprin delige protease-aktivitet blevet fjernet, medens man havde bibeholdt ca. 95% (2850 enheder/ml) af den oprindelige lactase-aktivitet.

Claims (7)

1. Fremgangsmåde til udvinding af lactase fra lactasehol-5 dige gærceller, kendetegnet ved, at man (a) ved en temperatur på 5-35 °C bringer cellerne i kontakt med 20-95 vægt-% af en forbindelse valgt blandt alkylalkoholer med 1-4 carbonatomer og dialkylketoner 10 med 1-4 carbonatomer i hver alkylgruppe, beregnet på den totale vægt af cellerne og forbindelsen, og derpå (b) ved en temperatur på 5-35 °C bringer cellerne i kontakt med en vandig opløsning med en pH-værdi på 5,5- 15 8,0, hvorpå man fjerner cellerne fra den resulterende lactase-holdige opløsning og, om ønsket, reducerer proteaseakti-viteten i opløsningen. 20

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at cellerne tilhører slægterne Kluyveromyces, Candida eller Torula.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at temperaturen i hvert af trinnene (a) og (b) er 20-30 °C, og den vandige opløsnings pH-værdi er 6,4-7,0.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet 30 ved, at den i trin (a) anvendte forbindelse er methanol, ethanol, 2-propanol eller blandinger deraf.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at forbindelsen er ethanol i en mængde på 60-90 35 vægt-%. DK 167124 B1

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at cellerne tilhører arterne Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis eller Torula cremoris.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man reducerer proteaseaktiviteten i den lactase-holdige vandige opløsning ved opvarmning af opløsningen og 30-90 vægt-% glycerol, beregnet på den totale vægt af vand/glycerol-opløsningen til en temperatur på 35-60 °C 10 ved en pH-værdi på 5,5-8,0, indtil opløsningens proteaseaktivi tet er væsentligt reduceret. 20 25 30 35