DK167226B1 - Fremgangsmaade til selektiv reduktion af proteaseaktivitet i proteaseholdige lactasepraeparater - Google Patents

Description

i DK 167226 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til selektiv reduktion af proteaseaktivitet i proteaseholdige lactasepræparater.

5 Lactase eller Ø-galactosidase er et enzym, der er virkningsfuldt ved hydrolyse af lactose til glucose og galactose. Lactase er derfor nyttigt inden for mejeri-industrien, f.eks. ved fremstilling af ost, hvor tilsætning af lactase til ostemælken forøger hastigheden af lacto-10 sens hydrolyse og derved forkorter modningstiden for ostene, forøger produktionskapaciteten og tillader fremstilling af forbedrede produkter. Lactase er ligeledes nyttigt ved indgift til individer, der fysiologisk er intolerante over for lactose.

15

Lactase er en intracellulær bestanddel af visse mikroorganismer, der let fremstilles ved konventionelle fermenteringsmetoder, omfattende f.eks mikroorganismer tilhørende slægten Kluyveromyces, som tidligere blev betragtet 20 som tilhørende Saccharomyces, især Kluyveromyces fragilis og Kluyveromyces lactis samt andre gærarter, såsom dem, der tilhører slægterne Candida, Torula og Torulopis, og lignende. Man har tidligere dyrket celler af sådanne mikroorganismer i et passende næringssubstrat, indhøstet 25 dem og tørret dem, hvorefter de komplette, tørrede celler blev anvendt til tilførelse af lactaseaktivitet ved den ønskede anvendelse. Denne metode er ikke ønskværdig derved, at man ligeledes tilsætter andre cellebestanddele til ostemælken, og disse kan medføre uønskede smags- og 30 lugtkarakteristika. Metoder til løsning af dette problem har ifølge den kendte teknik indbefattet metoder til frigørelse af lactasen fra cellernes indre især ved nedbrydning af cellevæggene ved mekanisk homogenisering, ved formaling eller ved kemiske midler. Disse metoder kræver 35 imidlertid i almindelighed lange bearbejdningstider, de er kostbare, og de vil frigøre ikke alene lactase, men også andre intracellulære enzymer og proteiner samt dis- DK 167226 B1 2 ses nedbrydningsprodukter, fra hvilke lactasen helst bør frasepareres. Et særligt problem i denne henseende har været, at ved frigørelsen af intracellulær lactase fra mikroorganismecellerne frigøres ligeledes enzymet pro-5 tease, og det har været vanskeligt at fjerne protease-ak-tiviteten fra lactasepræparaterne. Når protease er til stede i det lactasepræparat, der sættes til ostemælken til fremskyndelse af ostens modning, kan der fremkomme uønskede, bitre smagsdefekter, som tilskrives peptiddan-10 nelsen ved proteolytisk nedbrydning af mælkeproteinerne.

Der har således på grund af det oven for omtalte været behov for forbedrede fremgangsmåder til udvinding af lactase fra mikroorganismer, og der har yderligere været behov for fremgangsmåder til oprensning af således opnåede 15 lactasepræparater, især for fremgangsmåder til selektiv fjernelse af protease-aktivitet fra lactasepræparater.

Opfindelsen ifølge stamansøgningen, dansk patentansøgning nr. 1298/81, angår en forbedret fremgangsmåde til frigø-20 relse af lactase fra lactaseholdige gærceller med godt udbytte og med høj renhed på forholdsvis korte behandlingstider. Denne fremgangsmåde er særegen ved, at man a) bringer lactaseholdige gærceller i kontakt med fra ca. 20 til ca. 95 vægt-% af en forbindelse valgt blandt alkylal-25 koholer med 1-4 carbonatomer og dialkylketoner med 1-4 carbonatomer i hver alkylgruppe, beregnet på den samlede vægt af cellerne og alkoholen eller ketonen, ved en temperatur på fra ca. 5 til ca. 35 °C, fortrinsvis ved 20-30 °C, og derpå b) bringer de alkohol- eller ketonbehandlede 30 celler i kontakt med en vandig opløsning med en pH-værdi på fra ca. 5,5 til ca. 8,0, fortrinsvis fra ca. 6,4 til ca. 7,0, ved en temperatur på fra ca. 5 til ca. 35 °C, fortrinsvis fra ca. 20 til ca. 30 °C, hvorpå man fjerner cellerne fra den resulterende lactaseholdige opløsning 35 og, om ønsket, reducerer proteaseaktiviteten i opløsningen.

DK 167226 B1 3

Foretrukne forbindelser til anvendelse i trin a) er methanol, ethanol og 2-propanol eller blandinger deraf, mest foretrukket ethanol. Alkoholen eller ketonen anvendes fortrinsvis i en mængde på fra ca. 60 til ca. 90 5 vægt-%. Foretrukne gærceller til anvendelse ved denne fremgangsmåde er de, der tilhører slægterne Kluyveromy-ces, Candida og Torula. Foretrukne arter omfatter Kluyve-romyces fragilis, Kluyveromyces lactis og Torula cremo-ris, der også er kendt under betegnelsen Candida pseudo-10 tropicalis.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en fremgangsmåde til selektiv reduktion af protease-aktivitet i et proteaseholdigt lactasepræparat, som er særegen ved, at 15 man opvarmer en vandig opløsning indeholdende præparatet og fra ca. 30 til ca. 90 vægt-% , fortrinsvis 40-60 vægt-%, glycerol, beregnet på den totale vægt af vand/glyce-rol-opløsningen, til en temperatur på fra ca. 35 til ca.

60 °C, fortrinsvis 45-55 °C, ved en pH-værdi på fra ca.

20 5,5 til ca. 8,0, fortrinsvis 6,4-7,0, indtil proteaseak- tiviteten er væsentligt reduceret. Man kan, om ønsket, sætte manganioner til den vandige glycerolopløsning i en -4 -2 koncentration på fra ca. 10 til ca. 10 M for at forhøje lactasens stabilitet under varmebehandlingen.

25

Fremgangsmåden ifølge stamansøgningen kan anvendes til udvinding af lactase fra lactaseholdige gærceller, der er velkendte inden for teknikken. Egnede mikroorganismer inkluderer dem af slægten Kluyveromyces, især Kluyveromyces 30 fragilis, hvoraf mange stammer er tilgængelige for offentligheden fra samlinger af mikroorganismekulturer, f.eks. Kluyveromyces fragilis ATCC 10022, ATCC 8608, ATCC 8582, ATCC 12424, og ligeledes Kluyveromyces lactis.

Andre mikroorganismer, hvorfra lactase kan udvindes under 35 anvendelse af den ovennævnte fremgangsmåde, inkluderer dem af slægterne Candida og Torula, især Torula cremoris, hvoraf en stamme er tilgængelig for offentligheden fra DK 167226 B1 4

University of California i Davis, Californien, kultur nr. UCD55-31, og lignende. Foretrukne gærceller til anvendelse ved den ovennævnte fremgangsmåde er dem af slægten Kluyveromyces, især dem af arterne Kluyveromyces fragilis 5 og Kluyveromyces lactis, samt Torula cremoris, der også er kendt som Candida pseudotropicalis. Det er underforstået, at mutanter af disse kendte offentligt tilgængelige mikroorganismer, fremstillet ved konventionel teknik såsom bestråling med røntgenstråler eller ultraviolet 10 lys, behandling med sennepsgaslignende forbindelser eller lignende, også vil være egnede til anvendelse ved den ovennævnte fremgangsmåde.

De lactaseholdige gærceller opnås i almindelighed ved 15 aerob dyrkning i et passende næringssubstrat, f.eks. i et vandigt substrat indeholdende lactose, herunder indbefattet substrater indeholdende valle, sammen med kilder til phosphor, nitrogen og kalium, f.eks. ammoniumphosphat, kaliumphosphat og lignende salte. Sådanne næringssubstra-20 ter er velkendte for fagmanden.

Under anvendelse af konventionelle fermenteringsmetoder velkendte for fagmanden dyrkes gærcellerne, indtil man opnår en tilstrækkelig høj koncentration af cellerne i 25 næringssubstratet, f.eks. ved, at man gennemfører fermen teringen i et næringssubstrat ved en temperatur på fra ca. 20 til ca. 35 °C, fortrinsvis fra 25 til 30 °C, i en tidsperiode på fra ca. 48 til 100 timer. Cellerne indhøstes derpå, f.eks. ved filtrering eller ved centrifuge-30 ring.

For at frigøre den intracellulære lactase bringer man først gærcellerne i kontakt med en alkylalkohol med 1-4 carbonatomer eller en dialkylketon med 1-4 carbonatomer i 35 hver alkylgruppe ved en temperatur fra 5 til 35 °C, fortrinsvis fra 20 til 30 °C. Alkoholen eller ketonen anvendes i en mængde på fra ca. 20 til ca. 95 vægt-%, for- DK 167226 B1 5 trinsvis fra 60 til 90 vægt-% , baseret på den samlede vægt af celler og alkohol eller keton. Cellerne bringes i kontakt med alkoholen eller ketonen i et tidsrum på fra ca. 2 minutter til ca. 20 timer, fortrinsvis 30 minutter 5 til 2 timer. Alkoholen eller ketonen fjernes derpå fortrinsvis fra cellerne, f.eks. ved filtrering af cellerne, afdampning af opløsningsmidlet, frysetørring eller lignende. Når alkoholen eller ketonen imidlertid anvendes i en mængde på mindre end ca. 75 til 80 vægt-%, er fjer-10 nelse af alkoholen eller ketonen ikke absolut nødvendig, og cellerne kan behandles i det efterfølgende behandlingstrin med en vandig opløsning ved en pH-værdi på fra ca. 5,5 til 8,0 i nærvær af alkoholen eller ketonen.

15 Behandlingen af celler med en alkylalkohol eller dialkyl-keton i overensstemmelse med den ovennævnte fremgangsmåde udgør ikke en opløsningsmiddel-ekstraktion af den intra-cellulære lactase ved hjælp af alkoholen eller ketonen. Under betingelserne for denne fremgangsmåde ekstraheres 20 kun lidt eller slet ingen lactase fra cellerne ved hjælp af alkoholen eller ketonen. Man formoder, at alkoholen eller ketonen virker således, at den gør cellevæggene mere permeable og således tillader frigørelsen af den in-tracellulære lactase, når cellerne derpå bringes i sus-25 pension i en vandig opløsning ved en lille pH-værdi på ca. 5,5 til 8,0, således som det beskrives mere detaljeret i det følgende.

Efter behandling med alkoholen eller ketonen som ovenfor 30 beskrevet bringes de alkohol- eller ketonbehandlede celler i suspension i en vandig opløsning med en pH-værdi på fra ca. 5,5 til 8,0, fortrinsvis fra ca. 6,4 til 7,0, og mest foretrukket ved ca. 6,6, idet man fortrinsvis anvender en passende buffer-opløsning, f.eks. en 0,1 M natri-35 um- eller kaliumphosphatopløsning, eller en 0,1 M citrat-phosphatopløsning eller lignende. Opløsningen holdes fortrinsvis i bevægelse, f.eks. ved omrøring eller ved ryst- DK 167226 B1 6 ning til fremme af frigørelsen af lactasen. Opløsningen holdes ved en temperatur på fra ca. 5 til ca. 35 °C, fortrinsvis fra 20 til 30 °C. Cellekoncentrationen i den vandige opløsning er ikke kritisk; men den befinder sig 5 fortrinsvis i området fra ca. 10 til 80 gram pr. liter, fortrinsvis ca. 30 til 50 gram pr. liter. Cellerne holdes i suspension i den vandige opløsning, fortrinsvis en 0,1 M natrium- eller kaliumphosphat-bufferopløsning, i tidsrum på ca. 1 til 20 timer, idet tider på ca. 10 til 20 10 timer er optimale for det maksimale udbytte af ekstraheret lactase. Dersom man anvender tider på mere end ca. 20 timer, kan der forekomme noget tab i udbyttet af udvundet lactase på grund af mikrobiologisk nedbrydning af enzymet, skønt man kan nedbringe sådanne tab til det mindst 15 mulige ved at arbejde under sterile betingelser eller ved tilsætning af konserveringsmidler. Lactase frigives fra cellerne over i den vandige opløsning sammen med visse mængder af andre intracellulære enzymer eller proteiner, inklusive protease, skønt ekstraktionen af de uønskede 20 bestanddele er væsentlig mindre end ved andre metoder ifølge den kendte teknik til frigørelse af lactase, f.eks. ved homogenisering eller mekanisk formaling af cellerne til mekanisk sprængning af cellevæggene.

25 Den mængde lactase, der frigøres fra cellerne, måles og udtrykkes som lactaseenheder, således som det sædvanligvis gøres. Lactaseenhederne er således bestemt ved hastigheden af nedbrydningen af o-nitrophenyl-β-D-galacto-pyranosid (ONPG) til o-nitrophenyl (ONP) og D-galacto- i 30 pyranosid, se f.eks. Wendorf et al., J. Milk Food Tech.

34, 451 (1971). Under de foreliggende omstændigheder måler man mere specifikt hastigheden af nedbrydningen af ONPG ved at måle med et spektrofotometer absorptionen ved 420 ni i en opløsning, der fremstilles ved at blande 7 ml 35 0,1 M kaliumphosphat-buf feropløsning indeholdende 0,1% _3

bovint serumalbumin, 1 ml af en 10 molær opløsning af mangansulfat, monohydrat, 2 ml af 0,2 M opløsning af ONPG

DK 167226 B1 7 samt 1 ml af den lactaseholdige opløsning, der skal afprøves. Analysen udføres i 20 minutter ved 37 °C, og omsætningen stoppes derpå ved tilsætning af 1 ml 2 M ammo- -3 niumhydroxid-opløsning indeholdende 2 x 10 M dinatrium-5 EDTA. Antallet af lactaseenheder bestemmes derpå ved ændringen i absorptionen ved 420 nm, idet en lactaseenhed er lig med et mikromol ONP fremstillet pr. minut. På tilsvarende måde måles i forbindelse med den foreliggende opfindelse mængden af protease i opløsningen, udtrykt som 10 proteaseenheder, som nedbrydningshastigheden for azocoll, der er en indfarvet collagen-polymer, se f.eks. Heym,

Arch. Biochem. Biophys. 127, 89 (1962). I den foreliggende sammenhæng bestemmes nedbrydningshastigheden for azocoll mere specifikt ved måling af ændringen i absorption-15 en ved 520 nm under anvendelse af et spektrofotometer og i en opløsning, der er fremstillet ved blanding af 3 ml 0,1 M natriumphosphat-bufferopløsning, 10 mg azocoll og 1 ml af den proteaseholdige opløsning, der skal afprøves. Opløsningen inkuberes i 30 minutter ved 37 °C under om-20 rystning, og reaktionen stoppes derpå ved frafiltrering af det tilbageværende azocoll. Antallet af proteaseenheder bestemmes derpå ud fra ændringen i absorptionen ved 520 nm udtrykt pr. minut.

25 Efter frigørelsen af lactasen sammen med mindre mængder protease og andre proteiner fra gærcellerne og over i det vandige ekstraktionsmedium fjernes det tilbageværende faste cellemateriale, f.eks. ved filtrering, til dannelse af et vandigt lactasepræparat bestående af en opløsning 30 af lactase sammen med mindre mængder af protease-urenhe-der. Man kan om ønsket isolere lactasen fra denne opløsning ved konventionelle fremgangsmåder, f.eks. frysetørring eller ved tilsætning af et ikke-opløsningsmiddel, såsom acetone, til udfældning af lactasen, ved tilsætning 35 af saccharose efterfulgt af forstøvningstørring og lignende. Lactase, der er isoleret fra det vandige ekstraktionsmedium ved sådanne midler, vil indeholde protease- DK 167226 B1 8 urenheder, hvilket vil bidrage til uønskede smags- og lugt-karakteristika, når lactasepræparatet anvendes til fremstilling af ost. Den lactase, der er opnået ud fra gærceller ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde, kan 5 oprenses til fjernelse af protease-aktiviteten ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Sådan protease-aktivitet kan i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse fjernes fra lactase-præparater 10 ved, at man opvarmer en vandig opløsning af lactase-præ-paratet indeholdende protease-urenheder sammen med fra ca. 30 til ca. 90 vægt-% glycerol baseret på den samlede vægt af vand-glycerolopløsningen, og ved en temperatur på fra ca. 35 til ca. 60 °C samt ved en pH-værdi på fra ca.

15 5,5 til 8,0. Den vandige opløsning indeholdende den ud vundne lactase og protease-urenhederne, som er opnået ved ekstraktion af de alkohol- eller ketonbehandlede gærceller som beskrevet ovenfor, kan direkte oprenses ved tilsætning af glycerol og ved opvarmning uden behov 20 for isolering af lactasen fra det vandige ekstraktions-medium. Koncentrationerne af lactase i vand-glycerolopløsningen ved oprensningsbehandlingen er ikke kritisk; men de er i almindelighed i området fra ca. 1000 til 25000 lactaseenheder pr. ml, fortrinsvis fra ca. 2000 til 25 25000 enheder/ml. Den lactaseholdige vandige opløsning, der er opnået ved den ovenfor beskrevne ekstraktionsbehandling af alkohol- eller ketonbehandlede celler, op-koncentreres derfor fortrinsvis til dannelse af en passende lactasekoncentration forud for tilsætning af glyce-30 rol til opløsningen.

Oprensningsbehandlingen udføres fortrinsvis ved en temperatur på fra ca. 45 til 55 °C, fortrinsvis ved en pH-værdi i området 6,4 til 7,0, især fortrinsvis ved ca.

35 6,6, hvor lactasen er mest stabil. Lactasens stabilitet under oprensningsbehandlingen kan om ønsket, yderligere forstærkes ved tilsætning af et opløseligt divalent man DK 167226 Bl 9 gansalt til opløsningen, f.eks. mangansulfat, manganchlo-rid, mangannitrat eller lignende, i en mængde, der er tilstrækkelig stor til at tilvejebringe en manganionkon- „ -4 -2 centration på fra ca. 10 til 10 M.

5

Den lactaseholdige vand-glycerolopløsning opvarmes, indtil protease-aktiviteten er i væsentlig grad reduceret.

Den dertil nødvendige tid vil afhænge af reaktionstemperaturen; men den vil i almindelighed strække sig fra ca.

10 3 timer ved 60 °C til ca. 10 dage ved 35 °C, med optimale tider på ca. 6 til 12 timer ved en temperatur på 50 °C. Under behandlingsbetingelserne ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen denatureres protease-urenhederne hurtigt, og protease-aktiviteten kan reduceres til 10% eller mindre 15 af den oprindelige værdi under anvendelse af den foreliggende behandling. I modsætning hertil stabiliseres lacta-sen selektivt ved glycerolen og ved manganionen, dersom denne tilsættes, og man bibeholder mere end 90% af den oprindelige lactase-aktivitet. Under varmebehandlingen 20 dannes et bundfald af denatureret protein, inkluderende denatureret protease, og dette fjernes fra opløsningen, f.eks. ved filtrering til dannelse af en renset opløsning af den ønskede lactase. Lactasen kan derpå, om ønsket, isoleres fra denne opløsning ved for fagmanden kendte me-25 toder.

Den omhandlede oprensningsbehandling til selektiv reduktion af protease-aktivitet ud fra lactase-præparater ved opvarmning i nærvær af glycerol er særdeles egnet til op-30 rensning af lactase opnået ved behandling af gærceller med en alkohol eller en keton efterfulgt af ekstraktion i en vandig opløsning ved en pH-værdi på fra ca. 5,5 til 8,0. Den omhandlede fremgangsmåde til selektiv reduktion af protease-aktivitet kan imidlertid også anvendes til at 35 fjerne eller reducere protease-aktivitet i lactasepræpa- rater, der er opnået ved andre fremgangsmåder, f.eks. ved de ifølge den kendte teknik anvendte metoder til mekanisk DK 167226 B1 10 formaling eller homogenisering.

Opfindelsen belyses ved de følgende eksempler.

5 EKSEMPEL 1

Man fremstillede en kultur af Torula cremoris (Candida pseudotropicalis), der var fremskaffet fra University of California i Davis, California, kultur nr. UCD-55-31, 10 ved, at man dyrkede cellerne i 12 timer ved 28 °C i 1 liter næringssubstrat med følgende sammensætning: valle 40,0 g/liter (NH4)2S04 5,0 g/liter 15 K2HP04 S,0 g/liter majsstøbevand 1,0 g/liter

MgS04,7H20 0,5 g/liter hvis pH-værdi blev justeret til 4,5 med svovlsyre, og 20 substratet blev autoklaveret ved 110 °C i 45 minutter.

En 14-liters fermenteringsbeholder indeholdende 8,0 liter af et substrat med følgende sammensætning: 25 KH2P04 i,8 g/liter NH4H2P04 1,0 g/liter (NH4)2HP04 1,0 g/liter

MgS04,7H20 0,1 g/liter

FeS04,7H20 5,0 mg/liter 30 MnS04,7H20 5,0 mg/liter som forinden var blevet autoklaveret i 30 minutter ved 121 °C, blev podet (10% v/v) med det ovenfor beskrevne podemateriale.

En næringsvæske (2,6 liter) med følgende sammensætning.

35 11 DK 167226 B1 lactose 363 g/liter gærekstrakt 6,0 g/liter majsstøbevand 3,0 g/liter nicotinsyre 6,0 mg/liter 5 som forinden var blevet autoklaveret i 45 minutter ved 110 °C, blev tilsat kontinuert igennem 60 timers fermentering .

10 Mængden af opløst oxygen blev holdt over 10% under fermenteringens forløb ved beluftning og omrøring stigende fra 0,5 vol/vol/min til 0,75 vol/vol/min og 310 o/m til 380 o/m henholdsvis. Fermenteringstemperaturen var 30 °C, og pH blev holdt på 4,5.

15

Efter 60 timers forløb var cellekoncentrationen 18 g/liter, og lactaseindholdet i cellerne blev målt som værende 4200 enheder/gram. De stærkt lactaseholdige celler blev indhøstet ved filtrering.

20

Pastaen af gærceller, som indeholdt 1,8 gram celler opnået ud fra fermenteringsvæsken, blev behandlet med 6,3 g ethanol. Efter 90 minutters forløb blev ethanolet fjernet ved filtrering, og cellerne blev igen bragt suspenderet i 25 0,1 M kaliumphosphat-buffer, pH 6,6. Cellekoncentrationen i denne buffer blev justeret til ca. 40 g/liter. Lactase-frigørelse blev fremkaldt ved omrøring af de ethanol-behandlede celler i ekstraktionsbufferen igennem 15 timer. De ekstraherede celler blev derpå fjernet ved fil- 30 trering fra den lactaseberigede buffer. Den endelige enzymopløsning indeholdt ca. 6 mg/ml protein og 65 enheder /ml lactase-aktivitet, hvilket svarer til et udbytte på ca. 45% baseret på det intracellulære lactaseindhold i de indhøstede celler.

35 DK 167226 B1 12 EKSEMPEL 2

Fremgangsmåden i eksempel 1 blev gentaget på andre portioner indhøstede celler fremstillet i eksempel 1 under 5 anvendelse af forskellige alkoholer og ketoner i stedet for ethanol til behandling af celler. De således opnåede resultater var som følger:

Udbytte Lactase-aktivitet 10 Forbindelse % (enheder/ml) methanol 45 66 2-isopropanol 37 52 butanol 1 1,5 15 t-butanol 45 66 acetone 10 13 methylethylketon 10 13 methylisobutylketon 7,5 10 20 EKSEMPEL 3

Frigørelsen af lactase ved behandling af celler med ethanol efterfulgt af ekstraktion med 0,1 M natriumphosphat-bufferopløsning analogt med den fremgangsmåde, der er be-25 skrevet i eksempel 1, blev demonstreret over for stammer af Kluyveromyces fragilis. Cellerne blev dyrket i 24 timer i 1 liter af det pode-substrat, der er beskrevet i eksempel 1, i en 2-liters kolbe ved 30 °C, og de blev derpå indsamlet ved filtrering. Mængden af lactase fri-30 gjort fra ca. 1,5 g celler ved behandling med ethanol og påfølgende ekstraktion med 0,1 M kaliumphosphatbuffer, analogt med fremgangsmåden i eksempel 1, var som følger: 35 13 DK 167226 B1

Lactase

Mikroorganisme (enheder/ml) K. fragilis ATCC 8608 5,0 5 K. fragilis ATCC 8582 1,5 K. fragilis ATCC 10022 1,5 K. fragilis ATCC 12424 2,0 EKSEMPEL 4 10

Tre liter af en blanding 1:1 glycerol:0,1 M kaliumphos-phatopløsning, pH 6,6, der indeholdt 3000 enheder/ml lac- _3 tase og 0,24 proteaseenheder/ml, og som indeholdt 10 M manganioner, der var tilsat i form af mangansulfat, blev 15 opvarmet ved 50 °C i 6 timer. Under opvarmningen blev dannet et hvidt bundfald af denatureret protein, og dette blev frafiltreret. Den i opløsningen tilbageværende pro-tease-aktivitet var 0,03 enheder/ml, hvilket svarer til fjernelse af ca. 90% af den oprindelige protease-aktivi-20 tet. I modsætning hertil blev lactase-akti vi teten af den således fremstillede opløsning målt til 2760 enheder/ml, hvilket svarer til bibeholdelse af mere end 90% af den oprindelige lactase-aktivitet.

25 EKSEMPEL 5

Den i eksempel 4 beskrevne fremgangsmåde blev gentaget, idet man dog anvendte en temperatur på 37 "C i stedet for 50 °C. Efter 9 dages opvarmning var ca. 90% af den oprin-30 delige protease-aktivitet blev fjernet, medens man havde bibeholdt ca. 95% (2850 enheder/ml) af den oprindelige lactase-aktivitet.

35

Claims (4)

1. Fremgangsmåde til selektiv reduktion af protease-akti-5 vitet i et proteaseholdigt lactasepræparat, kendetegnet ved, at man opvarmer en vandig opløsning indeholdende præparatet og 30-90 vægt-% glycerol beregnet på den totale vægt af vand/glycerol-opløsningen til en temperatur på 35-60 °C ved en pH-værdi på 5,5-8,0, indtil 10 protease-aktiviteten er væsentligt reduceret.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at temperaturen er 45-55 °C, glycerol-koncentrationen i opløsningen er 40-60 vægt-% , og pH-værdien er 6,4- 15 7,0.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at opløsningen indeholder manganioner i en koncentration på 10-4 til 10“2 molær. 20

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at lactasepræparatet er fremstillet ved, at (a) lac-taseholdige gærceller ved en temperatur på 5-35 °C er bragt i kontakt med 20-95 vægt-% af en forbindelse valgt 25 blandt alkylalkoholer med 1-4 carbonatomer og dialkylke- toner med 1-4 carbonatomer i hver alkylgruppe, beregnet på den totale vægt af cellerne af forbindelsen, og (b) cellerne derpå ved en temperatur på 5-35 °C er bragt i kontakt med en vandig opløsning med en pH-værdi på 5,5-30 8,0, hvorpå cellerne er fjernet fra den resulterende lactase-holdige opløsning. 35