DE3244129A1

DE3244129A1 - Verfahren zur erzeugung von (alpha)-glycerophosphatoxidase

Info

Publication number: DE3244129A1
Application number: DE19823244129
Authority: DE
Inventors: Makoto Ootsu Ando; Shigenori Ootsu Emi; Yoshio Tsuruga Kojima; Yasuo Tsuruga Yajima
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1982-03-25
Filing date: 1982-11-29
Publication date: 1983-11-10
Also published as: JPS6121074B2; JPS58165789A; DE3244129C2

Description

Beschreibung
Die Erfindung betrifft das in den Patentansprüchen angegebene Verfahren, das sich zur Erzeugung von a-Glycerophosphatoxidase als sehr leistungsfähig erweist.
Es ist bekannt, daß α-Glycerophosphatoxidase (im f@ abgekürzt als a-GPO) durch Microorganismen erzeugt ru, die zum Genus Streptococcus (Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol 88, 250, 1960), zum Genus Lactobacillus (Journal of Biological Chemistry, Vol. 234, 2794, 1959), Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus cerevisiae (JP-Patentveröffentlichung Nr. 72892/1978) und zum Genus Aerococcus (JP-Patentveröffentlichung 15746/1980) gehören.
a-GPO eignet sich bekanntlich zur quantitativen Analyse von L-a-Glycerophosphat in Serum oder anderen Proben, von Glycerin durch Kombination mit Glycerinkinase, und von Triglycerid durch gekoppelte Reaktion mit Lipoproteinlipase und Glycerinkinase, so daß a-GPO besondere Beachtung findet als Reagens für Forschung und klinische Diagnose.
Um das bestehende Bedürfnis nach a-GPO zu befriedigen, wurden intensive Untersuchungen durchgeführt, mit dem Ziele, a-GPO in industriellem Maßstabe und billig zu gewinnen und es wurde nun gefunden, daß die Erzeugung von a-GPO wesentlich verbessert werden kann durch Züchtung eines a-GPO-produzierenden Microorganismus des Stammes Pediococcus, Streptococcus, Lactobacillus oder Leuconostoc in einem Nährmedium, das mindestens eine Verbindung bestehend aus z.B. Ascorbinsäure, Oxalessigsäure, a-Ketobuttersäure, a-Ketovaleriansäurev a-Ketoglyconsäure, a-Ketoglutarsäure oder deren Salze enthält.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird somit der a-GPO-produzierende Microorganismus in einem Nährmedium kultiviert, dem eine der in Anspruch 1 angegebenen a-Ketosäuren, Ascorbinsäure oder deren Salze zugesetzt ist und die gesuchte a-Glycerophosphatoxidase wird aus der erhaltenen Kulturbrühe isoliert.
Erfindungsgemäß kann durch Zusatz von z.B. Ascorbinsäure, a-Ketoglutarsäure, oder deren Salz zum Nährmedium die Erzeugbarkeit von a-GPO wesentlich gesteigert werden im Vergleich zu Herstellungsverfahren, wo keine derartige Säure oder deren Salz zugegeben wird.
Geeignete erfindungsgemäß verwendbare Stämme sind z.B.
a-Glycerophosphatoxidase-produzierende Microorganismen, die zum Genus Pediococcus gehören, z.B. Pediococcus acidilactici, Pediococcus cerevisiae, Pediococcus homari, Pediococcus parvulus, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus urinae-equi und dergleichen. Verwendbar sind ferner a-Glycerophosphatoxidase-produziernde Microorganismen, die zum Genus Streptococcus gehören, z.B.
Streptococcus faecalis, Streptococcus salvarius, Streptococcus cremoris, Streptococcus faecium und dergleichen und solche, die zum Genus Lactobacillus gehören, z.B. Lactobacillus planterum, Lactobacillus delbrueckii, lactobacillus fermentum, Lactobacillus pentoaceticus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus leichmannii und dergleichen, sowie solche, die zum Genus Leuconostoc gehören, z.B. Leuconostoc mesenteroides oder dergleichen.
Spezielle Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare Stämme sind Pediococcus acidilactici (FERM BP-211), Pediococcus cerevisiae (FERM BP-213), Pediococcus pentosaceus (FERM BP-215), Pediococcus parvulus (FERM BP-214), Pediococcus homari (FERM BP-212), Pediococcus urinaeequi (IFO 12173, ATCC 29722), Streptococcus faecalis (IFO 3971), Streptococcus faecium (IFO 12256, ATCC 14432) Lactobacillus leichmannii IFO 3073, ATCC 4797, DSM 20'Tr) Lactobacillus fermentum (IFO 3071, ATCC 9338, DSM20@@@ und dergleichen, die als solche bekannt und von des an sprechenden Hinterlegungsstellen von der öffentlichkeit leicht erhältlich sind, z.B. von FERM oder FRI (Fementation Research Institute, Ibaragi, Japan) oder IFO @@@(Institute of Fermentation, Osaka, Japan).
Zur Züchtung der angegebenen Microorganismen in einem Kulturmedium wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mindestens eine Verbindung, bestehend aus Ascorbinsäure, a-Ketosäure der in Anspruch angegebenen Formel (z.B.
a-Ketobuttersäure, a-Ketovaleriansäure, a-Ketocapronsäure, a-Ketomalonsäure, Oxalessigsäure, a-Ketoglutarsäure oder a-Ketogluconsäure) oder deren Salzen zum Nährmedium zugegeben, um die Produktivität des angestrebten Enzyms zu erhöhen.
Als Salz dieser Säuren eignen sich z.B. die Alkalimetallsalze,wie das Natriumsalz, Kaliumsalz und dergleichen, und die Erdalkalimetallsalze, wie Kalziumsalz und dergleichen.
Beim erfindungsgemäß verwendeten Nährmedium kann es sich um ein beliebiges bekanntes Kulturmedium handeln, wie es üblicherweise zur Kultivierung dieser Spezien von Microorganismen Verwendung findet, wobei lediglich die angegebene spezielle Säure oder deren Salz zum Nährmedium zugesetzt wird. Ein derartiges Kulturmedium e-nthält in der Regel einegeeignete Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Salze und einen organischen Wachstumsfaktor. Als Kohlenstoffquelle sind Glycerin, Glucose, Fruktose, Lactose, Saccharose, Wein- oder Likörmelasse und dergleichen verwendbar. Als Stickstoffquelle werden organische Stickstoffquellen,wie Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Maisquellwasser und dergleichen bevorzugt. Als anorganische Salze sind solche von Metallen wie Kalium, Natrium, Mangan, Magnesium, Zink, Eisen und dergleichen, sowie Salze von Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salzsäure, Salpetersäure und dergleichen verwendbar. Als organischer Wachstumsfaktor sind Hefeextrakt und Maisquellwasser besonders geeignet.
Die erfindungsgemäß verwendete Menge an Ascorbinsäure, a-Ketosäuren oder deren Salze beträgt 1 bis 10 g, vorzugsweise 2 bis 5 g pro 1 Kulturmedium. Vorzugsweise wird der pH-Wert des Kulturmediums etwa neutral gehalten und die aerobe Kultivierung, z.B. unter Belüftung erfolgtes Rühren,wird bei 25 bis 300C während 10 bis 30 h durchgeführt,um a-GPO in der Zelle anzureichern. Zur Extraktion und Isolierung von a-GPO aus der auf diese Weise erhaltenen Zelle wird diese nach einer der üblichen bekannten Methoden, z.B. mechanische Zerkleinerung, Ultraschallbehandlung, Autolyse oder Lysozymbehandlung oder durch eine geeignete Kombination dieser Methoden behandelt zur Erzielung einer zellfreien Enzymlösung, worauf die erhaltene Lösung nach üblichen bekannten Methoden, z.B. Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Ausfällen mit einem Lösungsmittel wie Aceton, Alkohol oder dergleichen, behandelt wird zur Erzielung eines Enzympräparats. Um höher gereinigte Enzympräparate zu erhalten, erweist sich die Anwendung von Ionenaustauschchromatographie oder Molekularsiebmethoden als empfehlenswert.
Die Bestimmung der Enzymaktivität einer nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen a-GPO sowie deren Ei- genschaften werden im folgenden anhand eines typischen Beispiels an der aus Pediococcus pentosaceus (FERM PB-215) erhaltenen «-GPO (gereinigtes Enzym mit 34,2 Sinheiten/mg, erhalten nach dem unten angegebenen Beispiel 2) erläutert.
A. Bestimmung der Enzymaktivität Die Enzymaktivität kann bestimmt werden, indem man a-XPO auf D,L-a-Glycerophosphat einwirken läßt und das gebildete Wasserstoffperoxid bestimmt. Das heißt, die Enzymaktivität von a-GPO wird erhalten durch Zersetzung des gebildeten Wasserstoffperoxids mit Peroxidase (POD) in Gegenwart von o-Aminophenol, wobei das o-Aminophenol quantitativ oxidiert und die dabei gebildete Farbverbindung bei 480 nm kolorimetrisch gemessen wird. Die Zusammensetzung der enzymatischen Reaktionslösung und die Reaktionsbedingungen sind wie folgt: (1) Zusammensetzung der Reaktionslösung: 0,45Mwäßrige D,L-a-Glycerophosphatlösung (pH 7,0) 1,0 ml 0, 45M K-phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) [enthaltend 0,125 °o (G/V) Triton X-100 als grenzflächenaktives Mittel 1,0 ml wäßrige POD-Lösung (15 Purpurogallin-Einheiten/ml) 1,0 ml 0,001M wäßrige o-Aminophenolhydrochloridlösung 1,0 ml Enzymlösung (0,004 bis 0,015 Einheiten/ml) 0,5 ml (2) Reaktionsbedingungen: Die Reaktion wird bei 370C während 10 min durchgeführt und danach durch Zugabe von 0,5 ml 4N-Salzsäure abgestoppt. Die gebildete Farbverbindung wird bei 480 nm kolorimetrisch bestimmt.
(3) Enzymaktivität: 1 Einheit des Enzyms ist definiert durch die Menge des Enzyms, welche 1 ßMol Wasserstoffperoxid in 1 min unter den oben angegebenen Reaktionsbedingungen bildet.
B. Wirkung Das erfindungsgemäß erhaltene Enzym oxidiert in ganz spezifischer Weise L-a-Glycerophosphat unter Katalysierung der Reaktion, bei der Dihydroxyacetonphosphat und Wasserstoffperoxid gebildet werden.
C. Enzymeigenschaften (1) Optimaler pH-Wert und pH-Stabilität: Der optimale pH-Wert des erfindungsgemäß erhaltenen Enzyms wurde mit einer Tris-Salzsäure-Pufferlösung (pH 7,0 bis 9,5) und einer K2CO3-NaHCO3-Pufferlösung (pH 9,0 bis 10,5) getestet und zu 8,0 bis 8,5 bestimmt.
Der pH-Bereich, in welchem das erfindungsgemäß erhaltene Enzym stabil bleibt, liegt bei 6,5 bis 8,5 bei einer 20 h langen Behandlung bei 25°C unter folgenden Bedingungen: pH 5,0 bis 7,0, 0,1M-Dimethylglutarsäure-NaOH-Pufferlösung; pH 7,0 bis 8,8, 0,1M-K-phosphat-Pufferlösung; pH 8,8 bis 10,0, K2CO3-NaHCO3-Pufferlösung.
(2) Optimale Temperatur: Die optimale Temperatur des erfindungsgemäß erhaltenen Enzyms liegt bei etwa 35 bis 40°C unter den unten angegebenen Bedingungen für die Bestimmung der Enzymaktivität (3) pH-Wert und Temperaturstabilität: Wenn das erfindungsgemäß erhaltene Enzym 15 min lang in einer 0,1M Dimethylglutarsäure-NaOH-Pufferlösung (pH 7,0) behandelt wird, ist es bis zu 400C stabil und behält 30 % seiner Aktivität sogar bei 50°C bei, es wird jedoch bei 55°C vollständig inaktiviert.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, wobei sich Prozentangaben auf das Gewicht beziehen.
Beispiel 1 Zu einer Nährmedium-Stammlösung mit einem Gehalt an 0,8 % Polypepton, 0,6 % Hefeextrakt, 1,0 % Glycerin, 1,5 % R2HPO4, 0,5 % KH2PO4, 0,05 % MgSO4.7H2O, 0,005 % FeSO4 7H2O, 0,003 % MnCl2X4H2O, 0,002 % NaCl, 0,0002 % CaCl2.2H2O und 0,0001 % ZnSO4 7H2O wurden jeweils 0,4 % der in Tabelle 1 aufgeführten, die a-GPO-Produktion fördernden Substanzen zugesetzt und nach Einstellung des pH-Werts auf 7,2 wurde jedes Nährmedium in 500-ml-Sakaguchi-Kolben in einer Menge von 50 ml pro Kolben eingebracht und bei 120°C 15 min lang sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde das Kulturmedium mit Hilfe einer Platinöse mit den in Tabelle 1 angegebenen, zum Genus Pediococcus gehörende Mi croorqanismen beimpft, die zuvor ausgesetzt waren, einer stab-Kultivierung bei 300C während 24 h in einem Milchsäure-Bakterien-Vorratskulturmedium (Nissui Seiyaku Co.), und anschließend einer Schüttelkultivierung (135 Rüttelungen pro min) bei 30 0C während 20 h unterworfen. Nach der Kultivierung wurden 5,0 ml der Kulturbrühe als Proben aus jedem Kolben entnommen und bei 10000 upm 10 min lang zentrifugiert zur Abtrennung der Zellen. Die erhaltenen Zellen wurden erneut suspendiert in 10 ml einer 0,1M-Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0), die 0,005M-EDTA enthielt, worauf durch Ultraschallbehandlung zerkleinert wurde zur Solubilisierung des Enzyms. Die erhaltenen Zelltrümmer wurden durch Zentrifugieren entfernt und die gewonnene überstehende Flüssigkeit wurde auf enzymatische Aktivität analysiert. Die Aktivität der erhaltenen a-GPO ist in Tabelle 1 aufgeführt. Aus Tabelle 1 ergibt sich völlig eindeutig, daß die Erzeugung von a-GPO wesentlich gesteigert wird durch die Zugabe von Oxalessigsäure, a-Ketobuttersäure, a-Ketovaleriansäure, a-Ketogluconsäure oder a-Ketoglutarsäure.

Tabelle 1

α-GPO-Produktion- Enzymaktivität (Einh./ml Kulturbrühe)

fördernde

Substanz

Oxal- α-Keto- α-Keto- α-Keto- α-Keto-

Stamm keine essig- butter- valerian- glucon- glutar-

säure säure säure säure säure

Pediococcus

acidilactici 0.057 0.47 0.41 0.35 0.15 0.41

(FERM BP- 211 )

Pediococcus

cerevisiae 0.069 0.42 0.37 0.30 0.12 0.40

(FERM BP- 213)

Pediococcus

pentosaceus 0.156 0.77 0.63 0.53 0.35 0.64

(FERM BP- 215)

Pediococcus

parvulus 0.075 0.45 0.40 0.35 0.18 0.41

(FERM BP- 214)

Pediococcus

bomari 0.123 0.68 0.49 0.37 0.22 0.63

(FERM BP- 212)

Pediococcus

urinae-eoui 0.040 0.35 0.32 0.32 0.15 0.38

IFO 12173

Beispiel 2 Zu dem in Beispiel 1 angegebenen Stamm- oder Standardkulturmedium wurden 0,4 % a-Ketoglutarsäure und 0,04 % eines handelsüblichen Antischaummittels (ADEKANOL LG-126 der Asahi Denka Co.) zugegeben und der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt. 15 1 des auf diese Weise erhaltenen Nährmediums wurden in einen 30 1-Schüttelfermenter eingebracht und durch Dampf bei 121°C während 15 min sterilisiert. Das Nährmedium wurde sodann aseptisch mit 150 ml einer Kulturbrühe von Pediococcus pentosaceus (FERM BP-215), die zuvor durch Schüttelkultivierung bei 300C während. 15 h in einem 2 l-Sakaguchi-Kolben unter Verwendung von 350 ml des Nährmediums der gleichen Zusammensetzung wie oben angegeben erhalten worden war, inokuliert, worauf bei 300C während 10 h unter Belüftung (14 1/min) und unter Rühren (160 upm) kultiviert wurde. Nach Beendigung der Kultivierung wurden 14 1 der Kulturbrühe (8400 Einheiten) mit Hilfe einer kontinuierlichen Zentrifuge behandelt, um die Zellen zu sammeln Die gewonnenen Zellen wurden in 1 1 einer 0,05M-Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0) suspendiert.

Die erhaltene Suspension wurde in einer Mühle mit Glaskugeln behandelt, um die Zellen zu zerkleinern. Nach der Zerkleinerung wurde eine Suspension von 2-1 unter Verwendung einer 0,05M-Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0), hergestellt und die Zellenbruchstücke wurden durch Zentrifugieren abgetrennt. Zu der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde zunächst Ammoniumsulfat bis zu 40%iger Sättigung zugesetzt und der unlösliche Anteil wurde als Niederschlag durch Zentrifugation entfernt. Danach wurde der erhaltene Flüssigkeitsüberstand weiter mit Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 65 % Sättigung versetzt unter Isolierung von a-GPO als Niederschlag. Die prozentuelle Aktivität, die in Form des Niederschlags isoliert wurde, betrug 80 % und die spezifische Aktivität erhöhte sich um das etwa 8-fache, wie entsprechende Untersuchungen zeigten.
Der erhaltene Niederschlag wurde in 200 ml einer 0,Ü)N-Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0) gelöst und die e«--haltene Lösung wurde entsalzt, indem sie durch eine S«u19 (1,5 l-Kapazität), die mit Sephadex G-25 (Handelsprodukt der Pharmacia Co.) gepackt und zuvor mit 0,05M-Kaliumphosphat-Pufferlösung ins Gleichgewicht gesetzt worden war, geschickt wurde, wobei die aktiven Fraktionen gesammelt wurden. Die auf diese Weise erhaltene salz freie Enzymlösung wurde durch eine DEAE-Sepharose (Handelsprodukt der Pharmacia Co.)-Säule (100 ml Kapazität), die zuvor mit einer 0,05M-Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0) ins Gleichgewicht gesetzt worden war, geschickt, um a-GPO daran zu adsorbieren. Nach dem Waschen der Säule mit der gleichen Pufferlösung wurde die a-GPO eluiert mit einem Strom von Natriumchloridlösung, deren Konzentration graduell anstieg und die hergestellt war durch Vermischen von 300 mi der angegebenen Pufferlösung und 300 ml der gleichen Pufferlösung, die 0,5M Natriumchlorid enthielt unter Bildung des Konzentrationsgradienten an Natriumchlorid. Die eluierten aktiven Fraktionen von a-GPO wurden vereinigt, ausgesalzen mit einer 70%gen Ammoniumsulfatsättigung und danach durch ein Molekularsieb in Form einer Sephadex G-150 (Handelsprodukt der Pharmacia Co.)-Säule, die mit einer 0,02M-Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,5) ins Gleichgewicht gesetzt worden war, geschickt. Die schließlich erhaltene Lösung, bei der es sich um v-GPO-Fraktionen handelte, die eine Molekularsieb-Sephadex G-150-Säule passiert hatten, wurde sodann lyophilisiert, wobei 73 mg eines a-GPO-Präpa- rats erhalten wurden. Die spezifische Aktivität dieses Produktes betrug 34,2 E/mg und die Ausbeute an Produkt aus dem Extrakt betrug 37,2 %.
Beispiel 3 Die in Beispiel 2 beschriebene Verfahrensweise wurde wiederholt unter Verwendung der Stämme Pediococcus acidilactici FERM BP-211, Pediococcus cerevisiae FERM BP-213, Pediococcus parvulus FERM BP-214, Pediococcus homari FERM BP-212, Pediococcus urinae-equi IFO 12173.
Durch Kultivierung und Reinigung in der angegebenen Weise wurde lyophilisierte a-GPO mit der in folgender Tabelle 2 angegebenen spezifischen Aktivität erhalten.

Tabelle 2 Spezifische lyophilisiertec Stamm Aktivität (Einh,/mg) Produkt (mg) Pediococcus acidilactici FERM BP- 211 24.3 65 Pediococcus cerevisiae FERM BP- 213 22.1 72 Pediococcus parvulus FERM BP -214 24.0 68 Pediococcus homari FERM BP- 212 32.0 71 Pediococcus urina.e-ecui 18.2 58 IFO 12173 Vergleichsbeispiel 1 In gleicher Weise wie in Beispiel 1 wurden die in der Tabelle angegebenen Microorganismen des Genus Pediococcus in einen Nährmedium kultiviert, das Brenztraubensäure enthiel ur die erhaltene a-GPO wurde gesammelt. Die Aktivität der ehaltenen a-GPO ist in der folgenden Tabelle 3 aufgeführt Tabelle 3

<x-GP0-Proddktion- Enzymaktivität -

fördernde

Substanz (Einh./ml Kulturbrühe)

S9n

Stamm Brenztraubensäure

Pediococcus acidilactici

FRRM BP- 211

Pediococcus cerevisiae

0 ,11

FERM BP- 213 0vll

Pediococcus tentosaceus

0.20

FERM BP- 215

Pediococcus parvulus

0.15

FERM BP- 214 0.15

Pediococcus homari

0.29

FERN BP- 212 0.29

Pediococcus urinae-eaui

0.10

IFO 12173

Beispiel 4 Zu einem Stamm-Kulturmedium mit einem Gehalt an 0,8 % Polypepton, 0,6 % Hefeextrakt, 1,0 % Glycerin, 1,5 % K2HPO4, 0,5 % KH2PO4 0,05 % MgSO47H20, 0,005 % FeSO4 7H2O, 0,003 % MnCl2g4H2O, 0,002 % NaCl, 0,0002 % CaCl2 und und 0,0001 % ZnSO4 7H2O wurden jeweils 0,3 % Ascorbinsäure, Natriumsalz derselben und Kaliumsalz derselben zugesetzt und nach der Einstellung des pH-Werts auf 7,2 wurde jedes Kulturmedium in 35 ml-Proberöhrchen in einer Menge von 7 ml/Röhrchen eingebracht und bei 120 0C 15 min lang sterilisiert. Nachdem Kühlen wurde das Nährmedium mit Hilfe einer Platinöse mit den in Tabelle 4 aufgeführten Microorganismen des Genus Pediococcus, die zuvor einer stab-Kultivierung bei 300C während 24 h in einem Milchsäure-Bakterien-Stammkulturmedium (Nissui Seiyaku Co.) unterworfen worden waren, angeimpft, worauf eine Schüttelkultivierung (360 Rüttelungen pro min) bei 30 0C während 20 h durchgeführt wurde. Nach der Kultivierung wurden 5t0 ml der Kulturbrühe als Proben aus jedem Teströhrchen entnommen und bei 10000 Upm 10 min lang zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Die erhaltenen Zellen wurden erneut suspendiert in 10 ml einer 0,1M-Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0), die 0,005 m ED1TA enthielten, worauf durch Ultraschallbehandlung zerkleinert wurde, um das Enzym zu solubilisieren. Die zerkleinerten Zellrückstände wurden durch Zentrifugieren entfernt und die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde zur Messung der enzymatischen Aktivität verwendet. Die Aktivität von a-GPO ist in der folgenden Tabelle 4 angegeben. Wie sich aus Tabelle 4 klar ergibt, wird die Erzeugung von a-GPO durch die Zugabe von Ascorbinsäure erheblich gesteigert.

Tabelle 4 Enzymaktivität (Einh./ml Kulturbrühe) Stamm Vergleich Ascorbin- Natrium- Kalita-(keine Zu- säure ascorbat ascorbat gabe) Pediococcus acidilactici 0.052 0.38 0.36 0.40 FERM BP- 211 Pediococcus cerevisiae 0.060 0.36 0.35 0.39 FERM BP- 213 Pediococcus pentosaceus 0.153 0.70 0.72 0.68 FERM BP- 215 Pediococcus parvulus 0.068 0.37 0.40 0.40 FERM BP- 214 Pediococcus homari FERM BP- 212 0.112 0.58 0.56 0.60 Pediococcus urinae-equi 0.044 0.29 0.28 0.30 IFO 12173 Beispiel 5 Zu dem in Beispiel 4 angegebenen Stamm-Kulturmedium wurden 0,3 % Natriumascorbat und 0,04 % handelsübliches Antischaummttel (ADEKANOL LG-126 der Asahi Denka Co.) zugegeben und der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt.
15 1 des auf diese Weise erhaltenen Nährmediums wurden in einen 30 1-Schüttelfermenter eingebracht und durch Dampf bei 121°C 15 min lang sterilisiert. Das Medium wurde sodann aseptisch mit 150 ml einer Kulturbrühe von Pediococcus pentosaceus FERM BP-215, die zuvor durch Schüttelkultivierung bei 300C während 15 h in einem 2 l-Sakaguchi-Kolben unter Verwendung von 350 ml Nährlösung der gleichen Zusammensetzung wie oben angegeben erhalten worden war, inokuliert. Daran schloß sich eine Kultivierung bei 300C während 15 h unter Belüftung (14 1/min) und unter Rühren (160 Upm) an. Nach Beendigung der Kultivierung wurden 14 1 der Kulturbrühe (9300 Einheiten) durch kontinuierliche Zentrifugation behandelt, um die Zellen zu sammeln. Die gewonnenen Zellen wurden suspendiert in 1 1 einer 0,05M-Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0).
Die erhaltene Suspension wurde in einer Mühle mit Glaskugeln behandelt, um die Zellen zu zerkleinern. Nach dem Zerkleinern wurde die Suspension auf 2.1 gebracht mit einer 0,05M-Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0) und die Zellbruchstücke wurden durch Zentrifugieren entfernt. Zu der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde zunächst Ammoniumsulfat bis zu 40%iger Sättigung zugesetzt und der unlösliche Anteil wurde als Niederschlag durch Zentrifugation entfernt. Danach wurde der erhaltene FLüssigkeitsüberstand weiter mit Ammoniumsulfat versetzt bis zu einer Endkonzentration von 65 % Sättigung, wodurch a-GPO als Niederschlag gewonnen wurde. Die prozentuelle Aktivität, die als Niederschlag isoliert wurde, betrug etwa 83 % und die spezifische Aktivität hatte sich um das etwa 8-fache erhöht, wie entsprechende Untersuchungen zeigten.
Der erhaltene Niederschlag wurde in 200 ml einer 0,Q~ Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0) gelöst und die erhl tene Lösung wurde entsalzt durch Durchleiten durch eine Säule (1,5 1 Kapazität), die mit Sephadex G-25 gepackt und zuvor mit einer 0,05M-Kaliumphosphat-Pufferlösung ins Gleichgewicht gesetzt worden war, wobei aktive Fraktionen gesammelt wurden. Die auf diese Weise erhaltene salzfreie Enzymlösung wurde durch eine DEAE-Sepharose-Säule (100 ml Kapazität), die zuvor mit einer 0,05M-Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0) ins Gleichgewicht gesetzt worden war, geschickt, um a-GPO zu adsorbieren. Nach dem Waschen der Säule mit der gleichen Pufferlösung wurde a-GPO eluiert mit einem Strom von Natriumchloridlösung, deren Konzentration graduell anstieg und die gewonnen war durch Vermischen von 300 ml der gleichen Pufferlösung und 300 ml der gleichen Pufferlösung, die 0,5M-Natriumchlortd enthielt, unter Bildung des Konzentrationsgradienten an Natriumchlorid. Die eluierten aktiven Fraktionen von a-GPO wurden vereinigt, durch 70teige Sättigung mit Ammoniumsulfat ausgesalzen und durch eine Molekularsieb-Sephadex G-150-SauleZ die mit einer 0,02M-Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,5) ins Gleichgewicht gesetzt worden war, geschickt. Die schließlich erhaltene Lösung, d.h. α-GPO-Fraktionen, die eine Molekularsieb-Sephadex G-1 50-Säule passiert hatten, wurde sodann lyophilisiert, wobei 109,8 mg a-GPO-Präparat erhalten wurden. Die spezifische Aktivität des Produktes betrug 32,6 Einheiten/mg und die Ausbeite des Produktes aus dem Extrakt betrug 38,5 -D.
Beispiel 6 Unter Verwendung der Stämme Pediococcus acidilactici FERM BP-211, Pediococcus cerevisiae FERM BP-213, Pediococcus parvulus FERM BP-214, Pediococcus homari FERM BP-212 und Pediococcus urinae-equi IFO 12173 wurde die Kultivierung und Reinigung in gleicher Weise wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt, wobei lyophilisierte a-GPO mit der in der folgenden Tabelle angegebenen spezifischen Aktivität erhalten wurde.
Tabelle 5 Stamm Spezifische lyophilisiertes Aktivität (Einh./mg) Produkt (mg) Pediococcus acidilactici FREM BP- 211 25.1 67 Pediococcus cerevisiae FERM BP-213 23.2 74 Pediococcus tarvulus PERM BP- 214 23.6 65 Pediococcus homari FREM BP- 212 34.8 73 Pediococcus urinae-eaui IFO 12173 20.5 60 Beispiel 7 Die Kultivierung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 4 durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß die in Tabelle 6 aufgeführten Stämme anstelle der in Tabelle angegebenen eingesetzt wurden. Die Extraktion aus den erhaltenen Zellen wurde ebenfalls wie in Beispiel 4 durchgeführt. Die Enzymaktivität wurde gemessen und die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 6 aufgeführt.
Tabelle 6 Enzymaktivität (Einh./ml Kulturbrühe) Stamm Vergleich Ascorbin- Natrium- Kalium-(keine Zu- säure ascorbat ascorbat gabe) ~~~ StreDtococcus faecalis 0.018 0.20 0.21 0.23 IFO 3971 Strentococcus faecium 0.051 0.50 0.54 0.52 IFO 12255 Lactobacillus leichmannii 0.005 0.06 0.08 0.08 DSM 20076 Lactobacillus fermentum 0.002 0.03 0.05 0.05 DS.t 20391

Claims

Verfahren zur Erzeugung von a-Glycerophosphatoxidase Patentansprüche 1. Verfahren zur Erzeugung von -Clycerophosphatoxidase, ddurch gekennzeichnet, daß man einen α-Glycerophosphatoxidase-produzierenden Microorganismus des Genus. Pediococcus, Streptococcus, Lactobacillus oder Leuconostoc in einem Nährmedium züchtet, das mindestens eine Verbindung bestehend aus Ascorbinsäure, einer #α-Ketosäure der Formel worin R den Rest CH3(CH2)m , HOOC(CH2)n oder CH2(OH)CH(OH)-CH(OH)CH-und m eine ganze Zahl von 1 bis 3 sowie n eine ganze Zahl von 0 bis 2 bedeuten, oder deren Salz enthält, und aus der erhaltenen Kulturbrühe a-Glyceroshosphatoxidase iso- liert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als a-Ketosäure a-Ketobuttersäure, a-Ketovaleriansäure, a-Ketocapronsäure, a-Ketomalonsäure, Oxalessigsäure, a-Ketoglutarsäure oder a-Ketogluconsäure einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Salz dieser Säure das Natriumsalz, Kaliumsalz oder Kalziumsalz einsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die aus Ascorbinsäure, der a-Ketosäure oder deren Salz bestehende Verbindung in einer Menge von 1 bis 10 g/l Nährmedium einsetzt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die aus Ascorbinsäure, der a-Ketosäure oder deren Salz bestehende Verbindung in einer Menge von 2 bis 5 g/l Nährmedium einsetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Microorganismus Pediococcus acidilactici (FERM BP-211), Pediococcus cerevisiae (FERM BP-213), Pediococcus pentosaceus (FERM BP-215), Pediococcus parvulus (FERM PB-214), Pediococcus homari (FERM BP-212), Pediococcus urinae-equi (IFO 12173, ATCC 29722), Streptococcus faecalis(IFO 3971), Streptococcus faecium (IFO 12256, ATCC 14432), Lactobacillus leichmannii (ATCC 4797, DSM 20076) oder Lactobacillus fermentum (ATCC 9338, DSM 20391) einsetzt.