DE3603257A1 - Thermostabile bilirubin-oxidase und verfahren zur herstellung derselben - Google Patents

Thermostabile bilirubin-oxidase und verfahren zur herstellung derselben

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Description

Die Erfindung betrifft eine neue Bilirubin-Oxidase und Verfahren zur Herstellung derselben. Insbesondere betrifft die Erfindung eine neue thermostabile Bilirubin- Oxidase und Verfahren und zur Herstellung dieser Bilirubin- Oxidase, bei dem man einen Bilirubin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Bacillus kultiviert und aus der erhaltenen Kulturbrühe die Bilirubin- Oxidase isoliert.
Bilirubin-Oxidase ist als Substrat-spezifisches Enzym für Bilirubin bekannt. Sie katalysiert eine Reaktion, bei der Biliverdin und Wasser aus Bilirubin und Sauerstoff gebildet werden. Es sind verschiedene Mikroorganismen bekannt geworden, welche Bilirubin-Oxidasen zu erzeugen vermögen, und zwar Mikroorganismen aus der Gattung Myrothecium [N.Tanaka und S.Murao, Agric.Biol. Chem., 46, 2499 (1982)], aus der Gattung Schizophyllum (JP-OS 1 35 886/1984) sowie aus den Gattungen Coprinus, Trametes. Lenzites, Coriolus, Pholiota, Pleurotus und Fomitopsis (JP-OS 1 98 971/1984).
Bilirubin-Oxidasen haben in jüngster Zeit zunehmendes Interesse auf sich gezogen als Reagentien zur Bestimmung des Bilirubingehalts sowie zur Beseitigung von Bilirubin, welches in bezug auf andere biochemische Substanzen in Serumproben auf dem Gebiet der klinischen Chemie zu Analysefehlern führt. Unter den herkömmlichen Bilirubin-Oxidaseproben sei das Enzym aus Myrothecium betrachtet. Es ist während 15 Minuten bei 37°C stabil. Bei 70°C hat es jedoch nur noch eine geringe Restaktivität von 20%. Andererseits ist das Enzym aus Schizophyllum bei bis zu 45°C nur während 10 Minuten stabil. Die Enzymproben aus anderen Mikroorganismen, z.B. das Enzym aus Coprinus, zeigt nach 10 Minuten bei 60°C eine Restaktivität von 90 bis 95%. Alle diese Enzyme zeigen keine befriedigende thermische Stabilität. Sie erfordern eine strikte Temperatursteuerung während der Herstellung und während der Behandlungen. Wenn sie zum Zwecke einer bestimmten Anwendung immobilisiert werden, so kann es je nach den Bedingungen des Immobilisierungsverfahrens zur Desaktivierung kommen. Sie sind somit in bezug auf ihre Handhabbarkeit nicht voll befriedigend.
Die Erfinder haben eine Anzahl von Untersuchungen durchgeführt. Es wurde festgestellt, daß ein Mikroorganismus- Stamm, B-0891, aus dem Boden von Owakidani, Hakonemachi, Ashigarashimo-gun, Kanagawa-ken, Japan, der zur Gattung Bacillus gehört, Bilirubin-Oxidase erzeugt, die eine Reaktion zu katalysieren vermag, bei der Biliverdin und Wasser aus Bilirubin und Sauerstoff gebildet werden. Die erhaltene Bilirubin-Oxidase ist bei etwa 70°C stabil.
Somit betrifft die Erfindung eine Bilirubin-Oxidase, welche thermostabil ist und Substrat-Spezifität mindestens in bezug auf Bilirubin aufweist und die Reaktion zur Bildung von Biliverdin und Wasser aus Bilirubin und Sauerstoff katalysiert. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Bilirubin-Oxidase. Bei diesem Verfahren wird ein Bilirubin-Oxidase erzeugender Mikroorganismus der Gattung Bacillus kultiviert und dann wird die erhaltene Bilirubin-Oxidase aus der Kulturbrühe isoliert.
Die erfindungsgemäße Bilirubin-Oxidase hat eine vorzügliche Thermostabilität und somit besteht geringe Gefahr einer Inaktivierung oder dergl. bei der Immobilisierung, welche bei einigen Anwendungen durchgeführt wird, oder während der Handhabung in der klinischen Diagnostik. Somit ist dieses Enzym leicht handhabbar. Erfindungsgemäß wird somit eine neue und fortschrittliche Bilirubin- Oxidase geschaffen.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Zeichnungen näher erläutert; es zeigen:
Fig. 1 ein Diagramm der Thermostabilität der erfindungsgemäßen Bilirubin-Oxidase;
Fig. 2 die optimale Temperatur der erfindungsgemäßen Bilirubin-Oxidase;
Fig. 3 die pH-Stabilität der erfindungsgemäßen Bilirubin-Oxidase; und
Fig. 4 den optimalen pH-Wert der erfindungsgemäßen Bilirubin-Oxidase.
Im folgenden werden bestimmte taxonomische Merkmale des erfindungsgemäßen Mikroorganismus zur Erzeugung der neuen Bilirubin-Oxidase angegeben.
(I) Morphologische Merkmale (erhalten nach der Kultivierung bei 30°C während 24 h auf gewöhnlichem Agar)
(1) Gestalt, Größe und Pleomorphismus der Zellen:
Diskreter oder kurzkettiger Bacillus mit runden Kanten, Größe: 0,5 bis 0,8 × 2,0 bis 40 µm.
Kein Pleomorphismus
(2) Mobilität und Flagellen:
keine.
(3) Spore (Gestalt, Größe, Ort, Schwellung des Mikroorganismenkörpers):
Eine ovale oder zylindrische Spore von 0,5 × 1,0 µm wird zentral gebildet oder an einem Ort in der Nähe des Zentrums. Der Mikroorganismenkörper schwillt durch die Spore nicht an.
(4) Gram-Färbung:
positiv.
(5) Säurefeste Färbung:
negativ.
(II) Wuchstests
(1) Nähragarplattenkultur (28 bis 30°C, 24 h):
Es wird eine kreisförmige, flache und weiche Kolonie gebildet. Die Peripherie ist unregelmäßig und die Oberfläche etwas trocken. Die Farbe ist grauweiß und es wird kein löslicher Farbstoff gebildet.
(2) Nähragar-Schrägkultur (28 bis 30°C, 24 h):
Der Mikroorganismus wächst in Linien und zeigt gutes Wachstum. Die Farbe ist grauweiß und es wird kein löslicher Farbstoff gebildet.
(3) Flüssige Kultur (Peptonlösung, 28 bis 30°C, 24 h):
Das Wachstum ist schwach und es wird ein weichhaariges Präzipitat gebildet.
(4) BCP-Milch (28 bis 30°C, 24 h):
Die Lösung wird alkalisch und peptonisiert.
(III) Physiologische Eigenschaften
(IV) Erzeugung von Säuren und/oder Gas aus Zuckern (Basiskulturmedium: Pepton-freies Kulturmedium, NH4
H2
PO4
1,0 g, KCl 0,2 g, MgSO4
·7H2
O 0,2 g, Hefeextrakt 1,0 g, Agar 3,0 g, BTB (0,2%) 10,0 ml, destilliertes Wasser 1000 ml, pH 7,2):
Tabelle 1
Aus den obigen Hauptcharakteristika ergibt sich, daß der erfindungsgemäße Stamm ein diskreter oder kurzkettiger, grampositiver, nicht-beweglicher Bacillus mit abgerundeten Kanten ist. Es handelt sich um einen Catalase-positiven und Oxidase-positiven Organismus, welcher aus Glucose fermentativ Säuren erzeugt. Er wächst bei 50°C und der Guanin- und Cytosin-Gehalt (GC %) der Nucleinsäure beträgt 44%.
Unter Bezugnahme auf "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Auflage (1974), wird der Mikroorganismus als Stamm der Gattung Bacillus angesehen. Ferner wurden die Hauptcharakteristika des erfindungsgemäßen Stamms verglichen mit denjenigen von Bacillus licheniformis, Bacillus cereus und Bacillus coagulans, bei denen es sich um ähnliche Mikroorganismen handelt. Dabei wurde Bezug genommen auf das Handbook Nr. 427 "The genus Bacillus", und verschiedene Charakteristika von Bacillus licheniformis zeigen eine gute Übereinstimmung mit dem Mikroorganismus der Erfindung. Bestimmte Unterschiede ergeben sich jedoch hinsichtlich der Mobilität und der Salzfestigkeit. Somit wird angenommen, daß es sich um einen Stamm von Bacillus licheniformis handelt. Als Bezeichnung wird daher "Bacillus licheniformis B-0891" gewählt.
Der Stamm wurde bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, unter der Hinterlegungsnummer BP-952 (FERM BP-952) am 22. Dezember 1984 hinterlegt.
Zur Herstellung von Bilirubin-Oxidase wird der Bilirubin- Oxidase erzeugende Mikroorganismus nach dem zum Zwecke der Enzymgewinnung üblichen Verfahren kultiviert. Es handelt es sich entweder um eine flüssige Kultur oder um eine feste Kultur. Zur industriellen Durchführung ist es bevorzugt, Zellen des Bilirubin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus auf ein Kulturmedium zu impfen, welches sich für die Produktion eignet, und sodann unter Rühren submers und unter Belüftung zu kultivieren. Es kommt eine große Vielzahl verschiedener Kulturmedien, welche üblicherweise bei Mikroorganismen eingesetzt werden, zur Gewinnung der Bilirubin-Oxidase in Betracht. Als Stickstoffquelle kann man jede metabolisierbare Stickstoffverbindung verwenden. Man kann z.B. Maisquellflüssigkeit, Pepton, Casein, Sojabohnenmehl, Hefeextrakt, verschiedene Fleischextrakte oder dergl. verwenden. Ferner kann man jede metabolisierbare Kohlenstoffquelle einsetzen, z.B. Melassen, Glucose, Glycerin, Saccharose, Dextrin und dergl. Ferner kann man verschiedene anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, primäres Kaliumphosphat und sekundäres Kaliumphosphat, verwenden. Die Temperatur wird auf einen Bereich eingestellt, in dem der Mikroorganismus wächst und Bilirubin-Oxidase erzeugt. Vorzugsweise liegt die Temperatur im Bereich von 25 bis 30°C. Die Kultivierungszeit hängt von den Bedingungen ab und beträgt ungefähr 7 bis 8 Tage. Es ist natürlich erwünscht, die Kultivierung an einem zweckentsprechenden Punkt abzubrechen, indem man feststellt, wann die Bilirubin-Oxidase ihr Potenzmaximum erreicht.
Nach beendeter Kultur wird ein übliches Enzym-Gewinnungsverfahren angewendet, um das Enzym von der Kulturbrühe zu isolieren und zu reinigen. Das Enzym findet sich sowohl in den Zellen als auch in der überstehenden Kulturbrühe. Es wird jedoch gewöhnlich aus Gründen der Gewinnungseffizienz aus der überstehenden Brühe isoliert, nachdem die Zellen entfernt wurden. Es ist jedoch auch möglich, das Enzym nach üblichen Verfahren aus den Zellen zu gewinnen, und zwar in Kombination mit einer Gewinnung aus der überstehenden Brühe. Die auf diese Weise erhaltene, rohe Enzymlösung wird nach üblichen Reinigungsverfahren, welche bei Proteinen, Enzymen oder dergl. angewendet werden, isoliert und gereinigt. Man erhält Bilirubin-Oxidase in gereinigter Form. Beispielsweise kann man eine Lösung, welche rohe Bilirubin- Oxidase enthält, einer fraktionierten Fällung unterwerfen, wobei man von einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Methanol oder Ethanol, Gebrauch macht. Oder man kann ein Aussalz-Verfahren anwenden, wobei man Ammoniumsulfat, Natriumchlorid oder Aluminiumsulfat einsetzt. Hierdurch wird das Enzym aus der Lösung ausgefällt, und es wird in roher Form isoliert.
Erforderlichenfalls kann man das rohe Enzym einer weiteren Reinigung unterwerfen. Das Präzipitat wird in einem Lösungsmittel, wie Tris-HCl-Puffer aufgelöst. Die erhaltene Lösung wird sodann gereinigt, indem man in zweckentsprechender Weise die folgenden Verfahren kombinieren kann: Adsorptions-Chromatographie unter Einsatz von Ionenaustauscherharzen, wie Diethylaminoethylcellulose, Diethylaminoethyldextrangel oder quaternäres Aminoethyldextrangel; Adsorptions-Chromatographie unter Einsatz einer Gelfilterhilfe, wie Dextrangel oder Polyacrylamidgel. Sodann erfolgt Trocknung nach bekannten Verfahren, z.B. Lyophilisierung. Man erhält die Bilirubin-Oxidase in gereinigter Form.
Im folgenden seien die physikalischen und chemischen Eigenschaften der erhaltenen Bilirubin-Oxidase genannt:
(I) Verfahren zur Messung der Aktivität
Ein Reaktionsgemisch (1,49 ml) der obigen Zusammensetzung wird in ein kleines Reagenzglas gegeben. Nach dem Erhitzen auf 37°C gibt man 0,01 ml einer 10 mM Bilirubin-Lösung zu, um die Reaktion zu starten. Dann läßt man 10 min bei 37°C reagieren. Nach der Umsetzung werden 1,5 ml 1% CPC (N-Cetylpyridiniumchlorid) zugesetzt, um die Reaktion abzubrechen. Das Reaktionsgemisch wird sodann einer colorimetrischen Analyse bei 453 nm unterworfen, um die Absorbanz [S] festzustellen. Als Vergleichsprobe verwendet man ein Reaktionsgemisch (1,44 ml) des gleichen Typs, wobei jedoch die Enzymlösung weggelassen wird und 0,01 ml der Bilirubinlösung eingesetzt werden. Die erhaltene Mischung wird präzise 10 min bei 37°C inkubiert. Danach werden 1,5 ml einer 1% CPC und 0,05 ml der Bilirubin-Oxidase-Lösung nacheinander zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wird der colorimetrischen Analyse bei 453 nm zur Bestimmung seiner Absorbanz [B] unterworfen. Die enzymatische Aktivität errechnet sich aus folgender Gleichung:
wobei 1 Einheit (E) der enzymatischen Aktivität definiert ist als Menge des Enzyms, welche 1 µMol Bilirubin/ min unter den beschriebenen Bedingungen oxidiert.
(II) Substrat-Spezifität
Unter Verwendung von Sauerstoffelektroden wurde die Spezifität gegenüber verschiedenen Substraten untersucht, basierend auf der Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle 2. In jedes der Substrate wurde in einer Menge von 0,1 mM verwendet, während das Enzym in einer Menge von 0,005 E eingesetzt wurde.
Tabelle 2
(III) Enzymatische Reaktion
Die folgende Reaktion wird katalysiert:
Bilirubin + 1/2 O2 → Biliverdin + H2O.
Die Oxidation von Biliverdin zu einer hellpurpurnen Substanz gemäß folgender Gleichung findet nur in einem äußerst geringen Ausmaß statt:
Biliverdin + 1/2 O2 → Hellpurpurne Substanz + H2O.
(IV) Thermostabilität
Nach der Behandlung von Teilen des Enzyms während 10 min bei verschiedenen Temperaturen im Bereich von 30 bis 100°C werden diese Enzymmengen in Eis-Wasser abgekühlt. Die Restaktivität wird sodann nach dem enzymatischen Aktivitätsassay-Verfahren gemessen. Die Ergebnisse finden sich in Fig. 1. Die Aktivität der Bilirubin-Oxidase der Erfindung bleibt bis zu etwa 70°C stabil und bei 90°C sind noch mehr als 50% der Aktivität vorhanden.
(V) Optimale Temperatur
Man verwendet das Reaktionsgemisch und das Meßverfahren gemäß dem obigen Assayverfahren (I), wobei der Einfluß der Temperatur bei verschiedenen Temperaturwerten ermittelt wurde. Die Ergebnisse finden sich in Fig. 2. Die optimale Temperatur der Bilirubin-Oxidase der Erfindung liegt bei etwa 80°C.
(VI) pH-Stabilität
Portionen des Enzyms werden 1 v bei 37°C in Pufferlösungen von verschiedenen pH-Werten inkubiert. Danach wird die Aktivität nach dem obigen Assayverfahren gemessen und der Einfluß des pH-Wertes ermittelt. Die Ergebnisse finden sich in Fig. 3, wobei die Kurven ⊗ - ⊗, ○ - ○, ⚫ -⚫ und ○ - ○ Acetat-Puffer (pH 4,0 bis 6,0) bzw. Dimethylglutarsäure-NaOH-Puffer (pH 7,5 bis 9,0) bzw. Phosphat-Puffer (pH 6,5 bis 8,0) bzw. Tris- HCl-Puffer (pH 7,5 bis 9,0) bedeuten. Die Bilirubin- Oxidase der Erfindung ist im pH-Bereich von ungefähr 7 bis 9 stabil.
(VII) Optimaler pH-Wert
Der Einfluß des pH-Wertes auf die Aktivität des Enzyms der Erfindung wird mit Pufferlösungen verschiedener pH-Werte nach dem obigen Assayverfahren ermittelt. Die Ergebnisse finden sich in Fig. 4. Die Kurven mit den Symbolen ⊗ - ⊗, ○ - ○, ⚫ - ⚫ und ○ - ○ bezeichnen Acetatpuffer (pH 4,0 bis 6,0) bzw. Dimethylglutarsäure- NaOH-Puvver (pH 7,5 bis 9,0) bzw. Phosphatpuffer (pH 6,5 bis 8,0) bzw. Tris-HCl-Puffer (pH 7,5 bis 9,0); der optimale pH-Wert der Bilirubin-Oxidase gemäß der Erfindung liegt bei etwa pH 8.
(VIII) Inhibierung und Aktivierung
Die Bilirubin-Oxidase der Erfindung wird durch die Metallionen Cu2+, Zn2+ und Mn2+, durch CPC und Kation FB (Nippon Oils and Fats Co., Ltd.) inhibiert und durch FAD aktiviert.
(IX) Molekulargewicht
Das Molekulargewicht beträgt 50 000 ± 10 000, gemessen durch Gelfiltration an Sephacryl S-300.
(X) Isoelektrischer Punkt
Durch isoelektrische Fokussierungselektrolyse wurde der isoelektrische Punkt bei etwa pH 3,35 gefunden.
(XI) Km-Wert
Der Km-Wert beträgt 2,86 × 10-5 M (bei pH 8,0).
In Tabelle 3 wird das erfindungsgemäße Enzym mit den herkömmlichen Bilirubin-Oxidase-Proben verglichen.
Tabelle 3
Wie oben erläutert, ist das erfindungsgemäße Enzym von den bekannten Bilirubin-Oxidasen verschieden, und zwar in bezug auf verschiedene enzymo-chemische und physio- chemische Charakteristika. In bezug auf die Thermostabilität ist anzumerken, daß selbst im Falle der Bilirubin- Oxidase aus Coprinus, welche die höchste bisher bekannte Thermostabilität unter den herkömmlichen Bilirubin- Oxidase-Proben aufweist, die Restaktivität nach einer 10minütigen Behandlung bei 60°C 90 bis 95% beträgt. Demgegenüber ist die Bilirubin-Oxidase der Erfindung beim 10minütigen Erhitzen auf 70°C stabil und zeigt noch beim 10minütigen Erhitzen auf 90°C eine Restaktivität von 50%. Somit ist die erfindungsgemäße Bilirubin-Oxidase ein in hohem Maße thermostabiles Enzym. Darüber hinaus hat das erfindungsgemäße Enzym einen sehr kleinen Km- Wert von 2,86 × 10-5 M, d.h. seine Reaktivität ist extrem gut.
Im folgenden wird die Erfindung anhand eines Beispiels näher erläutert.
Beispiel
Man verwendet Bacillus licheniformis B-0891 (FERM BP- 952). Ein 500 ml Erlenmeyerkolben wird mit 100 ml eines Kulturmediums beschickt. Dieses wurde zuvor 20 min bei 120°C sterilisiert und hat einen pH von 7,5. Es enthält 1,0% (Gew./Vol.) Saccharose, 1,0% (Gew./Vol.) Hefeextrakt (Meast(R); Asahi Breweries, Ltd., Tokyo, Japan), 0,3% (Gew./Vol.) NaCl, 0,05% (Gew./Vol.) MgSO4 · 7H2O und 0,1% (Gew./Vol.) K2HPO4. Dieses Medium wird mit dem Mikroorganismus geimpft. Sodann erfolgt eine Kultivierung unter Schütteln bei 30°C während 24 h, wobei man eine Keimkultur erhält. Sodann wird mit dieser Keimkultur ein Fermentationsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 30 l inokuliert, welches 20 l eines Kulturmediums enthält. Das Kulturmedium wurde 20 min bei 120°C sterilisiert und hat einen pH von 7,5. Es enthält 0,1% eines Anti- Schäummittels (Disfoam CB-442; Nippon Oils and Fats Co., Ltd.). Es hat die gleiche Zusammensetzung wie das obige Kulturmedium. Es erfolgt wiederum eine Kultivierung unter aeroben Bedingungen und unter Rühren bei 30°C und 300 U/min während 8 Tagen und unter einer Belüftung von 20 l/min. Nach beendeter Kultivierung wird die Kulturbrühe abzentrifugiert (5000 U/min während 15 min) und die überstehende Flüssigkeit (13,8 l, 200 E) abgetrennt). Sie wird sodann einer Ultrafiltrierung unterworfen (auf einem Modulapparat), wobei eine Einengung auf 1,96 l erfolgt. Das erhaltene Konzentrat wird sodann mit gekühltem Aceton versetzt, dessen Volumenmenge dem 0,6fachen des Volumens des Konzentrats entspricht. Dann wird mit 5000 U/min während 15 min zentrifugiert, wobei die unlöslichen Bestandteile entfernt. Danach wird das erhaltene Konzentrat wiederum mit gekühltem Aceton versetzt, und zwar mit der 1,6fachen Volumenmenge, bezogen auf das Konzentrat. Dabei fällt eine aktive Fraktion der Bilirubin-Oxidase aus. Die aktive Bilirubin-Oxidase-Fraktion wird sodann durch Zentrifugieren (500 U/min während 15 min) abgetrennt und in 0,2 M Tris-HCl-Puffer aufgelöst. Man erhält eine Enzymlösung mit einem Volumen von 205 ml (200 E). Sodann wird ein Celluloseacetat-Röhrchen verwendet und die Enzymlösung damit über Nacht gegen 15 l 10 mM Tris- HCl-Puffer (pH 7,5) dialysiert. Sodann wird das Dialysat an DEAE-Sepharose-CL-6B-Säule (5,0 × 14,5 cm) adsorbiert, welche zuvor mit dem obigen Puffer abgepuffert wurde. Die Säule wird sodann zur Dichteabstufung elutioniert, wobei man mit 0 bis 1,0 molarem Kaliumchlorid arbeitet. Die Fraktionen mit Enzymaktivität werden bei den Kaliumchlorid-Konzentrationen von 0,3 bis 0,5 Mol elutioniert. Danach wurden die aktiven Bilirubin-Oxidase-Fraktionen durch eine Ultrafiltrationsmembran "XM-50" (Amicon, Corp.) konzentriert, gefolgt von einer entwicklung mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) an einer Sephacryl S-200-Säule (3,6 × 80 cm). Man isoliert die Fraktionen mit Bilirubin- Oxidase-Aktivität von 580 bis 640 ml und diese werden sodann lyophilisiert, wobei man 350 mg (90, E) Bilirubin-Oxidase in Pulverform erhält.

Claims (6)

1. Bilirubin-Oxidase mit Substrat-Spezifität mindestens gegenüber Bilirubin und mit einer Befähigung zur Katalysierung einer Umsetzung, bei der Biliverdin und Wasser aus Bilirubin und Sauerstoff gebildet werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Bilirubin-Oxidase eine hohe Thermostabilität aufweist.
2. Bilirubin-Oxidase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie beim Erhitzen während 10 Minuten auf etwa 70°C thermostabil ist.
3. Bilirubin-Oxidase nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:
  • (a) Molekulargewicht: 50 000 ± 10 000 (gemessen durch Gelfiltration an Sephacryl S-300);
  • (b) isoelektrischer Punkt: etwa pH 3,35;
  • (c) Km-Wert: etwa 2,86 × 10-5 M;
  • (d) optimaler pH-Wert: etwa pH 8;
  • (e) stabiler pH-Wert: stabil bei etwa pH 7 bis 9;
  • (f) optimale Temperatur: etwa 80°C; und
  • (g) Thermostabilität: stabil bis zu etwa 70°C.
4. Verfahren zur Herstellung von Bilirubin-Oxidase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Bilirubin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Bacillus kultiviert und sodann aus der erhaltenen Kulturbrühe die Bilirubin-Oxidase isoliert.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bilirubin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Bacillus einen Mikroorganismus der Species Bacillus licheniformis verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bilirubin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus Bacillus licheniformis B-0891 (FERM BP-952) einsetzt.
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