DE3151616C2

DE3151616C2 - Verfahren zur Herstellung einer Cholesterinoxidase

Info

Publication number: DE3151616C2
Application number: DE3151616A
Authority: DE
Inventors: Susumu Ootsu Matsui; Kazuo Nakajima; Tsutomu Kyoto Taniguchi
Original assignee: TAKARA SHUZO CO Ltd KYOTO JP
Current assignee: TAKARA SHUZO CO Ltd KYOTO JP
Priority date: 1980-12-26
Filing date: 1981-12-28
Publication date: 1985-10-31
Also published as: DE3151616A1; JPS6048159B2; GB2090259B; FR2497228A1; JPS57122792A; GB2090259A; FR2497228B1; US4425435A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cholesterinoxidase durch Züchtung eines Stammes der Klasse Basidiomycetes, der zur Bildung von Cholesterinoxidase in einem Kulturmedium befähigt ist, zur Ansammlung von Cholesterinoxidase und Gewinnung der Cholesterinoxidase aus der erhaltenen Kulturbrühe sowie die nach dieser Arbeitsweise erzeugte Cholesterinoxidase.

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Cholesterinoxidase^ die zur Oxidation von Cholesterin unter Bildung von ChoIest-5-en-3-on und Wasserstoffperoxid fähig ist, und sie betrifft auch ein Verfahren zur Erzeugung einer solchen neuen Cholesterinoxidase durch Züchtung von Gloeocystidium chrysocreas FERM BP 661 und Gewinnen der gebildeten Cholesterinoxidase aus dem Kulturfiltrat (vgl. die beiden Patentansprüche).

In den letzten Jahren wurde mit dem Fortschritt der Untersuchungen über die physiologische Signifikanz von Cholesterin H vivo eine Zunahme oder Abnahme der Menge an Serum-Cholesterin allmählich als medizinisch wichtig betrachtet Zum Beispiel wurde gefunden, daß eine extreme Zunahme von Serum-Cholesterin bei den Krankheiten Arteriosklerose unv Gehirnblutungen festzustellen ist. Als Ergebnis wurde eine Zunahme von Serum-Cholesterin, wie sie durch dessen Bestimmung nachgewiesen wird, zur Diagnose von Zuständen derartiger Krankheiten, wie Arteriosklerose und Gehirnblutung, angewandt.

Diese Bestimmung von Serum-Cholesterin wurde im allgemeinen durch eine chemische colorimetrische Methode durchgeführt. Jedoch erfordert die chemische colorimetrische Methode eine große Menge an Blut, komplizierte analytische Verfahren und eine lange Zeit zur Durchführung. Diese Methode ist daher unerwünscht und unpraktisch.

Kürzlich wurde für das klinische Laboratorium die Anwendung der sogenannten enzymatischen Methode zur quantitativen Bestimmung von Serum-Cholesterin entwickelt, gemäß welcher eine gewisse Cholesterinoxidase, die zur Oxidation von Cholesterin in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von Cholest-4-en-3-on und Wasserstoffperoxid befähigt ist, das dann colorimetrisch für die quantitative Analyse bestimmt wird, angewandt wird. So kann durch die quantitative Analyse des so gebildeten Wasserstoffperoxids die Menge oder Konzentration an Serum-Cholesterin bestimmt werden.

Im allgemeinen ist die Cholesterinoxidase, die für die obige enzymatische Reaktion bekannt ist, ein Enzym, das Cholesterin in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von ChoIest-4-en-3-on und Wasserstoffperoxid oxidiert. Somit ist das Merkmal der herkömmlichen Cholesterinoxidase, daß eines der durch die Umsetzung mit Cholesterin gebildeten Produkte immer Cholest-4-en-3-on ist.

Die Mikroorganismen, von denen bekannt ist, daß sie zur Erzielung solcher Cholesterinoxidase befähigt sind, sind Nocardia spp. (Clin. Chem. voL 19, Π50-1356 (1973)), Brevibactei .um sterolicum (Agric B .öl. Chem. vol. 37, 2345-2350 (1973)), Streptomyces spp. (Chem. Pharm. BuIL voL 21, 2057-2060 (1973)) und Schizophillum commune (US-PS 40 03 794 (1977)). Es ist wohlbekannt, daß bei Umsetzung dieser bekannten Cholesterinoxidasen mit ^P-SZ-Hydroxysteroiden. immer 2f-3-oxosteroide gebildet werden.

ίο Die vorliegende Erfindung liefert eine neue Cholesterinoxidase, die wertvoll für die oben erwähnte enzymatische Methode zur Bestimmung von Serum-Cholesterin ist Die neue Cholesterinoxidase gemäß der Erfindung unterscheidet sich enzymatisch von der bekannten Cholesterinoxidase, da die Umsetzungsprodukte der Reaktion mit ^-3/?-Hydroxysteroiden z/⁵-3-Qxosteroide statt zf-S-Oxosteroide sind. Zum Beispiel sind die Umsetzungsprodukte der neuen Cholesterinoxidase mit Cholesterin nicht Cholest-4-en-3-on und Wasserstoffperoxid sondern Cholest-S-en-3-on und Wasserstoffperoxid.

Gemäß dieser Erfindung wird die neue Cholesterinoxidase erzeugt durch Kultivierung des Stammes Gloeocystidium chrysocreas FERM-BP 661, der zur Klasse Basidiomycetes gehört und zur Erzeugung von Cholesterinoxidase in einem Kulturmedium befähigt ist, und Gewinnung der Cholesterinoxidase aus dem Kulturfiltrat
Dieser Stamm wurde am 1.5.1981 beim Fermentation Research Institute, Kyoto, hinterlegt und erhielt die No. FERM P-5783, die inzwischen in FERM BP-661 geändert wurde.
Die Charakteristika dieses Stammes sind wie folgt:

Gloecystidium chrysocreas FERM-P 5783,
jetzt FERM BP-661

Fruchtkörper: 4 bis 8 χ 2 bis 3 cm im Querschnitt. Alle Fruchtkörper wenden sich dem Holz zu und sie haben keine Hüte. Sie breiten ^c,ich auf Rinde aus und können nicht abgezogen werden. Die Oberfläche ist eigelb, glatt oder hat eine kleine Menge warzenartiger Hocker, zeigt Sprünge wenn trokken. Fleisch gelblichgrün, 120 bis 300 Mikron dick. Rand dünn und lederig. Das Mycel ist aufgerichtet, Bereich 2 Mikron mit vielen sackförmigen großen Zellen, Größe 15 bis 20x6 bis 9 Mikron. Sackförmige große Zellen verändern sich durch Zugabe von KOH-Lösung zur Rosafärbung. Sporen: weiß in Masse, ellipsoid, glatt, Größe 4 bis 5x2 bis 3 Mikron.

Die Identifizierung wurde nach folgenden Büchern durchgeführt: »Coloured Illustrations of Fungi of Japan«, Bd. I und Bd. II, herausgegeben von Rokuya Imazeki und Tsugio Hongo (publiziert von Hoiku-Sha, Osaka, Japan) 1965 und »Mycological flora of Japan«, herausgegeben von Seiya Ito (publiziert von Yoken-Do, Tokyo, Japan), Bd. 2, Nr. 1955.
Bei der Erzeugung der Colestrinoxidase gemäß dieser Erfindung wird der StammFERM BP-661 aerob in einem Nährmedium in für die Züchtung von Fungi der Klasse Basidiomycetes bekannter Art und Weise gezüchtet. Die Züchtung kann auf festen Kulturen oder in flüssigen Kulturen erfolgen, jedoch wird letzteres für die großtechnische Erzeugung bevorzugt

Als Medium für die Züchtung können natürliche oder synthetische Medien verwendet werden, die verschiedene an sich bekannte Nährmittel enthalten, wie beispiels-

weise eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle organische oder anorganische Salze, und dergleichen. Die Kohlenstoffquelle kann z. B. Glucose, Fructose, Glyzerin, Melasse, Melasseabfall oder verschiedene Stärken sein, beispielsweise lösliche Stärke, Maisstärke, Kartoffelstärke, und dergleichen. Als Stickstoffquelle kann beispielsweise Harnstoff, Hefesxtrakt, Maltoseextrakt, Pepton, Maisquellwasser, Sojabohnenpulver, entfettete Sojabohnen, und dergleichen verwendet werden. Als organische oder anorganische Salze seien Phosphate, Sulfate, und dergleichen von Kalium, Magnesium, Eisen, und dergleichen erwähnt Gewünschtenfalls kann anderes Marcerial, das für das Wachstumbrauchbar ist wie Vitamine und wachstumsbegünstigende Mittel, dem Züchtungsmedium zugesetzt werden. Vorzugsweise ist der pH des Züchtungsmediums 4 bis 7.

Eine bevorzugte Zusammensetzung des Mediums ist beispielsweise 2% lösliche Stärke, 03% Hefeextrakt 1% Polypepton, 03% KH₂PO₄ und 0,1% MgSO₄ · 7 H₂O.

Im allgemeinen wird die Züchtung bei 20 bis 35° C für 2 bis iO Tage unter aeroben Bedingungen durchgeführt Die besonderen Bedingungen sollten natürlich je nach dem besonderen Stamm und Kulturmedium ausgewählt werden, um eine maximale Erzeugung von Cholesterinoxidase zu erzielen.

Durch die Züchtung wird die Cholesterinoxidase gemäß der Erfindung in der Kulturbrühe erzeugt und angesammelt. Nach der Züchtung wird die Kulturbrühe filtriert zentrifugiert oder dergleichen, um das Mycel abzutrennen und ein Filtrat zu erhalten, welches Cholesterinoxidase enthält Um Cholesterinoxidase aus dem Filtrat zu gewinnen und es zu reinigen, kann man die auf diesem Fachgebiet bekannten Arbeitsweisen zur Isolation und Reinigung eines Enzyms anwenden, wie fraktionierte Fällung, Dialyse, Adsorptionselution, Chromatographie, and dergleichen oder eine Kombination von zwei oder mehr dieser Arbeitsweisen.

So kann beispielsweise ein Nicht-Lösungsmittel wie Alkohol, Aceton oder dergleichen in einer Menge von 50 bis 80% vol/Vol. zum Filtrat zugefügt werden, um die Ausfällung des Enzyms zu bewirken. Alternativ oder zusätzlich dazu kann man ein Aussalzen bewirken, indem man ein wasserlösliches anorgnaisches Salz, wie Ammoniumsulfat, Calciumchlorid, und dergleichen dem Filtrat bis zu einer Konzentration von 20 bis 80% GewVVol. zusetzt, um die Ausfällung des Enzyms zu bewirken. Die Ausfällung wird dann der Dialyse, einer Behandlung mit Sephadex (z. B. Sephadex G-25-Säule) Sephadex ist die Bezeichnung eines Ionenaustauschers auf Dextranbasis, siehe Römpps Chemie-Lexikon, 7. Auflage. Seite 3180) und/oder Ultrafiltration unterworfen, um eine rohe Enzymlösung zu erhalten. Die rohe Lösung wird an einer Säule von DEAE-Sephadex A-50. die vorher mit 0,01 m Phosphatpuffer bei pH 7,0 ins Gleichgewicht gebracht wurde, adsorbiert. Dann wird die Elution mit 0,1 bis 0,2 m Phosphatpuffer bei pH 7,0 durchgeführt. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und über Nacht gegen 0,01 m Acetatpuffer bei pH 4,0 dialysiert. Die Enzymlösung wird dann wieder an einer Säule von SP-Sephadex C-50, die vorher mit 0,01 m Acetatpuffer bei pH 4,0 ins Gleichgewicht gesetztwird, absorbiert und die Elution mit 0,01 m Acetatpuffer bei pH 5,0 durchgeführt

Die aktiven Fraktionen werden gesammelt, gegen 0,01 m Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert und die dialysierte Enzymlösung mit einer Kollodiummembran konzentriert und lyophilisidivt, um gereinigtes Enzym in Form von Pulver zu erhalten.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des so gemäß der Erfindung erhaltenen Enzyms (Cholesterinoxidase) werden nachfolgend unter teilweiser Bezugnähme auf die Zeichnungen erläutert Darin bedeutet:

F i g. 1 die Kurve, welche den optimalen pH-Wert des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt;

F i g. 2 die Kurve, welche die optimale Temperatur des erfmdungsgemäßen Enzyms zeigt;
ίο Fig.3 die Kurve, die die pH-Stabilität des erfmdungsgemäßen Enzyms zeigt; und

F i g. 4 die Kurve, welche die Thermostabilität des erfmdungsgemäßen Enzyms zeigt

In Fig. i und Fig.3 werden zur Aufrechterhaltung der pH-Werte von 2,0 bis 3,0, von 4,0 bis 5,0, von 6,0 bis 8,0 und von 9,0 bis 10,0, Glycin-HCI-Puffer, Acetatpuffer, Kaliumphosphatpuffer bzw. Boratpuffer verwendet.

F i g. 5b ist ein Muster, welches die Reaktionsprodukte zeigt wenn das vorliegende Enzym auf Cholesterin einwirkt und zwar durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographia.

ι ig. .sä lot Ciil tviliStCr, WCi

ben zeigt

1. Wirkungen und Spezifität des Substrates

Zum Unterschied von herkömmlichen Cholesterinoxidasen, wie sie von Nocardia, Brevibacterium, Streptomyces und Schizophyllum erzeugt werden, oxidiert Cholesterinoxidase gemäß vorliegender Erfindung ^-S^-Hydroxysteroide unter Bildung von ^-3-Oxosteroiden unter gleichzeitiger Bildung von Wasserstoffperoxid. Wenn zum Beispiel das Enzym der vorliegenden Erfindung direkt auf Cholesterin einwirkt, wird Cholest-5-en-3-on unter gleichzeitiger Bildung von Wasserstoffperoxid erzeugt. F i g. 5b ist ein Muster, welches die Reaktionsprodukte zeigt wenn dieses Enzym auf Cholesterin einwirkt und die mit Chloroform extrahierter. Produkte durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie entwickelt werden. F i g. 5a ist ein Muster, weiches die authentischen Proben zeigt. Demgemäß ist ersichtlich, daß das Reaktionsprodukt, wenn Enzym gemäß vorliegender Erfindung auf Cholesterin einwirkt Cholest-5-en-3-on und nicht Cholest-4-en-3-on ist. Es ist bekannt, daß die herkömmliche Cholesterinoxidase sowohl die Oxidations- als auch die Isomerisierungsreaktion katalysiert. Im Gegensatz dazu katalysiert die Cholesterinoxidase der vorliegenden Erfindung nur die Abfolge der Oxidation und überführt Cholesterin in Cholest-5-en-3-on, wie der Vergleich mit dem chemisch synthetisierten Material mittels IR, UV, Schmelzpunkt, optischer Drehung und Dünnschichtchromatographie zeigt. Bisher wurde eine Cholesterinoxidase, weiche nur den Ablauf der Oxidation katalysiert, nicht berichtet.

Die Cholesterinoxidase gemäß vorliegender Erfindung wirkt nur auf die Hydroxylgruppe in der 3/?-3tellung des Cholesterins ein. Ein durchgeführter Versuch, beispielsweise durch Zersetzung von Wasserstoffperoxid, das bei der Dehydrierung der 3/?-Stellung mit der Peroxidase freigesetzt war, was den so erzeugten Sauerstoff in Kontakt mit einem Chromogen unter Ausbildung einer Färbung bringt, und Messung der Absorptionsspektren derselben im sichtbaren Bereich des Spektrums, zeigte, daß dieses Enzym nicht nur auf Cholesterin, sondern auch auf die verschiedensten Steroide und Sterine einwirkt, die eine Hydroxylgruppe in der 3/?-SteIlung haben, beispielsweise /i-Cholestan, Campesterin, /?-Cytosterin. Stigmasterin, 5it-Pregnan-3/?,20/?-diol, Deh-

ydroepiandrosteron, Pregnenolon und Ergosterin. Dieses Enzym wirkt nicht auf Sterine mit einer Hydroxylgruppe in anderen Stellungen.

2. Optimales pH und pH-Stabilität

F i g. 1 ist eine Kurve, welche den optimalen pH-Wert des vorliegenden Enzyms zeigt. Das optimale pH für das Enzym ist nahe 5 bis 7. F i g. 3 ist eine Kurve, welche die pH-Stabilität des Enzyms zeigt, das 60 Minuten bei 37⁰C bei jedem pH-Wert behandelt wurde. Das Enzym ist stabil bei pH 3 bis 8, insbesondere bei pH 5 bis 7.

3. Optimale Temperatur und Thermostabilität

F i g. 2 ist die Kurve, welche die optimale Temperatur für das Enzym zeigt. Die optimale Temperatur des Enzyms ist nahe 40 bis 45° C, insbesondere bei etwa 40° C. F i g. 4 ist die Kurve, welche die Therrnostabiütä* d<?s Enzyms zeigt, wobei die Behandlung bei pH 7,0 für 10 Minuten durchgeführt wurde. Das Enzym ist stabil bei bis zu 40 bis 50° C.

4. Bestimmung der enzymatischen Aktivität

Die enzymatische Aktivität wird bestimmt durch Messung des Wasserstoffperoxids, das durch die Einwirkung der Enzymlösung auf das Cholesterinsubstrat gebildet wird. Die Methode beruht auf der Abfolge von Reaktionen wie folgt: Das Cholesterin wird durch Cholesterinoxidase zu Cholest-5-en-3-on oxidiert unter Entwicklung von Wasserstoffperoxid, das mit 4-Aminoantipyrin und Phenol in Gegenwart von Peroxidase kuppelt, und einen Chinoniminfarbstoff mit maximaler Absorption bei 500 nm ergibt. Um diese Reaktion durchzuführen, wird ein Reaktionsgesmisch verwendet, das im Endvolumen von 3,0 ml aus 0,1 mi der Enzymlösung, 2 μΜοΙ Cholesterin in 0,1 ml Äthanol, 250 μΜοΙ Phosphatpuffer, pH 7,0, 2,46 μΜοΙ 4-Aminoantipyrin, 42 μΜοΙ Phenol und 24 Einheiten Peroxidase, erhalten aus Meerrettich, besteht. Die Reaktion wrid bei 37° C 10 Minuten lang unter Schütteln durchgeführt. Eine Einheit Cholesterinoxidaseaktivität wurde durch die Menge des Enzyms definiert, welche die Oxidation von 1 μΜοΙ Cholesterin pro Minute bei 37° C katalysiert.

Beispiel

Die Inkubation wurde durchgeführt, indem 100 ml eines Saatkulturmediums, das 2% Glucose, 03% Hefeextrakt, 0,3% Polypepton, 0,1% KH₂PO₄ und 0,05% MgSO₄ ■ 7 H₂O enthielt, jeweils in 500-ml-Erlenmeyer-Kolben eingebracht wurden. Die Kolben wurden mit Baumwolle verschlossen und 20 Minuten bei 120°C sterilisiert. Nach Abkühlen wurden sie in herkömmlicher Weise mit dem Stamm von Lentinus edodes FERM-P 5783, jetzt FERM BP-661, geimpft, der getrennt in einem Schrägkulturmedium gezüchtet war, das 3% Glucose, 0,5% Ebios und 1,5% Agar enthält. Nach 7 Tagen Schüttelinkubation bei 27° C wurde der Inhalt der KoI-ben für die nachfolgende Inkubation benutzt. 15 1 eines flüssigen Kulturmediums, enthaltend 2% lösliche Stärke, 0,3% Hefeextrakt, 1% Polypepton, 03% KH₂PO₄ und 0,1% MgSO₄ · 7 H₂O und 0,5% Sojabohnenöl in 30-1-F.delstahI-FermentationsbehäItern. wurden bei 120⁰C für 20 Minuten lang sterilisiert und abgekühlt. Dann wurde das Kulturmedium in diesen Fermentationsbehältern mit dem oben erhaltenen Inhalt der Kolben beimpft. Das Medium wurde einer aeroben Inkubation unter Rühren (200 Upm) für 4 Tage bei 27⁰C und einer Belüftungsrate von 0,6 I/l/min unterworfen.

Die so erhaltene Kulturbrühe wurde dann unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Dieses Kulturfiltrat zeigte ein-·; Cholesterinoxidaseaktivität von 13 Einheiten pro Milliliter. Zu dem Filtrat (131) wurde Ammoniumsulfat bei 5° C bis zu 80%iger Sättigung zugefügt. Der gebildete Niederschlag wurde einer Dialyse gegen 0,01 m Phosphatpuffer bei pH 7,0 unterworfen und weiterhin die dialysierte Enzymlösung auf eine DEAE-Sephadex A-50-Säule aufgebracht, die vorher mit 0,01 m Phosphatpuffer bei pH 7,0 ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Elution wurde mit 0,2 m Phosphatpuffer bei pH 7,0 durchgeführt und die aktiven Fraktionen gesammelt, über Nacht gegen 0,001 m Phosphatpufter bei pH 7,0 dialysiert und gefriergetrocknet. Das so erhaltene gefriergetrocknete Präparat (1,5 g) zeigte eine spezifische Aktivität von Cholesterinoxidase von 6,0 Einheiten pro Milligramm.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

5. Effekt von Inhibitoren und dergleichen

Die Aktivität des vorliegenden Enzyms wird ausgeprägt durch Cu²⁺ i3d Hg²⁺ inhibiert Die durch diese Metallionen bewirkte Inhibierung wird fast vollständig verhindert durch Zugabe von Glutathion. Ca²⁺, Ba²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺ und Fe²⁺ inhibieren die Enzymaktivität nicht Die Zugabe von Detergentien, beispielsweise 0,01 % Triton X-100, inhibiert die Enzymaktivität fast vollständig. Verschiedene metallchelatbildende Mittel, wie EDTA, o-PhenanthroIin, ar/t'-Dipyridyl und /7-Hydroxychinolin inhibieren nicht

6. Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des vorliegenden Enzyms wird bestimmt durch Gelfiltration auf Sephadex G-150. Das Molekulargewicht des Enzyms wurde zu etwa 58 000 bis 62 000 bestimmt

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung einer Cholesterinoxidase durch Züchten eines Mikroorganismus und Gewinnen der gebildeten Cholesterinoxidase aus dem Kulturfiltrat, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Bildung einer Cholesterinoxidase, die Cholesterin in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von Chloest-5-en-3-on und Wasserstoffperoxid oxidiert, den Stamm Gloeocystidium chrysocreas FERM-BP 661 züchtet.

2. Cholesterinoxidase, erhältlich mit den Maßnahmen des Anspruchs 1.