DE3151616A1

DE3151616A1 - Verfahren zur herstellung einer cholesterinoxidase

Info

Publication number: DE3151616A1
Application number: DE19813151616
Authority: DE
Inventors: Susumu Ootsu Matsui; Kazuo Nakajima; Tsutomu Kyoto Taniguchi
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1980-12-26
Filing date: 1981-12-28
Publication date: 1982-09-02
Also published as: DE3151616C2; JPS57122792A; GB2090259B; GB2090259A; FR2497228B1; US4425435A; FR2497228A1; JPS6048159B2

Description

B e s chr e ibunp;

Die Erfindung betrifft neue ChoTesterinoxidase und Verfahren zur Herstellung derselben. Insbesondere betrifft die Erfindung neue Gholesterinoxidase, die eine hohe Aktivität gegenüber A^-Jß-Hydroxysteroiden hat, insbesondere" hohe Aktivität zur Oxidation von Cholesterin unter Bildung von Cholest—5-en-3-on und Wasserstoffperoxid, und sie betrifft auch ein Verfahren zur Erzeugung einer solchen neuen Cholesterinoxidase durch Züchtung eines Stammes, der zur Klasse Basidiomycetes gehört.

In den letzten Jahren wurde mit dem Fortschritt der Untersuchungen über die physiologische Signifikanz von Cholesterin in vivo eine Zunahme oder Abnahme der Menge an Serum-Cholesterin allmählich als medizinisch wichtig betrachtet. Zum Beispiel wurde gefunden, daß eine extreme Zunahme von Serum—Cholesterin bei den Krankheiten ArterioSklerose und Gehirnblutungen festzustellen ist. Als Ergebnis wurde eine Zunahme von Serum—Cholesterin, wie sie durch dessen Bestimmung nachgewiesen wird, zur Diagnose von Zuständen derartiger Krankheiten, wie Arteriosklerose und Gehirnblutung, angewandt.

Diese Bestimmung von Serum—Cholesterin wurde im allgemeinen durch eine chemische colorimetrische Methode durchgeführt. Jedoch erfordert dia chemische colorimetrische Methode eine große Menge an Blut, komplizierte analytische Verfahren und eine lange Zeit zur nc . i

Durchführung. Diese Methode ist daher unerwünscht und unpraktisch.

a ·

Kürzlich, wurde für das klinische Laboratorium die Anwendung der sogenannten enzymatischen Methode zur quantitativen Bestimmung von Serum-Cholesterin entwickelt, gemäß welcher eine gewisse Cholesterinoxidase (ein Enzym), die zur Oxidation von Cholesterin in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von Cholest-4-en-3-on und Wasserstoffperoxid befähigt ist, das dann colorinietrisen für die quantitative Analyse bestimmt wird, angewandt wird. So kann durch die quantitative Analyse des so gebildeten Wasserstoffperoxids die Menge oder Konzentration an Serum-Cholesterin bestimmt werden.

Im allgemeinen ist die Cholesterinoxidase, die für die obige enzymatische Reaktion bekannt ist, ein Enzym, das Cholesterin in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von Cholest-4-en-3-on und Wasserstoffperoxid oxidiert. Somit ist das Merkmal der herkömmlichen Cholesterinoxidase daß eines der durch die Umsetzung mit Cholesterin gebildeten Produkte immer Cholest-4-en-3-on ist.

Die Mikroorganismen, von denen bekannt ist, daß sie zur Erzielung solcher Cholesterinoxidase befähigt sind, sind Nocardia spp. (Clin. Chem. vol. 19 ₅ 1350-1356 (1973))? Brevibacterium sterolicum (Agric. Biol. Chem. vol. 37, 2345-2350 (1973)), Streptomyces spp.

: (Chem. Pharm. Bull. vol. 21, 2057-2060 (1973)) und Schizophillum commune (US-PS 4 003 794 (1977))· Es ist wohlbekannt, daß bei Umsetzung dieser bekannten Cholesterinoxidasen mit Δ -3ß-Hydroxysteroiden immer Δ -3-QXOSteroide gebildet werden.

Die vorliegende Erfindung liefert eine neue Cholesterinoxidase, die wertvoll für die oben erwähnte enzymatische Methode zur Bestimmung von Serum-Gholesterin

β α ·

ist. Die neue Cholesterinoxidase gemäß der Erfindung unterscheidet sich enzymatisch von der "bekannten Cholesterinoxidase, da die Ums et zungs produkte der Reaktion mit A^-Jß-Hydroxysteroiden A^-3-OxOsteroide statt Δ. -3-Oxosteroide sind. Zum Beispiel sind die Umsetzungsprodukte der neuen Cholesterinoxidase mit Cholesterin nicht Cholest-4-en-3-on und Wasserstoffperoxid sondern Cholest-5-en-3-on und Wasserstoffperoxid .

Gemäß dieser Erfindung wird die neue Gholesterinoxidase erzeugt durch Kultivierung eines Stamms, der zur Klasse Basidiomycetes gehört und zur Erzeugung von Cholesterinoxidase in einem Kulturmedium befähigt ist, und Gewinnung der Cholesterinoxidase aus dem Kulturfiltrat.

Ein weiter Bereich von Stämmen der Klasse Basidiomycetes wurden nach solchen geprüft, die Gholesterinoxidase erzeugen. Jeder Stamm wurde üblicherweise in einem Medium (pH 5,8) kultiviert, das 2 % Glucose, 0,3 % Hefeextrakt, 1 % Polypepton, 0,3 % KH₂PO^ und 0,1 % MgSO^.7H₂O enthielt. Die Kulturbrühe wurde filtriert und das Filtrat als Enzymquelle zur Messung der Cholesterinoxidaseaktivität benutzt. Als Ergebnis davon wurde festgestellt, daß die Stämme, die zu den Genera Genus Lentinus, Oudemansiella, tflammulina, Lepiota, Copriims, Psilocybe, Gloeocystidium, Phellinus, Auricularia und Pox'ia gehören, zur Erzeugung von Cholesterinoxidase gemäß dieser Erfindung befähigt sind.

Insbesondere sind Species, die zu diesen Genera gehören, beispielsweise Lentinus edodes EEEM-P 5776, Oudemansiella radicate EEEM-P 5777, Oudemansiella mucida EERI¹I-P 5778, Elammulina velutipes EEEIi-P 5779, Lepiota procera EEEM-P 5780, Coprinus comatus

• *·

EEEM-P 5781, Psilocybe copropiiila EEHI¹I-P 5782, GIoeοcystidium chrysocreas EERM-P 5783, Phellinus gilvus IEEM-P 5784-, Auricularia polytricha EERM-P 5785 und Poria epimiltina EEEM-P 5804.

Alle diese Stämme wurden bei EEEM (Eermentation Eesearch Institute), Japan unter den obigen, angegebenen EEEM-Nummern deponiert und sind der Öffentlichkeit zugänglich und frei erhältlich.

Die Charakteristika dieser Stämme sind wie folgt:

ί §2_£^|6Sii2-^_edodes_EEEM-P_5776 Hut (Cap): halbkugelig oder nierenförmig, 6 bis 10 cm Durchmesser. Kutikula tiefbraun, mit überlappenden, gezahnten Schuppen, die in netzähnliche Eisse aufbrechen. Eleisch: eng, zäh, weiß und gibt nach dem Trocknen einen Geruch ab. Lamellen: gebuchtet, ziemlich geschlossen und weiß. Stiel: 3 bis 4 cm lang, 10 mm dick. Zäh, untere Oberfläche aus dem Eing blaß-braun, faserig. Obere weiß, glatt oder gestreift. Sporen: weiß in Masse, zylindrisch bis ellipsoid, Größe 5 bis 7 χ 3,5 Mikron.

Hut: 5 bis 9 cm Durchmesser. Zuerst glockenförmig, schließlich flach mit einem leichten mittigen Hocker.

Kutikula blaß, gräulich-braun, sehr schleimig wenn naß, radial gerunzelt. Fleisch: gräulich-weiß, dünn. Lamellen: breit, sub-distant und verwachsen. Stiel: hohl, 5 bis 12 cm lang, 4- bis 9 e™ dick. Blaß-gräulichbraun, pulverig, wird senkrecht gestreift, oft verdreht.

Spitzt sich zum oberen Ende hin zu, mit einer langen Zapfenwurzel, 5 bis 30 cm lang. Sporen: weiß in Masse, ellipsoid oder rundlich, glatt, Größe 15 bis 24- χ bis 18 Mikron. Basidie: Größe 4-5 bis 55 χ 11 bis Mikron, mit 2 oder 4 Sporen.

Hut: 3 bis 6 cm Durchmesser. Halbkugelig und am Rand dünn. Glänzend weiß und oft in der Mitte nach hautfarben schattiert. Kutikula sehr schleimig wenn naß. Pulverig und glänzend wenn trockenes Vetter herrscht. Sand gestreift. Fleisch weiß, weich., gelatinös. Lamellen: weiß, breit, sub-distant und verwachsen. Stiel: 3 bis 6 cm lang, 3 bis 7 mm dick. Zäh, knorpelig, weiß und gestreift über dem breiten Membranring-. Kurz, vom Grund nach oben spitz zulaufend. Sporen: weiß in Masse, ellipsoid oder rundlich, glatt, Größe 20 bis 23 χ 16 bis 18 Mikron. Basidie: Größe 70 bis 100 χ 20 bis 30 Mikron, mit 4- Sporen.

(d)_Plamm.ulina_Yelutip_es_>_EEEM_::P_5779 Hut: zuerst konvex, dann abgeflacht. 2 bis 8 cm Durchmesser. Kutikula sehr schleimig wenn naß. Gelb-ocker mit blaßer Färbung am Rand. Fleisch gelblich-weiß, weich, dick in der Mitte. Lamellen: weiß oder blaßgelb. Breit, mit Anhängen (Adnexe) oder gebuchtet und ziemlich geschlossen. Stiel: 3 bis 10 cm lang, 2 bis 8 mm dicke. Zäh, verjüngt sich vom Kopf nach unten, gekrümmt, oft verdreht. Dunkelbraun mit gelblich, puderigem oberen Ende, dipht samtig. Fleisch faserig, schließlich hohl. Sporen: weiß in Masse, zylindrisch bis ellipsoid, glatt, Größe 5 ^is 8x3 bis 4· Mikron. Cystidium: Größe 33 bis 66 χ 9 bis 25 Mikron, mit Cheilocystidium und Pleurοcystidium.

Hut: zuerst eiförmig, der dann abgeflacht wird mit einem leichten bis hervortretenden Buckel. Rand dünn, nach abwärts gebogen und gefranst. 10 bis 20 cm Durch messer. Kutikula zuerst gleichmäßig braun, bricht bei Ausdehnung des Hutes in grobe Schuppen auf. Fleisch weiß, weich, schwammig, nicht sehr dick. Lamellen:

weiß und zurückgezogen. Stiel: lang, dick und hohl. Verjüngt sich von einer knolligen Basis nach oben. Hellbraun, konzentrisch gebändert mit braunen Schuppen, mit einem dicken Hing'nahe dem oberen Ende. Sporen: weiß in Masse, ellipsoid, glatt, Größe 17 bis χ 11 bis 14- Mikron.

( f 2_£op.rinus_ comatus_lⁿEHM-P_5781 Hut: zuerst zylindrisch, dehnt sich dann nach unten aus und wird glockenförmig, der Rand spaltet sich, wenn sich der Hut ausdehnt. 3 bis 5 cm Durchmesser, 6 bis 10 cm hoch. Kutikula blaß-braun mit überlappenden großen zottigen wolligen Schuppen. Fleisch weiß, dünn außer in der Mitte und brüchig. Lamellen: frei, progressiv weiß, blaß-rosa, schwarz und sich selbst verzehrend unter Bildung einer schwarzen Flüssigkeit. Stiel: 15 bis 25 cm hoch, 10 bis 15 mm dich. Weiß und leicht faserig mit einem hervortretenden aber bald verschwindenden weißen Hing ziemlich weit unten. Mit knolliger Basis. Sporen: bräunlich-schwarz in Masse, ellipsoid, glatt, Größe 11 bis 14 χ 6 bis 8 Mikron.

ig)_?silocvbe_cop_ro2hila FEEM--P_5782

Hut: 2 bis 3 cm Durchmesser. Halbkugelig, dann susgedehnt. Kutikula nicht schleimig, umbra-farben bis dunkelbraun, nicht gestreift. Mit ablösbarem Häutchen, nicht gelatinös. Fleisch dünn, umbra-farben bis dunkelbraun. Lamellen: breit, zusammengedrängt und verwachsen. Bereich 2 bis 3 mm. Zuerst blaßer Farbe, dann bläulichbraun. Stiel: 5 bis 7 cm lang, 3 "bis 4 cm dick. Kutikula glatt (unbehaart), glänzend, weiß oder blaßhutfarben und hohl. Sporen: purpur-braun in Masse, ellipsoid, Größe 6 bis 7x2 bis 4 Mikron. Cheilocystidium: spindelförmig, Größe 17 bis 20 χ 5 bis 7 Mikron.

Fruchtkörper: 4 "bis 8x2 bis 3 cm im Querschnitt. Alle !«'ruchtkörper wenden sich dem Holz zu und sie haben keine Hüte. Sie "breiten sich auf Rinde aus und können nicht abgezogen werden. Die Oberfläche ist eigelb, glatt oder hat eine kleine Menge warzenartiger Hocker, zeigt Sprünge wenn trocken. Fleisch gelblichgrün, 120 bis 300' Mikron dick. Rand dünn und lederig. Das Mycel ist aufgerichtet, Bereich 2 Mikron mit vielen sackförmigen großen Zellen, Größe 15 ^>is 20 χ 6 bis 9 Mikron. Sackförmige große Zellen verändern sich durch Zugabe von KOH-Lösung zur Rosafärbung. Sporen:

weiß in Masse, ellipsoid, glatt, Größe 4- bis 5x2 bis 3 Mikron.

Kein Stiel. Hut: halbrund, einander überlappend. 5 8 cm Ausdehnung, 5 bis 10 mm dick. Kutikula gelblichbraun, dicht mit kurzen Haaren besetzt und fischhautähnlich. Untere Oberfläche gelblich-braun. Fleisch gelblich-braun, korkig. Poren: 3 "bis 5 mm lang, Ostiolenkreis, es existieren 6 bis 7 innerhalb der Grenzen von 1 mm Länge. Sporen: farblos, kugelig, glatt, Größe 4 bis 5x2 bis 3 Mikron. Cystidium: überreichlich, schwere Membran, lang keilförmig, Größe 25 bis 30 x 3 bis 6 Mikron.

Fruchtkörper wendet sich dem Holz zu. Hut: ohrförmig oder sehr ungleichmäßig schalenförmig. 3 bis 6 cm Ausdehnung, 2 bis 3 cm hoch, etwa 10 mm dick. Obere Oberfläche braun mit dicht sprossetnden Haaren, untere Oberfläche blaß purpurfarben-braun. Bei trockenem Wet- ' ter zuerst rötlich-braun und wird später purpurfarbenbraun, pulverig und glänzend. Der Fruchtkörper schrumpft praktisch nicht. Fleisch gelatinös, lederig und etwa

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10 mm dick« Basidie: zylindrisch mit 4- Sporen, Größe 60 bis ?0 x 4 bis 5 Mikron. Sporen: farblos, ellipsoid, gekrümmt und eng an der Basis. Größe 8 bis 12 χ J bis 5 Mikron. :

Alle leuchtkörper wenden sich zum Holz zurück und es gibt keine Kappe." Flach und'sich auf dem Holz ausbreitend ist es schwierig abzuschälen. 6 bis 8 cm Ausdehnung. Holz ändert sich zu einer tiefgelblich-orangen Färbung. Gelblich-orange jedoch ganz außenliegende Färbung purpurfarben-braun. Fleisch gelblich-orange. Poren: gräulich und lang. Ostiolen klein und polygon. Porenwände dünn. Sporen: farblos, ellipsoid, glatt, Größe etwa 3,5 x 2 Mikron= Gystidium fehlt.

Die Identifizierung dieser Species wurde nach folgenden Büchern durchgeführt: "Coloured Illustrations of Fungi of Japan", Bd. I und Bd. II, herausgegeben von Rokuya Imazeki und Tsugio Hongo (publiziert von Hoiku-Sha, Osaka, Japan) 1965 und "Mycological flora of Japan", herausgegeben von Seiya Ito (publiziert von Xoken-Do, Tokyo, Japan), Bd. 2, Nr. 4, 1955,

Jeder Stamm der zu den oben genannten Genera gehört, ist zur Erzeugung von Cholesterinoxidase gemäß dieser Erfindung in einem Medium, das Cholesterin enthält oder nicht enthält, befähigt und kann daher bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Bei der Erzeugung der Cholesterinoxidase gemäß dieser Erfindung wird ein Stamm, der zur Klasse Basidiomycetes gehört und zur Erzeugung von Cholesterinoxidase befähigt ist, aerob in einem Nährmedium in für die Züchtung von

Fungi der Klasse Basidiomycetes bekannter Art und Weise gezüchtet. Die Züchtung kann auf festen Kulturen oder in flüssigen Kulturen erfolgen, jedoch wird letzteres für die großtechnische Erzeugung "bevorzugt.

Als Medium für die Züchtung können natürliche oder synthetische Medien verwendet werden, die verschiedene an sich bekannte Nährmittel enthalten, wie beispielsweise eine Kohlenstoff quelle, St ickstaJTf quelle, organische oder anorganische Salze, und dergleichen. Die Kohlenstoff quelle kann z. B. Glucose, !fructose, Glyzerin, Melasse, Melasseabfall oder verschiedene Stärken sein, beispielsweise lösliche Stärke, Maisstärke, Kartoffelstärke, und dergleichen. Als Stickstoffquelle kann beispielsweise Harnstoff, Hefeextrakt, Maltoseextrakt, Pepton, Maisquellwasser (CSL), Sojabohnenpulver, entfettete Sojabohnen, und dergleichen verwendet werden. Als organische oder anorganische Salze seien Phosphate, Sulfate, und dergleichen von Kalium, Magnesium, Eisen, und dergleichen erwähnt. Gewünschtenfalls kann anderes Material, das für das Wachstum brauchbar ist, wie Vitamine und wachstumsbegünstigende Mittel, dem Züchtungsmedium zugesetzt werden. Vorzugsweise ist der pH des Züchtungsmediums 4- bis 7·

Eine bevorzugte Zusammensetzung des Mediums ist beispielsweise 2 % lösliche Stärke, 0,3 % Hefeextrakt, 1 % Polypepton, 0,3 % KH^PO^ und 0,1 % MgSO^.7H₂O.

Im allgemeinen wird die Züchtung bei 20 bis 35 ⁰C für 2 bis 1Ö Tage unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Die besonderen Bedingungen sollten natürlich je nach dem besonderen Stamm und Kulturmedium ausgewählt werden, um eine maximale Erzeugung von Cholesterinoxidase zu erzielen.

Durch die Züchtung wird die Cholesterinoxidase gemäß der Erfindung in der Kulturbrühe erzeugt und angesammelt. Nach der Züchtung wird die Kulturbrühe filtriert, zentrifugiert oder dergleichen, um das Mycel abzutrennen und ein Filtrat zu erhalten, welches Cholesterinoxidase enthält * Um Cholesterinoxidase aus dem Filtrat zu gewinnen und es zu reinigen, kann man die auf diesem Fachgebiet bekannten Arbeitsweisen zur Isolation und Reinigung eines Enzyms anwenden, wie fraktionierte Fällung, Dialyse, Adsorptionselution, Chromatographie, und dergleichen oder eine Kombination von zwei oder mehr dieser Arbeitsweisen.

So kann beispielsweise ein Nicht-Lösungsmittel wie Alkohol, Aceton oder dergleichen in einer Menge von 50 bis 80 % Vol./Vol. zum FiItrat zugefügt werden, um die Ausfällung des Enzyms zu bewirken. Alternativ oder zusätzlich dazu kann man ein Aussalzen bewirken, indem man ein wasserlösliches anorganisches Salz, wie Ammoniumsulfat, Calciumchlorid, und dergleichen dem Filtrat bis zu einer Konzentration von 20 bis 80 % Gew./Vol. zusetzt, um die Ausfällung des Enzyms zu bewirken. Die Ausfällung wird dann der Dialyse, einer Behandlung mit Sephadex (z. B. Sephadex G-25-Säule) (Sephadex ist die Bezeichnung eines Ionenaustauschers auf Dextranbasis, siehe Römpps Chemie-Lexikon, 7.AUfIHgB₇ Seite 3180) und/oder Ultrafiltration unterworfen, um eine rohe Enzym-

^⁰ lösung zu erhalten. Die rohe Lösung wird an einer. Säule von DEAE-Sephadex A-50, die vorher mit 0,01 m Phosphatpuffer bei pH 7/0 ins Gleichgewicht gebracht wurde, adsorbiert. (DEAE = siehe Römpps Chemie-Lexikon,8.Aufl.,S.874). Dann wird die Elution mit 0,1 bis 0,2 m Phosphatpuffer bei pH 7>P durchgeführt. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und über Nacht gegen 0,01 m Acetatpuffer bei pH 4-,O dialysiert. Die Enzymlösung wird dann wieder an einer Säule von SP-Sephadex C-^O, die vorher mit

0,01 m Acetatpuffer bei pH 4,0 ins G-leichgewicht gesetzt wird, absorbiert und die Elution mit 0,01 m ■ Acetatpuffer bei pH 5,0 durchgeführt. (SP — Sephadex, siehe Römpps Chemie-Lexikon, 7. Aufl., S. 3180). Die aktiven Fraktionen werden' gesammelt, gegen 0,01 m Phosphatpuffer (pH 7₅O) dialysiert und die dialysierte Enzymlösung mit einem Kollodiummembran konzentriert und lyophilisiert·, um gereinigtes Enzym in Form von Pulver zu erhalten. ■ -

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des so gemäß der Erfindung erhaltenen Enzyms (Gholesterinoxidase) werden nachfolgend unter teilweiser Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert. Darin "bedeuten:

Fig. 1a bis 1k Eurven, welche den optimalen pH-Wert der vorliegenden Enzyme zeigen;

Fig. 2a bis i'ig. 2k sind Eurven, welche die optimale Temperatur der vorliegenden Enzyme zeigen;

Fig. 3a bis Fig. 3k sind Eurven, die die pH-Stabilität

der vorliegenden Enzyme zeigen; und

Fig. 4a bis Fig. 4k sind Eurven, welche die Thermo-

stabilität der vorliegenden Enzyme zeigen. ^;

In Fig. 1 und Fig. 3 werden zur Aufrechterhaltung der pH-Werte von 2,0 bis 3₅O, von 4,0 bis 5₅O, von 6,0 bis 8,0 und von 9,0 bis 10,0, Glycin-HCl-Puffer, Acetatpuffer, Ealiumphosphatpuffer bzw. Boratpuffer

^ verwendet. · . ^!

Fig. 5ΐ> ist ein Must er,welches die Heaktionsprodukte zeigt, wenn.das vorliegende Enzym auf Cholesterin

.:I.^:..^:" .i."3154646

einwirkt, und zwar durch Hochdruck-Flüssigkeitschroma- \ tographie. ■:

Pig. 5a ist ein Muster,welches die authentischen Proben zeigt. ■:_

In diesen Kurven werden Gholesterinoxidasen, die durch Lentinus edodes FEEM-P 5776, Oudemansiella radicate EEEM-P 5777, Oudemansiella mucida I¹EEM-P 5778, Flammulina velutipes EEEM-P 5779, Lepiota procera EEEM-P 5780, Coprinus comatus EEEM-P 5781, Psilocybe coprophila ÜEEM-P 5782, Cloeocystidium chrysocreas ZEEM-P 5783» Phellinus gilvus FEEM-P 5784-, Auricularia polytricha EEEM-P 5785 und Poria epimiltina EEEH-P 5804-

erzeugt waren, durch die Buchstaben a, b, c, d, e, f, . g, h, i, j und k identifiziert, die jeweils hinter die Figurennummern gesetzt sind.

1. Wirkungen und Spezifität des Substrates *

Zum Unterschied von herkömmlichen Cholesterinoxidasen, wie sie von Noeardia, Brevibacterium, Streptomyces und Schizophyllum erzeugt werden, oxidiert Choleste- ^s rinoxidase gemäß vorliegender Erfindung Δ -3ß-Hydroxysteroide unter Bildung von Δ -3-Oxosteroiden unter gleichzeitiger Bildung von Wasserstoffperoxid. Wenn zum Beispiel das Enzym der vorliegenden Erfindung direkt auf Cholesterin einwirkt, wird Cholest-5-en-3-on unter gleichzeitiger Bildung von Wasserstoffperoxid erzeugt. Fig. 5b ist ein Muster, welches die Reaktionsprodukte zeigt, wenn dieses Enzym auf Cholesterin einwirkt und die mit Chloroform extrahierten Produkte durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie entwickelt werden. Fig. 5a ist ein Muster, welches die authentischen Proben zeigt. Demgemäß ist ersichtlich, daß das Eeaktionsprodukt, wenn Enzym gemäß vorliegender Erfindung auf Cholesterin einwirkt, Gholest-5-en-3>-on und

nicht Cholest—4— en-3-on ist. Es ist bekannt, daß die herkömmliche Cholesterinoxidase sowohl die Oxidations- _: als auch die Isomerisierungsreaktion katalysiert. Im Gegensatz dazu katalysiert Gholesterinoxidase der vorliegenden Erfindung nur die Abfolge der Oxidation und überführt Cholesterin in Cholest-5-en-3-on, wie der Vergleich mit dem chemisch synthetisierten Material mittels IS, UV, Schmelzpunkt, optischer Drehung und DünnschichtChromatographie zeigt. Bisher wurde eine Gholesterinoxidase, welche nur den Ablauf der Oxidation katalysiert, nicht berichtet. Die Cholesteriaoxidase gemäß vorliegender Erfindung wirkt nur auf die Hydroxylgruppe in der 3ß-Stellung des Cholesterins ein. Ein durchgeführter Versuch, beispielsweise durch Zersetzung von Wasserstoffperoxid, das bei der Dehydrierung der 3ß-Stellung mit der Peroxidase freigesetzt ^: war, was den so erzeugten Sauerstoff in Kontakt mit einem Chromogen unter Ausbildung einer Färbung bringt, und Messung der Absorptionsspektren derselben im sichtbaren Bereich des Spektrums, zeigte, daß dieses Enzym nicht nur auf Cholesterin sondern auch auf die verschiedensten Steroide und Sterine einwirkt, die eine Hydroxylgruppe in der 3ß-Stellung haben, beispielsweise ß-Cholestan, Campesterin, ß-Cytosterin, Stigmasterin, 5°c-Pregnan-3ß,20ß-dIol, Dehydroepiandrosteron, ^; Pregnenolon und Ergosterin. Dieses Enzym wirkt nicht auf Sterine mit einer Hydroxylgruppe in anderen Stel-

lungen. ■ .· " ;·.·

2. Optimales pH und pH-Stabilität

S'ig. 1a bis i'ig. 1k sind Kurven, welche den optimalen pH-Wert der vorliegenden Enzyme zeigen. Das optimale pH jedes der vorliegenden Enzyme ist nahe 5 bis 7. Pig. 3a bis Pig. 3k sind Kurven, welche die pH-Stabilität der vorliegenden Enzyme zeigen, die jeweils

60 Minuten bei.37 °^G "bei jedem pH-Werf behandelt wurden. Die vorliegenden Enzyme sind stabil bei pH 3 bis 8, insbesondere bei pH 5 bis 7·

3". Optimale- Temperatur und Thermostabilität

üig. 2a bis iig. 2k sind Kurven, welche die optimale Temperatur für die vorliegenden Enzyme zeigen. Die optimale Temperatur der vorliegenden Enzyme ist nahe A-O bis 45 ⁰G, insbesondere bei etwa 40 ⁰C. i'ig. 4a bis Pig. 41ζ sind Kurven, welche die Thermostabilität der vorliegenden Enzyme zeigen, wobei die Behandlung bei pH 7?0 für 10 Minuten durchgeführt wurde. Die vorliegenden Enzyme sind stabil bei bis zu 40 bis' 50 ⁰C

4. Bestimmung der enzymatischen Aktivität

Die enzymatisch^ Aktivität wird bestimmt durch Messung des Wasserstoffperoxids, das durch die Einwirkung der Enzymlösung auf das Oholesterinsubstrat gebildet wird. Die Methode beruht auf der Abfolge von Reaktionen wie folgt: Das Cholesterin wird durch Cholesterinoxidase zu Cholest-5-en-3-on oxidiert unter Entwicklung von Wasserstoffperoxid, das mit 4-Aminoantipyrin und Phenol in Gegenwart von Peroxidase kuppelt, und einen Chinoniminfarbstoff mit maximaler Absorption bei 500 nm ergibt. Um diese Reaktion durchzuführen, wird ein Reaktionsgemisch verwendet, das im Endvolumen von.

3,0 ml aus 0,1 ml der Enzymlösung, 2 uMol Cholesterin in 0,1 ml Äthanol, 250/uMol Phosphatpuffer, pH 7,0, 2,46 nMol 4-Aminoantipyrin, 42UT¹IoI Phenol und 24 Einheiten Peroxidase, erhalten aus Meerrettich, besteht.

Die Reaktion wird bei 37 °C 10 Minuten lang unter Schütteln durchgeführt. Eine Einheit Cholesterinoxidaseaktivität wurde durch die Menge des Enzyms definiert, welche die Oxidation von 1 uMol Cholesterin pro Minute bei 37 ⁰C katalysiert.

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durch Gu :und Hg ⁺ inhibiert. Die durch diese Metallionen bewirkte Inhibierung wird fast vollständig verhindert durch Zugabe von Glutathion. Ca ⁺, Ba ⁺, Co²⁺, Mi²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺ und Fe²⁺ inhibieren die Enzymaktivität nicht. Die Zugabe von Detergentien, beispielsweise 0,01 % Triton X-100, inhibiert die Enzymaktivität fast vollständig. Verschiedene metallchelatbildende Mittel, wie EDTA, o-Phenanthrolin, α, oc'-Dipyridyl und ß-Hydroxychinolin inhibieren nicht.

6. Molekulargewicht

Das Molekulargewicht der vorliegenden Enzyme wird bestimmt durch Gelfiltration auf Sephadex G-15O. Das Molekulargewicht der vorliegenden Enzyme wurde zu, · etwa 58000 bis 62000 bestimmt, jedoch beträgt das Molekulargewicht von Gholesterinoxidase, das. durch Phellinus gilvus FEHM-P 5784 erzeugt ist, etwa 85000.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1

Die Inkubation wurde durchgeführt, indem 100-ml eines Saatkulturmediums, das 2 % Glucose=, 0,3 % Hefeextrakt, 0,3 % Polyp ept on, 0,1 % KH₂PQ₄ und 0,05 % MgSO^. 7H₂O enthielt, jeweils in 500-ml-Erlenmeyer-Kolben eingebracht wurden. Die Kolben wurden mit Baumwolle verschlossen und 20 Minuten bei 120 ⁰G sterilisiert. Mach Ab-³^ kühlen wurden sie in herkömmlicher Weise mit dem Stamm von Lentinus edodes ZEÜM-P 5776 geimpft, der getrennt in einem Schrägkulturmedium gezüchtet war, das 3 % Glucose, 0,5 % Ebios und 1,5 % Agar enthält. Nach.

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7 Tagen Schüttelinkubation bei 27 °G wurde der Inhalt der Kolben für die nachfolgende Inkubation benutzt. 15 1 eines flüssigen Kulturmediums, enthaltend 2 % Glucose, 0_v3 % Hefeextrakt', 1 % Polypepton, 0,3 % KH₂PO^, 0,1 % MgSO^.7H₂O und 0,5 % Sojabohnenöl in JO-l-Edelsijahl-Fermentationsbehältern, wurden bei 120 °C für 20 Minuten lang sterilisiert und abgekühlt. Dann wurde das Kulturmedium in diesen Fermentationsbehältern mit dem oben erhaltenen Inhalt der Kolben beimpft. Das Medium wurde einer aeroben Inkubation unter tifah.-ren (200 TJpm) für 6 Tage bei 27 ⁰C und einer Belüftungsrate von 0,6 l/l/min unterworfen.

Die so erhaltene Kulturbrühe wurde dann unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Dieses Kulturfiltrat zeigte eine ChoIesterinoxidaseaktivität von 0,05 Einheiten pro Milliliter. Zu dem Filtrat (13 l) wurde Ατητηοniumsulfat bei 5 °G his zu 80 %iger Sättigung zugefügt. Der gebildete Niederschlag wurde einer Dialyse gegen 0,01 m.Phosphatpuffer bei pH 7»0 unterworfen und weiterhin die dialysierte Enzymlösung auf eine DEAE-Sephadex A-50-Säule aufgebracht, die vorher mit 0,01 m Phosphatpuffer bei pH 7*0 ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Elution wurde mit 0,2 m Phosphatpuffer bei pH 7jO durchgeführt und die aktiven Fraktionen gesammelt, über Nacht gegen 0,001 m Phosphatpuffer bei pH 7»0 dialysiert und gefriergetrocknet. Das so erhaltene gefriergetrocknete Präparat (1,5 g) zeigte eine spezifische Aktivität von Cholesterinoxidase von 0,15 Einheiten pro Milligramm.

Beispiel 2
35

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 -wurde Oudemansiella radicata FERM-P 5777 gezüchtet, um ein Kulturfiltrat zu erhalten, das eine Cholesterinoxidaseaktivität von 1,10 Einheiten pro Milliliter aufwies. Das

Kulturfiltrat wurde dann' wie in Beispiel Λ weiterverarbeitet, um ein gefriergetrocknetes Präparat zu erhalten. Das gefriergetrocknete Präparat (2,0 g) zeigte eine spezifische Aktivität von Cholesterinoxidase von 0,28 Einheiten pro Milligramm.

Beispiel 5

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde ^wiederholt mit der Ausnahme, daß Oudemansiella Mucida ΙΈΕΜ-Ρ 5778 im Hauptmedium gezüchtet wurde, das 2 % lösliche Stärke, 0,3 % Hefeextrakt, 1 % Polypepton, 0,3 % KH₂PO^ und 0,1 % MgSO^,7H₃O und 0,5 % Sojabohnenöl enthielt, um ein Eulturfiltrat zu erzielen, das eine Cholesterinoxidaseaktivität von 0,11 Einheiten pro Milliliter zeigte. Das Kulturfiltrat wurde wie in Beispiel 1 weiterverarbeitet, um ein gefriergetrocknetes Präparat (1,0 g) zu erhalten, das eine spezifische Aktivität der Gholesterinoxidase von 0,60 Einheiten pro Milligramm zeigte. -

Beispiel 4-25

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wurde Plammulina velutipes ΪΈΚΜ-Ρ 5779 kultiviert, um ein Kulturfiltrat zu erhalten, das eine Cholesterinoxidaseaktivität von 0,10 Einheiten pro Milliliter zeigte. Dann wurde das 3?iltrat wie in Beispiel 1 weiterverarbeitet, um ein gefriergetrocknetes Präparat (1,5 g) mit einer spezifischen Aktivität an Cholesterinoxidase von 0,50 Einheiten pro Milligramm zu erhalten.

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Beispiel 5

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß Lepiota procera FERM-P 5780 7 Tage lang gezüchtet wurde, um ein Kulturfiltrat mit einer Cholesterinoxidaseaktivität von 0,05 Einheiten pro Milliliter zu erhalten. Das Filtrat wurde wie in Beispiel 1 weiterverarbeitet, was ein gefriergetrocknetes Präparat (2,5 g) mit einer spezifischen Aktivität an Cholesterinoxidase von 0,12 Einheiten pro Milligramm ergab.

Beispiel 6

Die Arbeitsweise von Beispiel 3 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß Coprinus comatus BSHM-P 5781 5 Tage lang gezüchtet wurde, um ein Kulturfiltrat mit einer Cholesterinoxidaseaktivität von 0,10 Einheiten pro Milliliter zu erhalten. Das Ji'iltrat wurde wie in Beispiel 1 weiterverarbeitet, um ein gefriergetrocknetes Präparat (1,0 g) mit einer spezifischen Aktivität an Cholesterinoxidase von 0,40 Einheiten pro Milligramm zu erhalten.

Beispiel 7

Die Arbeitsweise von Beispiel 5 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß Psilocybe coprophila 1<ERM-P 5782 5 Tage gezüchtet wurde, was ein Kulturfiltrat mit einer Cholesterinoxidaseaktivität von 0,10 Einheiten pro Milliliter ergab. Das Filtrat wurde dann wie in Beispiel 1 weiterverarbeitet, um ein gefriergetrocknetes Präparat (1,5 g) mit einer spezifischen Aktivität an Cholesterinoxidase von 0,50 Einheiten pro Milligramm zu erhalten.

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Beispiel 8

Die Arbeitsweise von Beispiel 3 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß G-Io eo cyst idium chrysocreas ZESM-P 578J 4- Tage gezüchtet wurde, was ein Kulturfiltrat mit einer Cholesterinoxidaseaktivität von 1,3 Einheiten pro Milliliter ergab. Das Ziltrat wurde wie in Beispiel 1 weiterverarbeitet, um ein gefriergetrocknetes Präparat (1,5 g) mit einer spezifischen Aktivität an Cholesterinoxidase von 6,0 Einheiten pro Milligramm, zu erhalten.

Beispiel 9

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß Phe'llinus gilvus- ZEBM-P 5784- 4- Tage lang gezüchtet wurde, um ein Ziltrat mit einer Cholesterinoxidaseaktivität von 0,20 Einheiten pro Milliliter zu erhalten. Das Ziltrat wurde wie in Beispiel 1 weiterverarbeitet, um ein Bsiriergotrocknetes Präparat (2,0 g) mit einer spezifischen Aktivität an Cholesterinoxidase von 1,0 Einheiten pro Milligramm zu erhalten.

Beispiel 10

Die Arbeitsweise von Beispiel 3 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß Auricularia polytricha I¹ESIi-P 5785 5 Tage gezüchtet wurde, um ein Kulturfiltrat mit:-einer Cholesterinoxidaseaktivität von 0,10 Einheiten pro Milliliter zu erhalten. Das jiltrat wurde wie in Beispiel 1 weiterverarbeitet, um ein gefriergetrocknetes Präparat (2,0 g) mit einer spezifischen Aktivität an Cholesterinoxidase von 0,52 Einheiten pro Milligramm zu erhalten.

Beispiel 11·

Die Arbeitsweise von Beispiel 3 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß Poria epimiltina ZEEM-P 5804 im Hauptmedium 6 Tage lang gezüchtet wurde, um ein KuI-turfiltrat mit einer Cholesterinoxidaseaktivität von 0,16 Einheiten pro Milliliter zu erhalten. Das PiI-trat wurde wie in' Beispiel 1 weiterverarbeitet, um ein gefriergetrocknetes Präparat (1,5 g) mit einer spezifischen Aktivität an Cholesterinoxidase von 0,4-5 Einheiten pro Milligramm zu erhalten.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Cholesterinoxidase

Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung einer Cholesterinoxidase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen zur Klasse Basidiomycetes gehörenden Stamm, der zur Erzeugung von Cholesterinoxidase befähigt ist, in einem Kulturmedium zur Anreicherung der Cholesterinoxidase züchtet und die Cholesterinoxidase aus der erhaltenen Kulturbrühe gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Stamm zur Genus Lentinus gehört.
3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Stamm zur Genus Oudemansiella gehört.

»· ■
4. Verfahren nach. Anspruch. 1, dadurch'gekennzeichnet, daß der verwendete Stamm zur Genus Elammulina
gehört.
5· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Stamm, zur Genus Lepiota gehört.
6. Verfahren nach" Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Stamm zur Genus Coprinus gehört.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Stamm zur Genus Psilocybe gehört,
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Stamm zur Genus GIoeοcystidium gehört.
9· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Stamm, zur Genus Phellinus gehört.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Stamm, zur Genus Auricularia

gehört.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Stamm zur Genus Poria gehört.

³^
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Stamm einer der folgenden Gruppe von
Species verwendet wird: Lentinus edodes EEKM-P
5776, Oudemansiella radicate FEIiM-P 5777, Oudemansiella mucida EEEM-P 5778, Elammulina velutipes

IEBM-P 5779, Lepiota procera ZBEM-P 5780, Coprinus comatus EEBM-P 5781, Psilocybe coprophila EEEM-P 5782, Gloeocystidium chrysocreas EEEM-P
Phellinus gilvus EEEM-P 5784, Auricularia

polytricha ΙΈΕΜ-Ρ 5785 und Poria epimiltina PEEM-P 5804.
13. Gholesterinoxidase, hergestellt durch, einen Stamm der Klasse Basxdiomycetes, gekennzeichnet durch eine hohe Aktivität zur Oxidation von Cholesterin in.Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von 10 Cholest-5-en-3-on und Wasserstoffperoxid.