JPS61209587A - 耐熱性ビリルビン・オキシダーゼの製造法 - Google Patents
耐熱性ビリルビン・オキシダーゼの製造法Info
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- JPS61209587A JPS61209587A JP60020625A JP2062585A JPS61209587A JP S61209587 A JPS61209587 A JP S61209587A JP 60020625 A JP60020625 A JP 60020625A JP 2062585 A JP2062585 A JP 2062585A JP S61209587 A JPS61209587 A JP S61209587A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
- C12Y103/03—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with oxygen as acceptor (1.3.3)
- C12Y103/03005—Bilirubin oxidase (1.3.3.5)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、新規なビリルビン・オキシダーゼ（Ｂｉｌｉ
ｒｕｂｉｎ ０ｘｉｄａｓｅ ）およびその製法に関す
る。
ｒｕｂｉｎ ０ｘｉｄａｓｅ ）およびその製法に関す
る。
さらｔこ詳しくは、耐熱性を有する新規なビリルビン拳
オキシダーゼおよびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）属
す に属するビＮルピン・オキシダーゼ生産菌を培養し、培
養物より該ビリルビン・オキシダーゼを採取してなるピ
ＩＪ ／ｌ／ビン・オキシダーゼの製造法に関する。
オキシダーゼおよびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）属
す に属するビＮルピン・オキシダーゼ生産菌を培養し、培
養物より該ビリルビン・オキシダーゼを採取してなるピ
ＩＪ ／ｌ／ビン・オキシダーゼの製造法に関する。
従来技術
従来、ビリルビン１こ基質特異性を有し、ビリルビンお
よび酸素からビリベルジンと水を生成する反応を触媒す
る酵素としてビリ／Ｌ／ピン・オキシダーゼが知られて
おり、その生産菌としては、ミロセシウム （Ｍｙｒｏ
ｔｈｅｃｉｕｍ ） 属由来（Ｎ、 Ｔａｎａｋａ
ａｎｄＳ、 Ｍｕｒａｏ、 Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、、 Ｌｊｙ−２ＩＩデタ（／りｇ、ｌり
）、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ）属
由来（特開昭５タ一／３！ｇｉｒ６号公報）、コプリナ
ス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔ
ｅｓ ）属、レンヂテス（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ ）属、コ
リオラス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ）属、フオリオタ（Ｐｈ
ｏｌｉｏｔａ ）属、プロイタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ
）属又はフミトプシス（Ｆｏｍｉ −ｔｏｐｓｉｓ
）属由来、（特開昭５ター／りｇり７／号公報）が報告
されている。
よび酸素からビリベルジンと水を生成する反応を触媒す
る酵素としてビリ／Ｌ／ピン・オキシダーゼが知られて
おり、その生産菌としては、ミロセシウム （Ｍｙｒｏ
ｔｈｅｃｉｕｍ ） 属由来（Ｎ、 Ｔａｎａｋａ
ａｎｄＳ、 Ｍｕｒａｏ、 Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、、 Ｌｊｙ−２ＩＩデタ（／りｇ、ｌり
）、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ）属
由来（特開昭５タ一／３！ｇｉｒ６号公報）、コプリナ
ス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔ
ｅｓ ）属、レンヂテス（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ ）属、コ
リオラス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ）属、フオリオタ（Ｐｈ
ｏｌｉｏｔａ ）属、プロイタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ
）属又はフミトプシス（Ｆｏｍｉ −ｔｏｐｓｉｓ
）属由来、（特開昭５ター／りｇり７／号公報）が報告
されている。
発明が解決しようとする問題点
ビリルビン・オキシダーゼは、臨床化学の分野における
血清中のビリルビンの定量や血清中のどｌＪ７レビン以
外の被験成分を分析定量する際に測定値の誤差要因とな
るビリルビンの除去試薬として近年注目されているが、
従来のビリルビン・オキシダーゼにおいて、ミロセシウ
属由来の酵素は１５分、３７℃で安定であるが７０℃を
こおいては残存活性２０％程度であり、またスエヒロタ
ケ属由来の酵素はＩＯ分間≠５℃まで安定であるにすぎ
ず、さらにそのほかの生産菌由来の酵素、例えばコプリ
ナス属由来の酵素も７０分間、６０℃において残存活性
りＯ〜り５％を示すもので、熱安定性において十分では
なく、さらに製造時、処理等において温度管理を要求さ
れ、また酵素利用の一手段として固定化する場合におい
ても条件によっては酵素の失活をまねき、酵素の取り扱
いにおいて必ずしも満足のいくものではなかった。
血清中のビリルビンの定量や血清中のどｌＪ７レビン以
外の被験成分を分析定量する際に測定値の誤差要因とな
るビリルビンの除去試薬として近年注目されているが、
従来のビリルビン・オキシダーゼにおいて、ミロセシウ
属由来の酵素は１５分、３７℃で安定であるが７０℃を
こおいては残存活性２０％程度であり、またスエヒロタ
ケ属由来の酵素はＩＯ分間≠５℃まで安定であるにすぎ
ず、さらにそのほかの生産菌由来の酵素、例えばコプリ
ナス属由来の酵素も７０分間、６０℃において残存活性
りＯ〜り５％を示すもので、熱安定性において十分では
なく、さらに製造時、処理等において温度管理を要求さ
れ、また酵素利用の一手段として固定化する場合におい
ても条件によっては酵素の失活をまねき、酵素の取り扱
いにおいて必ずしも満足のいくものではなかった。
発明が解決しようとする手段
本発明者らは、種々研究した結果、神奈川県足柄下郡箱
根町の大桶谷の土壌より分離したバチルス属に属する醒
株Ｂ−ＯＫ９１株が、ビリルビンおよび酸素からビリベ
ルジンと水を生ずる反応を触媒するビリルビン・オキシ
ダーゼを産生じ、かつこのビリルビン−オキシダーゼが
、７０℃付近において安定である熱安定性良好な酵素で
あることを見い出した。
根町の大桶谷の土壌より分離したバチルス属に属する醒
株Ｂ−ＯＫ９１株が、ビリルビンおよび酸素からビリベ
ルジンと水を生ずる反応を触媒するビリルビン・オキシ
ダーゼを産生じ、かつこのビリルビン−オキシダーゼが
、７０℃付近において安定である熱安定性良好な酵素で
あることを見い出した。
本発明は上記知見に基づいて一完成されたもので少なく
ともビリルビンに基質特異性を有し、ビリルビンおよび
酵素からビリベルジンと水を生ずる反応を触媒するビリ
ルビン・オキシダーゼにおいて少なくとも耐熱性を有す
ることを特徴とするビリルビン・オキシダーゼおよびバ
チルス属に属するビリルビン・オキシダーゼ生産菌を培
地に培養し、培養物よりビリルビン・オキシダーゼを採
取することを特徴とするビリルビン−オキシダーゼの製
造法に関するものである。
ともビリルビンに基質特異性を有し、ビリルビンおよび
酵素からビリベルジンと水を生ずる反応を触媒するビリ
ルビン・オキシダーゼにおいて少なくとも耐熱性を有す
ることを特徴とするビリルビン・オキシダーゼおよびバ
チルス属に属するビリルビン・オキシダーゼ生産菌を培
地に培養し、培養物よりビリルビン・オキシダーゼを採
取することを特徴とするビリルビン−オキシダーゼの製
造法に関するものである。
本発明の新規なビリルビン・オキシダーゼ生産菌の分類
学的性状は以下の通りである。
学的性状は以下の通りである。
（り形態（普通寒天培地にて３０℃、２を時間培養の結
果） ■ 細胞の形、大きさ、多形性の有無 単独、または短連銀で端の丸い桿菌で、大きさは ０．
５〜０．ざ×ユＯ−≠Ｏμｍで、多形性は無い。
果） ■ 細胞の形、大きさ、多形性の有無 単独、または短連銀で端の丸い桿菌で、大きさは ０．
５〜０．ざ×ユＯ−≠Ｏμｍで、多形性は無い。
■ 運動性及び鞭毛：なし
■ 芽胞（形、大きさ、位置、菌体のふくらみ）：中央
又は中央に近い位置に楕円形又は円筒形で大きさは０．
！； Ｘ ／、 ０μｍの芽胞を形成する。
又は中央に近い位置に楕円形又は円筒形で大きさは０．
！； Ｘ ／、 ０μｍの芽胞を形成する。
芽胞をこよって菌体は膨張しない。
■ ダラム染色：陽性
■ 抗酸化性染色：陰性
（２） 生育試験
■ 普通寒天平板培養（２ｇ〜３０″０ ２１１時間）
円形で平らな柔らかい集落を形成する。周辺は不規則で
表面はやや乾燥している。色は灰白色で可溶性色素は産
生じない。
円形で平らな柔らかい集落を形成する。周辺は不規則で
表面はやや乾燥している。色は灰白色で可溶性色素は産
生じない。
■ 普通寒天斜面培養（２ｇ〜３０Ｃ２−１４時間）
゛線状ｔこ生育し、生育は良好であり、色は灰白色
で可溶性色素は産生じない。
゛線状ｔこ生育し、生育は良好であり、色は灰白色
で可溶性色素は産生じない。
■ 液体培養（ペプトン水、２ｇ〜３０’Ｃ２１１時間
）生育は弱く柔毛状沈澱を生ずる。
）生育は弱く柔毛状沈澱を生ずる。
■ ＢＣＰミルク Ｃ２１〜３０℃ ２≠時間）溶液は
アルカリ性になりペプトン化する。
アルカリ性になりペプトン化する。
（３） 生理的性質
■ 硝酸塩の還元 十■ 脱窒
反応 −■ ＭＲテスト
−■ ｖＰテスト
＋■ 硫化水素の生成
−■ インド−μの生成 −■ デ
ンプンの加水分解 十■ クエン酸塩
の利用（シモンズ培地） ＋（クリステンゼン培
地） ＋ ■ マレイン酸塩の利用 ＋［相］
プロピオン酸塩の利用 −■ 可溶性色
素の生成 −■ ウレアーゼ産生（
ＳＳＲ）− （クリステンゼン） − ０オキンダーゼ産生 十■ レシチ
ナーゼ産生 −〇 カタラーゼ産生
十〇 生育の範囲（ｐＨ）
よＯ−９，０■ 生育温度 ｓｏ
℃ ＋２０℃ ＋ ７５℃ − Ｏ嫌気条件での生育 十〇 ＯＦテ
スト Ｆ［相］ ゼラチンの
加水分解 十〇 カゼインの加水分解
＋［相］ エスクリンの加水分解
十０ セ〃ロースの加水分解
−［相］ チロシンの加水分解
−［相］ 耐塩性 ψチま
で■ サブロー培地での生育 十＠ＧＣ
Ｉ（Ｔｍ法） ＜ｚ＜ｚ％（４）
糖より酸・ガスの産生（基礎培地：ペプトン不含培地
、 Ｎ Ｈａ Ｈ２Ｐ Ｏ４／、 Ｏｆ、 Ｋ Ｃ（１
０，２９ＭｇＳＯ４・７ Ｈ２００，２ｔ、イーストエ
キｙ、／、Ｏｆ寒天 ３．０１、ＢＴＢ Ｃ０，２’ｌ
Ａ） １０．０ｔｔｌ蒸留水 ７０００ｄ、ｐＨ’７
．２） 第 ／ 表 以上の結果から、本菌株の主性状は、単独、または短連
鎖で端の丸い桿状のダラム陽性の非運動性の細菌であり
、カタラーゼ陽性、オキンダーゼ陽性で、グルコースよ
り発ψ的に酸を産生じ、５０℃で生育し、核酸のグアニ
ン・シトシン含量（ＧＣ％）はグ４！チである。
反応 −■ ＭＲテスト
−■ ｖＰテスト
＋■ 硫化水素の生成
−■ インド−μの生成 −■ デ
ンプンの加水分解 十■ クエン酸塩
の利用（シモンズ培地） ＋（クリステンゼン培
地） ＋ ■ マレイン酸塩の利用 ＋［相］
プロピオン酸塩の利用 −■ 可溶性色
素の生成 −■ ウレアーゼ産生（
ＳＳＲ）− （クリステンゼン） − ０オキンダーゼ産生 十■ レシチ
ナーゼ産生 −〇 カタラーゼ産生
十〇 生育の範囲（ｐＨ）
よＯ−９，０■ 生育温度 ｓｏ
℃ ＋２０℃ ＋ ７５℃ − Ｏ嫌気条件での生育 十〇 ＯＦテ
スト Ｆ［相］ ゼラチンの
加水分解 十〇 カゼインの加水分解
＋［相］ エスクリンの加水分解
十０ セ〃ロースの加水分解
−［相］ チロシンの加水分解
−［相］ 耐塩性 ψチま
で■ サブロー培地での生育 十＠ＧＣ
Ｉ（Ｔｍ法） ＜ｚ＜ｚ％（４）
糖より酸・ガスの産生（基礎培地：ペプトン不含培地
、 Ｎ Ｈａ Ｈ２Ｐ Ｏ４／、 Ｏｆ、 Ｋ Ｃ（１
０，２９ＭｇＳＯ４・７ Ｈ２００，２ｔ、イーストエ
キｙ、／、Ｏｆ寒天 ３．０１、ＢＴＢ Ｃ０，２’ｌ
Ａ） １０．０ｔｔｌ蒸留水 ７０００ｄ、ｐＨ’７
．２） 第 ／ 表 以上の結果から、本菌株の主性状は、単独、または短連
鎖で端の丸い桿状のダラム陽性の非運動性の細菌であり
、カタラーゼ陽性、オキンダーゼ陽性で、グルコースよ
り発ψ的に酸を産生じ、５０℃で生育し、核酸のグアニ
ン・シトシン含量（ＧＣ％）はグ４！チである。
本菌株の王な性状について、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎ
ｕａｌ ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖ＠Ｂａｃｔｅｎ
ｏｌｏｇｙ ３版（／ワ７μ）を参照とした結果、本
菌株は、バチルス属に属する菌株と判定し、そこで、Ｈ
ａｎｄｂｏｏｋ Ａ １７２７ Ｔｈｅｇｅｎｕｓ
Ｂａｃｉｌｌｕｓを参照として近似菌であるバチルスｅ
リフエンフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎ
ｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ）、バチルスｌｌ：１７ギユラン
７ （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｑｕｌａｎｓ ）の諸
性状に基づいて比較検討の結果、バチルス・リフニジフ
ォルミスの諸性状がよく一致しているが、そ異 の運動性、耐塩性において若干の相違が認められた。以
上の結果から本菌株は、バチルス・リフエ；フオｐミヌ
に属し、その変異株と判断したもので、よって本菌株を
バチルス・リフエ〉フォルミ２１１ Ｂ −０１ｒ ９
／ （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ Ｂ−Ｏｇデ５？）と命名した。
ｕａｌ ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖ＠Ｂａｃｔｅｎ
ｏｌｏｇｙ ３版（／ワ７μ）を参照とした結果、本
菌株は、バチルス属に属する菌株と判定し、そこで、Ｈ
ａｎｄｂｏｏｋ Ａ １７２７ Ｔｈｅｇｅｎｕｓ
Ｂａｃｉｌｌｕｓを参照として近似菌であるバチルスｅ
リフエンフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎ
ｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ）、バチルスｌｌ：１７ギユラン
７ （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｑｕｌａｎｓ ）の諸
性状に基づいて比較検討の結果、バチルス・リフニジフ
ォルミスの諸性状がよく一致しているが、そ異 の運動性、耐塩性において若干の相違が認められた。以
上の結果から本菌株は、バチルス・リフエ；フオｐミヌ
に属し、その変異株と判断したもので、よって本菌株を
バチルス・リフエ〉フォルミ２１１ Ｂ −０１ｒ ９
／ （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ Ｂ−Ｏｇデ５？）と命名した。
なお、本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第８０ １ｇ号（ＦＥＲＭ−、！ｒＯ／、！ｒ）
として寄託された。
研菌寄第８０ １ｇ号（ＦＥＲＭ−、！ｒＯ／、！ｒ）
として寄託された。
本発明のビリルビン−オキシダーゼを生産するに当って
は、このビリルビン・オキシダーゼ生産菌を酵素などを
生産する通常の方法で培養する。
は、このビリルビン・オキシダーゼ生産菌を酵素などを
生産する通常の方法で培養する。
培養の形態は、液体培養でも固体培養でもよいが工業的
にはビリルビン・オキシダーゼ生産菌の細胞をその生産
用培地に接種し、深部通気攪拌培養を行なうのが有利で
ある。ビリルビン・オキシダーゼを培養するための培地
組成は、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用
される。窒素源として利用可能な窒素化合物であればよ
く、例えがコーン・スチーブ・リカー、ペプトン、カゼ
イン、大豆粉、酵母エキス、種々の肉エキスなどが使用
される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であれば
よく、例えば糖蜜、グルコース、グリセリン、シュクロ
ース、デキストリンなどが使用される。その他、食塩、
塩化カリウム、硫酸マグネシウム、第一リン酸カリウム
、第ニリン酸カリウムなどの種々の無機塩が必要に応じ
て使用される。
にはビリルビン・オキシダーゼ生産菌の細胞をその生産
用培地に接種し、深部通気攪拌培養を行なうのが有利で
ある。ビリルビン・オキシダーゼを培養するための培地
組成は、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用
される。窒素源として利用可能な窒素化合物であればよ
く、例えがコーン・スチーブ・リカー、ペプトン、カゼ
イン、大豆粉、酵母エキス、種々の肉エキスなどが使用
される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であれば
よく、例えば糖蜜、グルコース、グリセリン、シュクロ
ース、デキストリンなどが使用される。その他、食塩、
塩化カリウム、硫酸マグネシウム、第一リン酸カリウム
、第ニリン酸カリウムなどの種々の無機塩が必要に応じ
て使用される。
培養温度は菌が発育し、ビリルビン・オキシダーゼを生
産する範囲内で適宜変更し得るが、好ましくは、２５〜
３０℃である。培養時間は、条件によって多少異なるが
、通常７〜！ｒ日程度である。
産する範囲内で適宜変更し得るが、好ましくは、２５〜
３０℃である。培養時間は、条件によって多少異なるが
、通常７〜！ｒ日程度である。
しかしながら、ビリルビンΦオキシダーゼが最高力価に
達する時期をみはからって適当な時期に培養を終了する
のは当然のことである。
達する時期をみはからって適当な時期に培養を終了する
のは当然のことである。
培養終了後、該培養物より本酵素を採取するには通常の
酵素採取手段を用いて得ることができる。
酵素採取手段を用いて得ることができる。
なお、本酵素は歯体内および培養液相の両方に存在する
が、採取効率等の問題により、通常は、該培養物より菌
体を分別除去した培養液相より得るが、階体内より酵素
を採取する通常の手段を用い酵素を採取、培養液相より
得たものと合わせて用いてもよい。このようにして得ら
れた粗酵素液はさらに公知の蛋白質、酵素などの単離、
精製手段を用いて精製し、精製されたビリルビンΦオキ
シダーゼが得られる。例えば、粗製のビリルビン・オキ
Ｖｆ−−ｔ’含有液に、アセトン、メタノール、エタノ
ールなどの有機溶媒による分別沈澱法、硫安、食塩、硫
酸アルミニウムなどによる塩析法などを用い溶液から酵
素を沈澱せしめ、粗酵素を回収すればよい。
が、採取効率等の問題により、通常は、該培養物より菌
体を分別除去した培養液相より得るが、階体内より酵素
を採取する通常の手段を用い酵素を採取、培養液相より
得たものと合わせて用いてもよい。このようにして得ら
れた粗酵素液はさらに公知の蛋白質、酵素などの単離、
精製手段を用いて精製し、精製されたビリルビンΦオキ
シダーゼが得られる。例えば、粗製のビリルビン・オキ
Ｖｆ−−ｔ’含有液に、アセトン、メタノール、エタノ
ールなどの有機溶媒による分別沈澱法、硫安、食塩、硫
酸アルミニウムなどによる塩析法などを用い溶液から酵
素を沈澱せしめ、粗酵素を回収すればよい。
次いでさらに必要に応じて精製するに当って、この沈澱
物を、トリス−塩酸緩衝液などの溶媒に溶解し、これを
カルボキシメチル−セルロース、力μボキシメチル１デ
キストランゲル、スルホプロピル−デキストランゲルな
どのイオン交換樹脂やデキストランゲルやポリアクリル
アマイドゲルなどのゲルろ過剤ｔこよる吸着クロマトグ
ラフィーを適宜組合せて行なって精製し、次いでこれを
凍結乾燥等の手法をもちい乾燥し、精製ビリルビン−オ
キシダーゼを得る。
物を、トリス−塩酸緩衝液などの溶媒に溶解し、これを
カルボキシメチル−セルロース、力μボキシメチル１デ
キストランゲル、スルホプロピル−デキストランゲルな
どのイオン交換樹脂やデキストランゲルやポリアクリル
アマイドゲルなどのゲルろ過剤ｔこよる吸着クロマトグ
ラフィーを適宜組合せて行なって精製し、次いでこれを
凍結乾燥等の手法をもちい乾燥し、精製ビリルビン−オ
キシダーゼを得る。
このようにして得られたビリルビン・オキシダーゼの、
理化学的性質は以下に述べる通りである。
理化学的性質は以下に述べる通りである。
（リ 活性測定法
０、２ Ｍ ）リス塩酸緩衝液
（ｐＨ乙Ｏ／ｍＭ ＥＤＴＡ含有）ｏ、５ｒｔｔｔ水
Ｏ，デ
弘ゴビリ〜ピン彎オキシダーゼ溶液 ｏ、ｏｓｍｔ上
記組成の反応液／、≠９ｄを小試験管にとり、３７℃に
加温後、１０ｍＭビリルビン０．０ ／ ｍｌを添加し
て反応を開始し、３７℃でｌＯ分間反応せしめる。反応
後、／％ＣＰＣ（塩化Ｎ−セチルピリジニウム）を乙５
ｄ添加し反応を停止させた後＜４５Ｊｎｍにて比色して
、その吸光度（Ｓ）を測定した。一方、ブランクとして
、上記反応液より酸素溶液を除いた反応液／、 ＩＩ＃
属ｊにビリルビンＯ１Ｏ／’ ｍｅを添加して正確に３
７℃で１０分間経過した後／％ＣＰＣ／、ｌｌＪ、ビリ
〃ビン・オキシダーゼを算出する。酵素活性／単位（Ｕ
）は上記条件において１分間に／μモルのビリルビンを
酸化する酵素量とする。
Ｏ，デ
弘ゴビリ〜ピン彎オキシダーゼ溶液 ｏ、ｏｓｍｔ上
記組成の反応液／、≠９ｄを小試験管にとり、３７℃に
加温後、１０ｍＭビリルビン０．０ ／ ｍｌを添加し
て反応を開始し、３７℃でｌＯ分間反応せしめる。反応
後、／％ＣＰＣ（塩化Ｎ−セチルピリジニウム）を乙５
ｄ添加し反応を停止させた後＜４５Ｊｎｍにて比色して
、その吸光度（Ｓ）を測定した。一方、ブランクとして
、上記反応液より酸素溶液を除いた反応液／、 ＩＩ＃
属ｊにビリルビンＯ１Ｏ／’ ｍｅを添加して正確に３
７℃で１０分間経過した後／％ＣＰＣ／、ｌｌＪ、ビリ
〃ビン・オキシダーゼを算出する。酵素活性／単位（Ｕ
）は上記条件において１分間に／μモルのビリルビンを
酸化する酵素量とする。
（２） 基質特異性
酸素電極計を用いて各基質ｔこ対する酸素消費速度から
特異性を検討した結果、第２表に示す通りである。使用
基質量は、Ｑ、 ／ ｍ Ｍ 、使用酵素量は０．００
３； Ｕで行なった。
特異性を検討した結果、第２表に示す通りである。使用
基質量は、Ｑ、 ／ ｍ Ｍ 、使用酵素量は０．００
３； Ｕで行なった。
（３）＃素作用
次の反応を触媒する。
ビリルビン＋１／１２０２ →ビリベルジン＋Ｈ２０し
かしながら下記に示すビリベルジンから、淡紫色物への
酸化はごく微弱に生ずる。
かしながら下記に示すビリベルジンから、淡紫色物への
酸化はごく微弱に生ずる。
ビリベルジン＋’ＡＯ２→淡紫色物子Ｈ２０（４）熱安
定性 ｐＨ７５（）リス−塩酸緩衝液）で ３０〜１００℃の
各温度にて、１０分間処理した後、氷水中にて冷却し、
次いでこれを酵素の活性測定法に基いてその残存活性を
測定した。その結果 第１図に示す通りで、本発明のビ
リルビンオキシダーゼの熱安定性は、７０℃付近まで安
定であり、り０℃においても、５０チ以上の活性が残存
した。
定性 ｐＨ７５（）リス−塩酸緩衝液）で ３０〜１００℃の
各温度にて、１０分間処理した後、氷水中にて冷却し、
次いでこれを酵素の活性測定法に基いてその残存活性を
測定した。その結果 第１図に示す通りで、本発明のビ
リルビンオキシダーゼの熱安定性は、７０℃付近まで安
定であり、り０℃においても、５０チ以上の活性が残存
した。
（５）至適温度
前記活性測定法における反応液および方法を用いて種々
の温度における影響を調べた。
の温度における影響を調べた。
その結果は第２図に示す通りであり、本発明のビリルビ
ン・オキシダーゼの至適温度は、５０℃付近であると認
められた。
ン・オキシダーゼの至適温度は、５０℃付近であると認
められた。
（６）ＰＨ安定性
各種ｐＨの緩衝液にて３７℃、７時間保持した後、本酵
素の活性を前記活性測定法に基づいて測定してｐＨの影
響を調べた。
素の活性を前記活性測定法に基づいて測定してｐＨの影
響を調べた。
その結果は第３図に示す通りであり〔図中、０−０：酢
酸緩衝液（ｐＨ弘Ｏ−乙、Ｏ）、Ｏ−○ニジメチルグル
タル酸−ＮａＯＨ緩１１液（ｐ Ｈ２Ｓ −９，０＞
、） ＠−＠ ： ！Ｊ ン酸緩衝液（ｐＨ乙、 ｓ
−ｌｒ。
酸緩衝液（ｐＨ弘Ｏ−乙、Ｏ）、Ｏ−○ニジメチルグル
タル酸−ＮａＯＨ緩１１液（ｐ Ｈ２Ｓ −９，０＞
、） ＠−＠ ： ！Ｊ ン酸緩衝液（ｐＨ乙、 ｓ
−ｌｒ。
Ｏ）、０−Ｇ：）リス・塩酸緩衝液（ｐ Ｈ７，５−９
０）を示す〕、本発明のビリルビン・オキシダーゼのｐ
Ｈ安定性は、ｐＨ７−９付近と認められ袋。
０）を示す〕、本発明のビリルビン・オキシダーゼのｐ
Ｈ安定性は、ｐＨ７−９付近と認められ袋。
（７） 至適ｐＨ
前記活性測定法における緩衝液として各種ｐＨの緩衝液
を用いて、本酵素の活性に及ぼすｐＨの影響を調べた。
を用いて、本酵素の活性に及ぼすｐＨの影響を調べた。
その結果は第４図に示す通りであり〔図中、０−〇：酢
酸緩衝液ＣｐＨＩＡ０−乙、（７）、Ｏ−○ニジメチル
グルタ〃酸−Ｎａ ＯＨ緩衝液（ｐＨ７，５−９，０）
、・−・ニリン酸緩衝液（ｐ Ｈ１，，５−１０＞、Ｇ
−Ｇ：）リス−塩酸緩衝液ＣｐＨ７，５−９０）を示す
、本発明のビリルビン、・オキシダーゼの至適ｐＨは、
ｐＨｇ付近と認められた。
酸緩衝液ＣｐＨＩＡ０−乙、（７）、Ｏ−○ニジメチル
グルタ〃酸−Ｎａ ＯＨ緩衝液（ｐＨ７，５−９，０）
、・−・ニリン酸緩衝液（ｐ Ｈ１，，５−１０＞、Ｇ
−Ｇ：）リス−塩酸緩衝液ＣｐＨ７，５−９０）を示す
、本発明のビリルビン、・オキシダーゼの至適ｐＨは、
ｐＨｇ付近と認められた。
（８） 阻害および活性化
本ビリルビン嗜オキシダーゼは、Ｃｕ２＋、ｚｎ２＋。
Ｍｎ”、 の金属イオン、および、ｃｐｃ、 カチ
オンＦＢで阻害されｋＦＡＤで活性化された。
オンＦＢで阻害されｋＦＡＤで活性化された。
（９）分子量
ｓｏ、ｏｏｏ±／ ０．０００ （セフ７ り！Ｊ Ｉ
ｖＳ−３００によるゲルろ過性にて） （１４等電点 焦点電気泳動法により測定した結果、ｐＨ３，３５付近
である。
ｖＳ−３００によるゲルろ過性にて） （１４等電点 焦点電気泳動法により測定した結果、ｐＨ３，３５付近
である。
θ１）Ｋｍ値
以上の本発明惰素素を従来のビリルビン・オキシダーゼ
とを比較すると第３表の如くである。
とを比較すると第３表の如くである。
注 公知例／※ コプリナス属由来
公知例２奈憂 スエヒロタケ属由来
公知例３秦※※ミロセシウム属由来
熱安定性※※※※１０分間の熱処理において、なおり０
％以上の残存活性を有す る最高温度を示す。
％以上の残存活性を有す る最高温度を示す。
上述の如く、本酵素はその酵素化学的、物理化質
学的諸性状より公知の何れのビリルビン・オキシダーゼ
とも異なっており、熱安定性については、既存のビリル
ビン拳オキシダーゼをこで最も熱安定性１こ優れたコプ
リナス属由来のビリルビン・オキシダーゼにおいても、
乙Ｏ℃、ＩＯ分間の処理でりｏ−ｑｓｓの残存活性であ
るのに対し、本発明のビリルビン・オキシダーゼは、７
０℃、７０分間の処理まで安定であり、り０℃、１０分
間の処理してもなお、５０％もの残存活性を有し、極め
てすぐれた耐熱性を有する酵素であった。
とも異なっており、熱安定性については、既存のビリル
ビン拳オキシダーゼをこで最も熱安定性１こ優れたコプ
リナス属由来のビリルビン・オキシダーゼにおいても、
乙Ｏ℃、ＩＯ分間の処理でりｏ−ｑｓｓの残存活性であ
るのに対し、本発明のビリルビン・オキシダーゼは、７
０℃、７０分間の処理まで安定であり、り０℃、１０分
間の処理してもなお、５０％もの残存活性を有し、極め
てすぐれた耐熱性を有する酵素であった。
また、本酵素は、Ｋｍ値が、２．、ｔ６Ｘ１０ Ｍと非
常に小さく、反応性も極めて良好なものであった。
常に小さく、反応性も極めて良好なものであった。
実施例
以下実施例を挙げ、本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれｅこより限定されるものではない。
明はこれｅこより限定されるものではない。
実施例 ｌ
シュクロース／、０％（Ｗ／Ｖ） 、酵母菌体破砕物（
ミースト （朝日麦酒社製））／、０％（Ｗ／Ｖ）Ｎａ
Ｃ１０，３％ （Ｗ／Ｖ ） １Ｍｇ Ｓ Ｏｓ ｅ７
Ｈ２Ｏ０，０５％（Ｗ／Ｖ） 、 Ｋ２ＨＰ Ｏｓ
Ｏ，／％（Ｗ／Ｖ）よりなる培地１００１Ｌｔ Ｃ／
２０”Ｃ，２０分間滅菌、ｐＨ’７５）含有ｒｏｏｍ容
三角フラスコにバチＭスφリヒュニフオルミス・Ｂ−０
ざり／ （ＦＥＲＭＰ−Ａ １０ ／ ｌｒ ）を接種
し、３０℃、２μ時間振盪培養して種培養物を得た。次
いでこの種培養物を同一組成を有する培地２０ｇ （／
２０℃、２０分間減ｆ１１．ｐＨ７，３，消泡剤ＣＢ−
１７１４２の０．／’Ｉｓ含有）含有３０ｇ容ジャーフ
ァーメンタ−に、接種し、３０℃、３００ｒｐｍ、２０
１１分の通気条件１こてｇ日間通気攪拌培養した。培養
終了後培養物を遠心分離ＣＣ５０００ｒｐ、１５分間）
して上清Ｃ／３．１１．２００Ｕ） を得た。上清液
を限外濃縮（モジュール装置）にて、／、９６ｇに濃縮
し、濃縮液ｔこ対して０．６容の冷アセトンを添加し、
遠心分離（ＳＯＯＯｒｐｍ、１５分間）して、不溶物を
除去し、後に、さらに濃縮液に対してＡ６容の冷アセト
ンを添加し、ビリルビン・オキシダーゼ活性画分を析出
せしめ、遠心分離＜ＳＯＯＯｒｐｍ１５分間）して分離
し、沈澱物を０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液にて溶解し、
２０３Ｍ、２００Ｈの酵素溶液を得た。この酵素溶液を
セルロースアセテートチューブを用いて、１０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）１５Ａ！に対して一夜透
析後、あらかじめ上記緩衝液で緩衝化したＤＥＡＥ−セ
ファロースＣＬ−６Ｂカラム （よ（：ＪＸ／４４５の
）に吸着させ、次いで０− ／、 ０−Ｉ：Ａ／の塩化
カリウム濃度勾配溶出法で溶出せしめ、本酵素は、０．
３〜０、５モルの塩化カリウム濃度で溶出された酵素活
性区分を回収した。さらに、このビリルビン・オキシダ
ーゼ活性区分を限外−過膜ＸＭ−３０（アミコン社製）
にて濃縮して、これをセファクリルＳ−２００の力”Ｆ
Ａ （Ｊ、 ６Ｘ Ｉ Ｏｃｍ）にて１０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５１を用いて展開し、展開液量
ＳざＯ〜ｔａｏｔｔｔの間のピリジビン・オキシダーゼ
活性画分を回収し、これを凍結乾燥し、ビリルビン・オ
キシダーゼの粉末３５０９（９０，ＯＵ）を得た。
ミースト （朝日麦酒社製））／、０％（Ｗ／Ｖ）Ｎａ
Ｃ１０，３％ （Ｗ／Ｖ ） １Ｍｇ Ｓ Ｏｓ ｅ７
Ｈ２Ｏ０，０５％（Ｗ／Ｖ） 、 Ｋ２ＨＰ Ｏｓ
Ｏ，／％（Ｗ／Ｖ）よりなる培地１００１Ｌｔ Ｃ／
２０”Ｃ，２０分間滅菌、ｐＨ’７５）含有ｒｏｏｍ容
三角フラスコにバチＭスφリヒュニフオルミス・Ｂ−０
ざり／ （ＦＥＲＭＰ−Ａ １０ ／ ｌｒ ）を接種
し、３０℃、２μ時間振盪培養して種培養物を得た。次
いでこの種培養物を同一組成を有する培地２０ｇ （／
２０℃、２０分間減ｆ１１．ｐＨ７，３，消泡剤ＣＢ−
１７１４２の０．／’Ｉｓ含有）含有３０ｇ容ジャーフ
ァーメンタ−に、接種し、３０℃、３００ｒｐｍ、２０
１１分の通気条件１こてｇ日間通気攪拌培養した。培養
終了後培養物を遠心分離ＣＣ５０００ｒｐ、１５分間）
して上清Ｃ／３．１１．２００Ｕ） を得た。上清液
を限外濃縮（モジュール装置）にて、／、９６ｇに濃縮
し、濃縮液ｔこ対して０．６容の冷アセトンを添加し、
遠心分離（ＳＯＯＯｒｐｍ、１５分間）して、不溶物を
除去し、後に、さらに濃縮液に対してＡ６容の冷アセト
ンを添加し、ビリルビン・オキシダーゼ活性画分を析出
せしめ、遠心分離＜ＳＯＯＯｒｐｍ１５分間）して分離
し、沈澱物を０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液にて溶解し、
２０３Ｍ、２００Ｈの酵素溶液を得た。この酵素溶液を
セルロースアセテートチューブを用いて、１０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）１５Ａ！に対して一夜透
析後、あらかじめ上記緩衝液で緩衝化したＤＥＡＥ−セ
ファロースＣＬ−６Ｂカラム （よ（：ＪＸ／４４５の
）に吸着させ、次いで０− ／、 ０−Ｉ：Ａ／の塩化
カリウム濃度勾配溶出法で溶出せしめ、本酵素は、０．
３〜０、５モルの塩化カリウム濃度で溶出された酵素活
性区分を回収した。さらに、このビリルビン・オキシダ
ーゼ活性区分を限外−過膜ＸＭ−３０（アミコン社製）
にて濃縮して、これをセファクリルＳ−２００の力”Ｆ
Ａ （Ｊ、 ６Ｘ Ｉ Ｏｃｍ）にて１０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５１を用いて展開し、展開液量
ＳざＯ〜ｔａｏｔｔｔの間のピリジビン・オキシダーゼ
活性画分を回収し、これを凍結乾燥し、ビリルビン・オ
キシダーゼの粉末３５０９（９０，ＯＵ）を得た。
発明の効果
本発明のビリルビン・オキシダーゼは、熱安定性にすぐ
れ、酵素利用の一手段として固定化する際に、または、
臨床診断薬として取り扱う際に、熱に対して、失活等を
まねく恐れが非常に少なく扱いやすいものであり、この
新規かつ良好なビリ第１図は本発明のビリルビン・オキ
シダーゼの熱安定性を示し、 第２図は本発明のビリルビン働オキシダーゼの至適温度
を示し、 第３図は本発明のビリルビン働オキシダーゼのｐＨ安定
性を示し、 第ｑ図は本発明のビリルビン・オキシダーゼの至適Ｐ）
−％を示す。
れ、酵素利用の一手段として固定化する際に、または、
臨床診断薬として取り扱う際に、熱に対して、失活等を
まねく恐れが非常に少なく扱いやすいものであり、この
新規かつ良好なビリ第１図は本発明のビリルビン・オキ
シダーゼの熱安定性を示し、 第２図は本発明のビリルビン働オキシダーゼの至適温度
を示し、 第３図は本発明のビリルビン働オキシダーゼのｐＨ安定
性を示し、 第ｑ図は本発明のビリルビン・オキシダーゼの至適Ｐ）
−％を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）少なくともビリルビンに基質特異性を有し、ビリル
ビンおよび酸素からビリベルジンと水を生ずる反応を触
媒するビリルビン・オキシダーゼにおいて、少なくとも
耐熱性を有することを特徴とするビリルビン・オキシダ
ーゼ。 ２）ビリルビン・オキシダーゼが、熱に対して１０分間
、７０℃付近において安定である特許請求の範囲第１項
記載のビリルビン・オキシダーゼ。 ３）ビリルビン・オキシダーゼが下記の理化学性状を有
する特許請求の範囲第１項記載のビリルビン・オキシダ
ーゼ。 （ａ）分子量５０，０００±１０，０００（セファクリ
ルＳ−３００によるゲルろ過法） （ｂ）等電点ｐＨ３．３５付近 （ｃ）Ｋｍ値２．８６×１０＾−＾５Ｍ付近（ｄ）至適
ｐＨ ｐＨ８付近 （ｅ）安定ｐＨ ｐＨ７〜９付近にて安定 （ｆ）至適温度８０℃付近 （ｇ）熱安定性７０℃付近まで安定 ４）バチルス属に属するビリルビン・オキシダーゼ生産
菌を培地に培養し、培養物より該ビリルビン・オキシダ
ーゼを採取することを特徴とするビリルビン・オキシダ
ーゼの製造法。 ５）バチルス属に属するビリルビン・オキシダーーゼ生
産菌が、バチルス・リヒェニフォルミスである特許請求
の範囲第４項記載の製造法。 ６）バチルス属に属するビリルビン・オキシダーゼ生産
菌が、バチルス・リヒェニフォルミスＢ−０８９１株（
ＦＡＲＭＰ−Ｎｏ，８０１８）である特許請求の範囲第
４項記載の製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60020625A JPH0653069B2 (ja) | 1985-02-05 | 1985-02-05 | 耐熱性ビリルビン・オキシダーゼの製造法 |
| US06/820,011 US4770997A (en) | 1985-02-05 | 1986-01-21 | Thermostable bilirubin oxidase and production process thereof |
| DE19863603257 DE3603257A1 (de) | 1985-02-05 | 1986-02-03 | Thermostabile bilirubin-oxidase und verfahren zur herstellung derselben |
| IT47616/86A IT1203738B (it) | 1985-02-05 | 1986-02-04 | Bilirubin-cssidasi termostabile e procedimento per produrla |
| FR8601498A FR2576909B1 (fr) | 1985-02-05 | 1986-02-04 | Bilirubine oxydase thermostable et son procede d'obtention |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60020625A JPH0653069B2 (ja) | 1985-02-05 | 1985-02-05 | 耐熱性ビリルビン・オキシダーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61209587A true JPS61209587A (ja) | 1986-09-17 |
| JPH0653069B2 JPH0653069B2 (ja) | 1994-07-20 |
Family
ID=12032419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60020625A Expired - Lifetime JPH0653069B2 (ja) | 1985-02-05 | 1985-02-05 | 耐熱性ビリルビン・オキシダーゼの製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4770997A (ja) |
| JP (1) | JPH0653069B2 (ja) |
| DE (1) | DE3603257A1 (ja) |
| FR (1) | FR2576909B1 (ja) |
| IT (1) | IT1203738B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012153791A1 (ja) | 2011-05-11 | 2012-11-15 | 天野エンザイム株式会社 | 染色剤及びその用途 |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2578430B2 (ja) * | 1987-06-10 | 1997-02-05 | 旭化成工業株式会社 | 新規なビリルビン．オキシダーゼおよびその製造法 |
| EP0320095A3 (en) * | 1987-12-10 | 1989-08-02 | HEALTH & RESEARCH SERVICES INC. | Bilirubin degrading enzymes |
| JP2856757B2 (ja) * | 1989-03-13 | 1999-02-10 | ユニチカ株式会社 | 総ビリルビンの測定方法および測定用試薬 |
| DE4406379A1 (de) * | 1993-03-24 | 1994-09-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Bilirubinoxidase aus Alfalfa und Verwendung des Enzyms |
| JP3320307B2 (ja) * | 1996-06-06 | 2002-09-03 | 株式会社エス・ディー・エス バイオテック | フェノール性化合物等の高分子化方法及びその利用 |
| JP3734115B2 (ja) * | 1997-02-28 | 2006-01-11 | 日東紡績株式会社 | ビリルビン画分の測定方法 |
| EP1608747B1 (en) * | 2003-03-28 | 2008-12-24 | Council of Scientific and Industrial Research | A process for preparation of thermostable enzyme |
| US7504243B2 (en) | 2004-03-19 | 2009-03-17 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Methods for the production of biliverdin |
| US20080070971A1 (en) * | 2006-03-06 | 2008-03-20 | Wang Xiang H | Medical Use of Bilirubin and its Structural Analogues |
| FR2957934B1 (fr) | 2010-03-24 | 2014-10-17 | Centre Nat Rech Scient | Bilirubine oxydase de bacillus pumilus et ses applications |
| FR2975704B1 (fr) | 2011-05-24 | 2015-02-20 | Centre Nat Rech Scient | Bilirubine oxydase de magnaporthe oryzae et ses applications |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59198971A (ja) * | 1983-04-28 | 1984-11-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ビリルビンオキシダ−ゼの製造法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5861000A (ja) * | 1981-10-08 | 1983-04-11 | Nippon Shoji Kk | 体液成分の酵素的定量におけるビリルピンの干渉除去方法 |
-
1985
- 1985-02-05 JP JP60020625A patent/JPH0653069B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-01-21 US US06/820,011 patent/US4770997A/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-02-03 DE DE19863603257 patent/DE3603257A1/de not_active Ceased
- 1986-02-04 IT IT47616/86A patent/IT1203738B/it active
- 1986-02-04 FR FR8601498A patent/FR2576909B1/fr not_active Expired
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59198971A (ja) * | 1983-04-28 | 1984-11-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ビリルビンオキシダ−ゼの製造法 |
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| WO2012153791A1 (ja) | 2011-05-11 | 2012-11-15 | 天野エンザイム株式会社 | 染色剤及びその用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT8647616A0 (it) | 1986-02-04 |
| US4770997A (en) | 1988-09-13 |
| DE3603257A1 (de) | 1987-01-08 |
| JPH0653069B2 (ja) | 1994-07-20 |
| FR2576909A1 (fr) | 1986-08-08 |
| IT1203738B (it) | 1989-02-23 |
| FR2576909B1 (fr) | 1988-10-14 |
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