JPS5982086A - Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダ−ゼ - Google Patents
Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダ−ゼInfo
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- JPS5982086A JPS5982086A JP14521283A JP14521283A JPS5982086A JP S5982086 A JPS5982086 A JP S5982086A JP 14521283 A JP14521283 A JP 14521283A JP 14521283 A JP14521283 A JP 14521283A JP S5982086 A JPS5982086 A JP S5982086A
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- Japan
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- oxidase
- alpha
- acid oxidase
- reaction
- glycerophosphoric acid
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ（Ｌ−
α−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ：０２
ｏｘｉｄｏｒｅ −；ｃｌｕｃｔａｓｅ ；以下Ｌ−
α−ＧＰ−オキシダーゼと称する）と定義される酵素に
関する。
α−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ：０２
ｏｘｉｄｏｒｅ −；ｃｌｕｃｔａｓｅ ；以下Ｌ−
α−ＧＰ−オキシダーゼと称する）と定義される酵素に
関する。
Ｌ−α−ＧＰ−オキシダーゼは、Ｌ−α−グリセロ−３
−リン酸（Ｌ−０３Ｐ）および酸素からジヒドロキシア
セトン−３−リン酸（ＤＨＡＰ）および過酸化水素を生
ずる反応を触媒するものであって、下記反応式〔工〕 Ｌ−ＧＪＰ＋０２−−→ＤＨＡＨ＋Ｈ２Ｏ２（Ｉ：）ｅ
こて表わされ、ストレプトコッカヌ （Ｓ ｔｒｅｐｔ
ｏ −ｃｏｃｃｕｓ ｌ属、ラクトパシルヌ （Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉ １ｌｕｓ ）属、ロイコノヌトツク（Ｌ
ｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ）属、ペディオコッカス （Ｐ
ｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ）属（こ属する生産菌が生産す
ることが知られている。（特開昭５３−２１１ｇタコ号
公報、特開昭３３−３３−２ｌ１号公報、特開昭５３−
７２ｇ９２号公報）。
−リン酸（Ｌ−０３Ｐ）および酸素からジヒドロキシア
セトン−３−リン酸（ＤＨＡＰ）および過酸化水素を生
ずる反応を触媒するものであって、下記反応式〔工〕 Ｌ−ＧＪＰ＋０２−−→ＤＨＡＨ＋Ｈ２Ｏ２（Ｉ：）ｅ
こて表わされ、ストレプトコッカヌ （Ｓ ｔｒｅｐｔ
ｏ −ｃｏｃｃｕｓ ｌ属、ラクトパシルヌ （Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉ １ｌｕｓ ）属、ロイコノヌトツク（Ｌ
ｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ）属、ペディオコッカス （Ｐ
ｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ）属（こ属する生産菌が生産す
ることが知られている。（特開昭５３−２１１ｇタコ号
公報、特開昭３３−３３−２ｌ１号公報、特開昭５３−
７２ｇ９２号公報）。
しかしながら公知のし一α−ＧＰＳ−オキシダーゼは、
分子量約／ ３００００で７５０００ダイマーを形成し
、ｋｍ値−２６ｍＭであり、特にｋｍ値が大きく反応性
が極めて悪く、微量成分を測定す−２− るだめの酵素試薬としては不適当なものてあった。
分子量約／ ３００００で７５０００ダイマーを形成し
、ｋｍ値−２６ｍＭであり、特にｋｍ値が大きく反応性
が極めて悪く、微量成分を測定す−２− るだめの酵素試薬としては不適当なものてあった。
さらｔこヌトレプ１−コツカヌ属に属するヌ１−レテ１
−コツカヌ・フェシウム （５ｔｅｒｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｆａｅｃｉｕｍ ）ＡＴＣＣ／２７５Ｓ株からの
し一α−ＧＰ−オキシダーゼはｋｍ値も犬ぎく、さらＱ
こ／ｍＭＬ−Ｇ３Ｐ条件下の金属イオン添加ｔこおける
作用幼芽ｔこて、無添加の場合に比べてマグネシウムイ
メーン添加にて乙ｇ倍、マンガンイオン添力旧こて７６
倍の活性を示す特徴を有し、さらにフラクト−ヌー／−
リン酸、フック１−−スー乙−リン酸の右在（こて失活
されるものであった。
−コツカヌ・フェシウム （５ｔｅｒｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｆａｅｃｉｕｍ ）ＡＴＣＣ／２７５Ｓ株からの
し一α−ＧＰ−オキシダーゼはｋｍ値も犬ぎく、さらＱ
こ／ｍＭＬ−Ｇ３Ｐ条件下の金属イオン添加ｔこおける
作用幼芽ｔこて、無添加の場合に比べてマグネシウムイ
メーン添加にて乙ｇ倍、マンガンイオン添力旧こて７６
倍の活性を示す特徴を有し、さらにフラクト−ヌー／−
リン酸、フック１−−スー乙−リン酸の右在（こて失活
されるものであった。
本発明者らは、種々研究した結芽、」二記１／）神々の
微生物とその属を異（こするアエロコツカス（Ａｅｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ Ｉ 属に属する酌、＼エロコツカヌ・ヒ
゛リダンヌＩ Ｆ Ｏ／ ２２ ／ ｑ（Ａｅｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓＩ ＦＯ／’２．２’／
９ 、同１’ＦＯ／’２３／７が同様シこＬ−α−Ｇ
Ｐ−オキシダーゼな生産することを見い出した。
微生物とその属を異（こするアエロコツカス（Ａｅｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ Ｉ 属に属する酌、＼エロコツカヌ・ヒ
゛リダンヌＩ Ｆ Ｏ／ ２２ ／ ｑ（Ａｅｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓＩ ＦＯ／’２．２’／
９ 、同１’ＦＯ／’２３／７が同様シこＬ−α−Ｇ
Ｐ−オキシダーゼな生産することを見い出した。
このＬ−α−ＧＰ−オギシダーゼは、
（ａ）Ｌ−Ｇ３Ｐ＆こ基質特異性を有し、（＋））Ｌ−
Ｇ３Ｐおよび酸素からＤ Ｍ Ａ Ｐおよび過酸化水素
を生ずる反応を触媒する酵素作用を有し、（ｃ）至適ｐ
Ｈが７５−４．５付近で、（ｄ）安定ｐＨがＡ〜り付近
で、 （ｅ）熱安定性において４ｔθ℃伺近まで安定で、（ｆ
）分子量が７１ＯＯＯ付近（セファデックスＧ−／ ３
０ ＋・こよる値） 、７Ｓ０００付近ｔＳＤＳ−ポリ
アクリルアミ）・電気泳動ゲルによる値）で被数サブユ
ニット構造をしておらず、 （ｇ） ｋｍ値が約３．２ ｍ Ｍ付近である理化学
的性質を有する酵素であった。
Ｇ３Ｐおよび酸素からＤ Ｍ Ａ Ｐおよび過酸化水素
を生ずる反応を触媒する酵素作用を有し、（ｃ）至適ｐ
Ｈが７５−４．５付近で、（ｄ）安定ｐＨがＡ〜り付近
で、 （ｅ）熱安定性において４ｔθ℃伺近まで安定で、（ｆ
）分子量が７１ＯＯＯ付近（セファデックスＧ−／ ３
０ ＋・こよる値） 、７Ｓ０００付近ｔＳＤＳ−ポリ
アクリルアミ）・電気泳動ゲルによる値）で被数サブユ
ニット構造をしておらず、 （ｇ） ｋｍ値が約３．２ ｍ Ｍ付近である理化学
的性質を有する酵素であった。
本発明は、上記の知見に基いて完成されたもので、本発
明のＬ−α−ＧＰ−オキシダーゼは生体内物質代謝にお
けるＬ ’−Ｇ ３ Ｐを基質とする酸化酵素であるた
め、血清またはその他の試料中のし一０３Ｐ、グリセリ
ン、グリセライド、ホヌファチジン酸、その他のリン脂
質の定量、グリセロキナーゼなどの酵素活性の測定など
ｔこ、必要に応じて他の酵素や呈色試薬との組合せを用
いて、研究用試薬、診断用試薬として有用な用途を有す
るものである。
明のＬ−α−ＧＰ−オキシダーゼは生体内物質代謝にお
けるＬ ’−Ｇ ３ Ｐを基質とする酸化酵素であるた
め、血清またはその他の試料中のし一０３Ｐ、グリセリ
ン、グリセライド、ホヌファチジン酸、その他のリン脂
質の定量、グリセロキナーゼなどの酵素活性の測定など
ｔこ、必要に応じて他の酵素や呈色試薬との組合せを用
いて、研究用試薬、診断用試薬として有用な用途を有す
るものである。
本発明におけるＬ−α−ＧＰ−オキシダーゼ生産菌とし
ては、例えばアエロコツカス・ビリダン；’ＩＦＯ／２
２／９、アエロコッ力スービリダンヌＩＦＯ／２３／７
が挙げられる。
ては、例えばアエロコツカス・ビリダン；’ＩＦＯ／２
２／９、アエロコッ力スービリダンヌＩＦＯ／２３／７
が挙げられる。
本発明を実施するに当っては、Ｌ−σ−ＧＰ−オキシダ
ーゼ生産菌を、酵素を生産する通常の方法で培養する。
ーゼ生産菌を、酵素を生産する通常の方法で培養する。
培養の形態は通常液体培養て行なうのが有利である。培
地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるも
のが広く使用され得る。炭素源としては同化可能な炭素
化合物であれハヨく、例えばグルコース、シュクロース
、ラクトース、マルトース、フラクトーヌ、糖蜜、グリ
セロール、ピルビン酸などが使用される。窒素源として
は利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン
、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキヌ、大豆粉、カゼ
イン加水分解物などが用いられる。その他、リン酸塩、
炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、力！レシウム、カリウ
ム、ナ１リウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類が必要
に応じて使−５− 用される。
地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるも
のが広く使用され得る。炭素源としては同化可能な炭素
化合物であれハヨく、例えばグルコース、シュクロース
、ラクトース、マルトース、フラクトーヌ、糖蜜、グリ
セロール、ピルビン酸などが使用される。窒素源として
は利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン
、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキヌ、大豆粉、カゼ
イン加水分解物などが用いられる。その他、リン酸塩、
炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、力！レシウム、カリウ
ム、ナ１リウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類が必要
に応じて使−５− 用される。
培養温度は菌が発育し、Ｌ−α−ＧＰ−オキシダーゼを
生産する範囲内で適宜変更し得るが、好ましくは、２５
〜３７℃程度がよく、また培養時間は条件によって異な
るが、Ｌ−α−ＧＰ−オキシダーゼが最高収量ｔこ達す
る時間を見計って適当な時期に培養を終了すればよく、
通常１０〜グざ時間程度である。
生産する範囲内で適宜変更し得るが、好ましくは、２５
〜３７℃程度がよく、また培養時間は条件によって異な
るが、Ｌ−α−ＧＰ−オキシダーゼが最高収量ｔこ達す
る時間を見計って適当な時期に培養を終了すればよく、
通常１０〜グざ時間程度である。
次いで、このようなこして得られた培養物からし一α−
ＧＰ−オギシダーゼを採取するのであるかは 、本Ｉ「素旌主として菌体内ｔこ存在する。本酵素を採
取するｔこは、まず得られた培養物を濾過または遠心分
離などの手段によりその菌体を採取し、次いてこの菌体
を種々の機械的方法、またはリゾチームなどの酵素的方
法にて破壊し、また必要ｔこ応じてエチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ、） や） ｌ）トンＸ−／ ００ （
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：商品名）、アデカ１−−ル
Ｓｏ−／、２０ （商品名）などの界面活性剤を添加
して本酵素を可溶化して分離、採取する。さらにこのよ
うｅこして得られたＬ−α−−乙 − ＧＰ−オキシダーゼ含有溶液は濃縮するか、またはｌ展
縮することなく可溶性塩類、例えば硫安なとを用いて塩
析せしめるか、親水性有機溶媒、例えばメタノール、エ
タノール、アセトン、イン１０パノールなとの添加によ
り本酵素を沈澱せしめればよい。次いて、この沈澱物は
水または緩衝液に溶解し、半透膜（・こて透析ぜしめて
低分子甲の不純物を除去することができる。また吸着剤
あるいはな ゲ／Ｉ／−過剤はど（こよる吸着クロマ１−グラフィー
イオン交換クロマ１−グラフィーあるいはゲルｌ濾過な
との手段によりＬ−α−ＧＰ−オキシダーゼを精製する
。さらｅここれらの手段により得られた酵素溶液は減圧
濃縮、限外−過膜濃縮、さら（こ凍結乾燥なとの処理シ
こより精製されたＬ−α−ＧＰ−オキシダーゼを得る。
ＧＰ−オギシダーゼを採取するのであるかは 、本Ｉ「素旌主として菌体内ｔこ存在する。本酵素を採
取するｔこは、まず得られた培養物を濾過または遠心分
離などの手段によりその菌体を採取し、次いてこの菌体
を種々の機械的方法、またはリゾチームなどの酵素的方
法にて破壊し、また必要ｔこ応じてエチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ、） や） ｌ）トンＸ−／ ００ （
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：商品名）、アデカ１−−ル
Ｓｏ−／、２０ （商品名）などの界面活性剤を添加
して本酵素を可溶化して分離、採取する。さらにこのよ
うｅこして得られたＬ−α−−乙 − ＧＰ−オキシダーゼ含有溶液は濃縮するか、またはｌ展
縮することなく可溶性塩類、例えば硫安なとを用いて塩
析せしめるか、親水性有機溶媒、例えばメタノール、エ
タノール、アセトン、イン１０パノールなとの添加によ
り本酵素を沈澱せしめればよい。次いて、この沈澱物は
水または緩衝液に溶解し、半透膜（・こて透析ぜしめて
低分子甲の不純物を除去することができる。また吸着剤
あるいはな ゲ／Ｉ／−過剤はど（こよる吸着クロマ１−グラフィー
イオン交換クロマ１−グラフィーあるいはゲルｌ濾過な
との手段によりＬ−α−ＧＰ−オキシダーゼを精製する
。さらｅここれらの手段により得られた酵素溶液は減圧
濃縮、限外−過膜濃縮、さら（こ凍結乾燥なとの処理シ
こより精製されたＬ−α−ＧＰ−オキシダーゼを得る。
次シこ、本発明のし一α−ＣＰ−’オキシダーゼの力価
の測定法、その性状などについて述べる。
の測定法、その性状などについて述べる。
（１） 力価の測定法
Ｑ、 ２ Ｍ ＋・リス塩酸緩衝液１ ｐ Ｈｆ、 Ｏ
） ０．２ ｍ１４バーオキシダーゼ（０，！；Ｔ
ｎ９／ｍｌｉ、 １１３Ｕ／ｍ句０． ／ ｍｅｏ、３
（Ｗ／Ｖ） ／ｌ−アミノアンチピリンＱ、 ／
ｍｌＯ，／ＭＤＬ−Ｇ３Ｐ
Ｏ，１ｍ１Ｏ，２％ （Ｖ／Ｖ）Ｎ、Ｎ−ジメチル
アニリン０，１ｍｌ！蒸留水
Ｑ、 ３ ｍｅ」１記組成の反応液／、’ Ｑ
ｍｅを小試験管（こ取り、３分間３７℃で予備加温し
、これに２０１１１の酵素液を添加してｌＯ分間反応せ
しめ、次いでこれに０゜２．５’％ （Ｗ／Ｖ） ラ
ウリルベンゼンスルホン酸すトリウム２． Ｏｍｌを加
えて反応を停止し、これを５４３ｎｍの波長でその吸光
度を測定する。
） ０．２ ｍ１４バーオキシダーゼ（０，！；Ｔ
ｎ９／ｍｌｉ、 １１３Ｕ／ｍ句０． ／ ｍｅｏ、３
（Ｗ／Ｖ） ／ｌ−アミノアンチピリンＱ、 ／
ｍｌＯ，／ＭＤＬ−Ｇ３Ｐ
Ｏ，１ｍ１Ｏ，２％ （Ｖ／Ｖ）Ｎ、Ｎ−ジメチル
アニリン０，１ｍｌ！蒸留水
Ｑ、 ３ ｍｅ」１記組成の反応液／、’ Ｑ
ｍｅを小試験管（こ取り、３分間３７℃で予備加温し
、これに２０１１１の酵素液を添加してｌＯ分間反応せ
しめ、次いでこれに０゜２．５’％ （Ｗ／Ｖ） ラ
ウリルベンゼンスルホン酸すトリウム２． Ｏｍｌを加
えて反応を停止し、これを５４３ｎｍの波長でその吸光
度を測定する。
酵素活性の算出は次式に従う。
（ただし、△ＡはＳＡＳｎｍにおける７０分間での吸光
値を示す。） （２）基質特異性：Ｌ−Ｇ３Ｐ＆こ基質特異性を有する
。
値を示す。） （２）基質特異性：Ｌ−Ｇ３Ｐ＆こ基質特異性を有する
。
前記の力価の測定法におけるＤＬ−ＧＪＰの代りに、第
１表ｔこ記載の化合物を基質として用いてその相対活性
を測定したもので、その結果は第１表（こ示す通りであ
る。
１表ｔこ記載の化合物を基質として用いてその相対活性
を測定したもので、その結果は第１表（こ示す通りであ
る。
第１表
Ｐおよび過酸化水素を生ずる反応を触媒する。
その詳細な酵素反応は、以下の通りである。
Ｔ、Ｇ３Ｐ＋０２ＯＦＡＤ−＋ＤＨＡＰ＋ＧＰＯＦＡＤ
Ｈ２ＧＰＯ−ＦＡＤＨ２＋０２ →ＧＰＯ−ＦＡＤ＋Ｈ
２Ｏ２Ｌ−Ｇ３Ｐ＋０２−） ＤＨＡＰ＋Ｈ２Ｏ２（た
だしＧＰＯ−ＦＡＤは、Ｌ−α−ＧＰ−オキシダーゼ分
子を意味し、−ＦＡＤはＬ−α−ＧＰ−：Ａ−キシター
セ＋こリンクしたフラビンアデニン−タ − ジヌクレオンＦ ヲ意味ｔ ル） （４）至適ｐＨ ジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝ｉ （ｐ Ｈ！ｔ
Ｏ〜７０）、トリヌー塩酸緩衝液（ｐＨ’７ｏ−７０）
ヲ用いて、アエロコツカス・ビリダンスＩＦＯ／２．２
／りより得られたし一α−ＧＰ−オキシダーゼの至適ｐ
Ｈを求めた結果、第１図（こ示す通りであって、本酵素
の至適ｐＨは７５〜ｇ５付近と認められる。
Ｈ２ＧＰＯ−ＦＡＤＨ２＋０２ →ＧＰＯ−ＦＡＤ＋Ｈ
２Ｏ２Ｌ−Ｇ３Ｐ＋０２−） ＤＨＡＰ＋Ｈ２Ｏ２（た
だしＧＰＯ−ＦＡＤは、Ｌ−α−ＧＰ−オキシダーゼ分
子を意味し、−ＦＡＤはＬ−α−ＧＰ−：Ａ−キシター
セ＋こリンクしたフラビンアデニン−タ − ジヌクレオンＦ ヲ意味ｔ ル） （４）至適ｐＨ ジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝ｉ （ｐ Ｈ！ｔ
Ｏ〜７０）、トリヌー塩酸緩衝液（ｐＨ’７ｏ−７０）
ヲ用いて、アエロコツカス・ビリダンスＩＦＯ／２．２
／りより得られたし一α−ＧＰ−オキシダーゼの至適ｐ
Ｈを求めた結果、第１図（こ示す通りであって、本酵素
の至適ｐＨは７５〜ｇ５付近と認められる。
（５）熱安定性
アエロコツカス・ビリダンスＩＦＯ／２２／９より得ら
れたＬ−α−ＧＰ−オキシダーゼを０７Ｍジメチルグル
タル酸−ＮａＯＨ緩１ｉ液’ （ｐ Ｈ２Ｏ）に溶解し
く ０．５ Ｕ／ ｍ１４ ） 、これを０〜７０℃で
１０分間加熱した後、その溶液中の残存活性を測定した
。その結果は第２図に示す通りで１１０℃付近まで安定
である。
れたＬ−α−ＧＰ−オキシダーゼを０７Ｍジメチルグル
タル酸−ＮａＯＨ緩１ｉ液’ （ｐ Ｈ２Ｏ）に溶解し
く ０．５ Ｕ／ ｍ１４ ） 、これを０〜７０℃で
１０分間加熱した後、その溶液中の残存活性を測定した
。その結果は第２図に示す通りで１１０℃付近まで安定
である。
（６） Ｉ）’Ｈ安定性
アエロコツカス・ビリダンスＩＦＯ／２２／９より得ら
れたＬ−α−ＧＰ−オキシダーゼを、ｏ。
れたＬ−α−ＧＰ−オキシダーゼを、ｏ。
−／ Ｏ−
７Ｍジメチルグルタル酸−Ｎａ ＯＨ緩衝液ｆｐＨ＆０
〜７０）、トリヌー塩酸緩衝液（ｐＨ７０−７０）ｆこ
溶解しＩＯ，ＳＴＪ／ｍｌ ） 、／ｌ−５℃で７０分
間加温した後、それぞれの残存活性を測定した。その結
果は、第３図に示す通りである。また」１記緩衝液を用
い、酵素濃度Ｑ、 ３ ｍｆ ／ ｍｅとし、３０℃で
場 ２０時間処理した後金の残存活性を測定した結果、第ｑ
図に示す通りでｐ Ｈ６〜９付近で安定であった。
〜７０）、トリヌー塩酸緩衝液（ｐＨ７０−７０）ｆこ
溶解しＩＯ，ＳＴＪ／ｍｌ ） 、／ｌ−５℃で７０分
間加温した後、それぞれの残存活性を測定した。その結
果は、第３図に示す通りである。また」１記緩衝液を用
い、酵素濃度Ｑ、 ３ ｍｆ ／ ｍｅとし、３０℃で
場 ２０時間処理した後金の残存活性を測定した結果、第ｑ
図に示す通りでｐ Ｈ６〜９付近で安定であった。
（７）分子量：セファデツクヌＧ−７３０を用いるゲル
ー過法において分子Ｊｉ ７ ’ｌ ００ Ｑ付近であ
り、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（こお
いて分子量７３０００付近であり、複数ザブユニット構
造をなしていなかった。
ー過法において分子Ｊｉ ７ ’ｌ ００ Ｑ付近であ
り、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（こお
いて分子量７３０００付近であり、複数ザブユニット構
造をなしていなかった。
（ｅ） ｋｒｎ値：約３．２ ｍ Ｍ付近である。
このｋｍ値の測定方法は公知の方法ｔこ準じて行ったも
ので、詳しくは以下の通りである。
ので、詳しくは以下の通りである。
０、．２Ｍ）リヌ塩酸緩衝ｔＬ（ｐ Ｈｇ、 ０ ）
０．２ ｍ１４パーオキシダーゼ（１１３Ｕ／ｍｅ）
０． ／ ｍ１４−／／− ０、３ ＋Ｗ／Ｖ）％１％−７ミ／７ンチピリンｏ／ｍ
ｅＯ，２（Ｗ／Ｖ） ４ Ｎ、 Ｎ −シｊチル７ ＝
ＩＪ ンＱ、 、：ｌ ｍｌ：Ｌ−α−ＧＰ−オキシ
ダーゼ（０，Ｏ５Ｕ／ｍ１４） ０．７ ｍｇ
蒸留水 Ｑ、 、ｊ ｍ
ｅ合計 ０．９ ｍｌ！ 〔反応停止液〕 ０、２３ （Ｗ／Ｖ）％ラウリ／レベンゼンヌルホン酸
す１−リウム ２． Ｏｍｇ 〔操作〕 上記反応液０．９ ｍｌを小試験管に取り、３７℃ｔこ
加温する。これに０．３ｍＭ＋ ０．７３ｍＭ、／、Ｏ
ｍＭ 、３．０ ｍ Ｍ 、ｊ Ｏｍ Ｍ ＋ ７５
ｍ Ｍｒ ／ Ｏｍ Ｍｒ、２０ｍＭのＬ−Ｇ３ｐｇ
液０． ／ ｍｌ、を添加して反応を開始し、３７℃で
正確に１０分間反応した後２Ｑｍｅの反応停止液を添加
し反応を停止した。次いで反応終了液を、波長５乙ｓｎ
ｍで吸光度測定する。このときの最終基質濃度と酵素活
性の関係をＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ −Ｂｕｒｋらの方法
ｅこより舞−出する。
０．２ ｍ１４パーオキシダーゼ（１１３Ｕ／ｍｅ）
０． ／ ｍ１４−／／− ０、３ ＋Ｗ／Ｖ）％１％−７ミ／７ンチピリンｏ／ｍ
ｅＯ，２（Ｗ／Ｖ） ４ Ｎ、 Ｎ −シｊチル７ ＝
ＩＪ ンＱ、 、：ｌ ｍｌ：Ｌ−α−ＧＰ−オキシ
ダーゼ（０，Ｏ５Ｕ／ｍ１４） ０．７ ｍｇ
蒸留水 Ｑ、 、ｊ ｍ
ｅ合計 ０．９ ｍｌ！ 〔反応停止液〕 ０、２３ （Ｗ／Ｖ）％ラウリ／レベンゼンヌルホン酸
す１−リウム ２． Ｏｍｇ 〔操作〕 上記反応液０．９ ｍｌを小試験管に取り、３７℃ｔこ
加温する。これに０．３ｍＭ＋ ０．７３ｍＭ、／、Ｏ
ｍＭ 、３．０ ｍ Ｍ 、ｊ Ｏｍ Ｍ ＋ ７５
ｍ Ｍｒ ／ Ｏｍ Ｍｒ、２０ｍＭのＬ−Ｇ３ｐｇ
液０． ／ ｍｌ、を添加して反応を開始し、３７℃で
正確に１０分間反応した後２Ｑｍｅの反応停止液を添加
し反応を停止した。次いで反応終了液を、波長５乙ｓｎ
ｍで吸光度測定する。このときの最終基質濃度と酵素活
性の関係をＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ −Ｂｕｒｋらの方法
ｅこより舞−出する。
（８）金属イオン、ＥＤＴＡおよびＰＣＭＢ（Ｐ−クロ
ロマーキュリ安息香酸）添加における影響ニー ７２
− 第２表ｔこ示す通りである。
ロマーキュリ安息香酸）添加における影響ニー ７２
− 第２表ｔこ示す通りである。
第２表
通りである。
フラクトース−乙−リン酸 ／、ＯｍＭ
１０Ｓフラクトーヌ＝／乙−ジリン酸 ／、ＯｍＭ
１００（１ユ 界面活性剤添加ｅこおける影響：
第１表ｔこ示す通りである。
１０Ｓフラクトーヌ＝／乙−ジリン酸 ／、ＯｍＭ
１００（１ユ 界面活性剤添加ｅこおける影響：
第１表ｔこ示す通りである。
第７表
０１）可視部吸収スペクトル：第６図ｔこ示す通りであ
り、４Ｚ１１７ｎｍ付近および３７”ｌｎｍ付近に特異
的吸収帯を有する。
り、４Ｚ１１７ｎｍ付近および３７”ｌｎｍ付近に特異
的吸収帯を有する。
−／ゲ −
サラ）こ、アエロコッカヌ・ビリダンヌＩＦＯ／２３／
７より得られたＬ−α−ＧＰ−オキシダーゼも同様の性
状を有するものであった。
７より得られたＬ−α−ＧＰ−オキシダーゼも同様の性
状を有するものであった。
次に実施例を挙げて本発明を具体的（こ述べるが、本発
明はこれ（こよって何んら限定されるものではない。
明はこれ（こよって何んら限定されるものではない。
実施例／
グリセリン７０％、ラクト一ヌ、２０％、ポリペプトン
／、０％、酵旬エキヌ１０％、肉エキス０５係、Ｋ’Ｈ
２Ｐ Ｏ４０，／％、Ｋ２ＨＰＯ４０，／％、Ｎａ Ｃ
ｌＯ２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５％の糸目成よ
りなる培地（ｐ Ｈ７，０）を３０１容のシャーファレ
メータｔこ入れ、１０２のシリコンＫＳ−乙乙 （消泡
剤、商品名、信越化学に、に製）を添加後／２０℃、２
０分間滅菌する。今後１０時間予（ｆｌｉｉ培養したア
エロコッカヌ・ビリダンヌＩＦＯ−／、２．２／９、Ｉ
ＦＯ−／：２３／７をそれぞれ、２００ ｍｌ！＃（菌
し、３０℃で７５時間培養し、培養後、培！液をｊ；、
ＯＯＯｒｐｍで７０分間遠心して集菌し、得られた菌体
はさら（こ、３００ ｍｌの／ Ｏｍ Ｍ ＩＪン酸酸
塩−／ ５ − 衝液（ｐ Ｉ−Ｔ ７０ ） で洗浄後、リゾチーム溶
液（０／ｌｒｎｇ ／ ｍｌ 、 ／ Ｏｍ Ｍリン
酸緩衝液）／１．ｏｏｍ／！中ｔこ懸濁し、３７℃で６
０分間作用せしめて菌体を破壊し、酵素を可溶化した後
、左０００回転で７５分間遠心分離して酵素液を得る。
／、０％、酵旬エキヌ１０％、肉エキス０５係、Ｋ’Ｈ
２Ｐ Ｏ４０，／％、Ｋ２ＨＰＯ４０，／％、Ｎａ Ｃ
ｌＯ２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５％の糸目成よ
りなる培地（ｐ Ｈ７，０）を３０１容のシャーファレ
メータｔこ入れ、１０２のシリコンＫＳ−乙乙 （消泡
剤、商品名、信越化学に、に製）を添加後／２０℃、２
０分間滅菌する。今後１０時間予（ｆｌｉｉ培養したア
エロコッカヌ・ビリダンヌＩＦＯ−／、２．２／９、Ｉ
ＦＯ−／：２３／７をそれぞれ、２００ ｍｌ！＃（菌
し、３０℃で７５時間培養し、培養後、培！液をｊ；、
ＯＯＯｒｐｍで７０分間遠心して集菌し、得られた菌体
はさら（こ、３００ ｍｌの／ Ｏｍ Ｍ ＩＪン酸酸
塩−／ ５ − 衝液（ｐ Ｉ−Ｔ ７０ ） で洗浄後、リゾチーム溶
液（０／ｌｒｎｇ ／ ｍｌ 、 ／ Ｏｍ Ｍリン
酸緩衝液）／１．ｏｏｍ／！中ｔこ懸濁し、３７℃で６
０分間作用せしめて菌体を破壊し、酵素を可溶化した後
、左０００回転で７５分間遠心分離して酵素液を得る。
この際のし一α−ＧＰ−オキシダーゼ活性は次に示す通
りであった。
りであった。
菌 株 酵素活性（Ｕ／ｍｌ培養液）ア
エロコッカヌ・ピリダンヌ ＩＦＯ−／２２／９ ０．ｇＯ アエロフツカヌ・ビリダンヌ ＩＦＯ−／２３／７ ０．７ｇ 実施例２ アエロコツカヌ・ビリダンヌＩＦＯ−／２２／りを実施
例／に記載方法と１司様にして培養し、得た酵素液／１
２０ｍ１！（／乙、ｏｏｏｉＪｌ に硫安溶液を用いて
硫安濃度０２グ〜０グｇ飽和で沈澱した両分を遠心分離
をこて集め、その沈澱物を１０ｍＭリン酸緩衝液Ｎ）
Ｈ７，０１Ｓ ０ｍｌＶｔこ溶解し、コレラ／ Ｏｍ
Ｍ ＩＪン酸緩衝液 （ｐＨ７，０）に対して七ルー
／乙 − ロースアセテ−１・透析チーブを用いて透析して、精製
したＬ−α−ＰＧ−オキシダーゼを得た。なお、その回
収率はｇ３乙係であった。
エロコッカヌ・ピリダンヌ ＩＦＯ−／２２／９ ０．ｇＯ アエロフツカヌ・ビリダンヌ ＩＦＯ−／２３／７ ０．７ｇ 実施例２ アエロコツカヌ・ビリダンヌＩＦＯ−／２２／りを実施
例／に記載方法と１司様にして培養し、得た酵素液／１
２０ｍ１！（／乙、ｏｏｏｉＪｌ に硫安溶液を用いて
硫安濃度０２グ〜０グｇ飽和で沈澱した両分を遠心分離
をこて集め、その沈澱物を１０ｍＭリン酸緩衝液Ｎ）
Ｈ７，０１Ｓ ０ｍｌＶｔこ溶解し、コレラ／ Ｏｍ
Ｍ ＩＪン酸緩衝液 （ｐＨ７，０）に対して七ルー
／乙 − ロースアセテ−１・透析チーブを用いて透析して、精製
したＬ−α−ＰＧ−オキシダーゼを得た。なお、その回
収率はｇ３乙係であった。
実施例３”、０３Ｐの定量
」１記力価の測定法の反応系ｔこおけるＤＬ−Ｇ３Ｐの
代りに５ｍＭ、Ｌ−Ｇ３Ｐを０−３ＯＩｌｌを用いて、
さらｔここれ（こ水を加えて／Ｑｍｌとする。この反応
液に上記実施例Ωで得た酵素液（２２０ｕ／ｍ１３）２
０μ４を添加し、３７℃で７０分間反応を行い、力価の
測定法に従い反応を停止し、Ｓ乙Ｓｎｍで比色定量した
。その結果は第５図に示す通りで、吸光度約／２付近ま
で良好な直線性が得られ、また、対照に用いたＨ２Ｏ２
の結果とも良く一致した。
代りに５ｍＭ、Ｌ−Ｇ３Ｐを０−３ＯＩｌｌを用いて、
さらｔここれ（こ水を加えて／Ｑｍｌとする。この反応
液に上記実施例Ωで得た酵素液（２２０ｕ／ｍ１３）２
０μ４を添加し、３７℃で７０分間反応を行い、力価の
測定法に従い反応を停止し、Ｓ乙Ｓｎｍで比色定量した
。その結果は第５図に示す通りで、吸光度約／２付近ま
で良好な直線性が得られ、また、対照に用いたＨ２Ｏ２
の結果とも良く一致した。
なお、図中〇−〇は５ ｍ Ｍ ｓ Ｌ−ａ−グリセロ
−３−リン酸、リー（９は２．５ｍＭ過酸化水素を用い
た検笥線を示す。
−３−リン酸、リー（９は２．５ｍＭ過酸化水素を用い
た検笥線を示す。
第１図は本発明のＬ−α−ＧＰ−オキシダーゼの至適ｐ
Ｈを示し、第２図は本発明のＬ−α−Ｇ−７７− Ｐ−オキシダーゼの熱安定性を示し、第３図および第９
図は本発明のＬ−α−ＧＰ−オキシダーゼのｐ Ｈ安定
性を示し、第５図は本発明の１．−α−ＧＰ−オキシダ
ーゼの０３Ｐの定量曲線を示し、第４図は本発明のし一
α−ＧＰ−オキシダーゼの可視部の吸収ヌベクトルを示
す。 特許出願人 東洋醸造株式会社 −／ ｇ − 第 ＬＭ ｐ Ｈ 第 ２ 図 ・・ ３図 躬（°Ｃ） ｑ５６７８９：ｃ。
Ｈを示し、第２図は本発明のＬ−α−Ｇ−７７− Ｐ−オキシダーゼの熱安定性を示し、第３図および第９
図は本発明のＬ−α−ＧＰ−オキシダーゼのｐ Ｈ安定
性を示し、第５図は本発明の１．−α−ＧＰ−オキシダ
ーゼの０３Ｐの定量曲線を示し、第４図は本発明のし一
α−ＧＰ−オキシダーゼの可視部の吸収ヌベクトルを示
す。 特許出願人 東洋醸造株式会社 −／ ｇ − 第 ＬＭ ｐ Ｈ 第 ２ 図 ・・ ３図 躬（°Ｃ） ｑ５６７８９：ｃ。
Claims (1)
- （１）下記の理化学的性質を有するし一α−グリセロリ
ン酸オギシダーゼ （ａ）基質特異性：Ｌ−α−グリセロリン酸ｔこ基質特
異性を有する、 （ｂ）酵素作用：Ｌ−α−グリセロリン酸および酸素か
らジヒドロキシアセトン−３−リン酸および過酸化水素
を生ずる反応を触媒する、（ｅ）至適ｐＨニア５〜ｆ、
５ ＋ｊ近、（ｄ）安定ｐＨ：乙〜７付近、 （ｅ）熱安定性二ｌＯ℃付近まで安定である、（ｆ）分
子量ニア≠０００付近（セファデックスＧ−７Ｓｏｔこ
よる値） 、７５０００付近（ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミド電気泳動による値）、（ｆ）ｋｍ値：約３．２ ｍ
Ｍ 。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58145212A JPS6023835B2 (ja) | 1983-08-09 | 1983-08-09 | Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダ−ゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58145212A JPS6023835B2 (ja) | 1983-08-09 | 1983-08-09 | Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダ−ゼ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP53088637A Division JPS6022915B2 (ja) | 1978-07-20 | 1978-07-20 | Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5982086A true JPS5982086A (ja) | 1984-05-11 |
| JPS6023835B2 JPS6023835B2 (ja) | 1985-06-10 |
Family
ID=15379965
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58145212A Expired JPS6023835B2 (ja) | 1983-08-09 | 1983-08-09 | Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダ−ゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6023835B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0255334A2 (en) * | 1986-07-29 | 1988-02-03 | Genzyme Limited | Enzymes having alpha-glycerol-3-phosphate oxidase activity, production and use thereof |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5372892A (en) * | 1976-12-10 | 1978-06-28 | Eastman Kodak Co | Production of alphaa glycerophosphate oxidase |
-
1983
- 1983-08-09 JP JP58145212A patent/JPS6023835B2/ja not_active Expired
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5372892A (en) * | 1976-12-10 | 1978-06-28 | Eastman Kodak Co | Production of alphaa glycerophosphate oxidase |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0255334A2 (en) * | 1986-07-29 | 1988-02-03 | Genzyme Limited | Enzymes having alpha-glycerol-3-phosphate oxidase activity, production and use thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6023835B2 (ja) | 1985-06-10 |
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