JPS6022915B2 - Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダ−ゼの製造法 - Google Patents
Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダ−ゼの製造法Info
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- JPS6022915B2 JPS6022915B2 JP53088637A JP8863778A JPS6022915B2 JP S6022915 B2 JPS6022915 B2 JP S6022915B2 JP 53088637 A JP53088637 A JP 53088637A JP 8863778 A JP8863778 A JP 8863778A JP S6022915 B2 JPS6022915 B2 JP S6022915B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、Ｌ−Ｑ−グリセロリン酸オキシダーゼ（Ｌ−
Ｑ−亀ｙｃｅｒｏ−３一ｐｈｏｓｐｈａに：０２ｏｘｊ
ｄｏｒｅｄ肌ｔａｓｅ；以下Ｌ−Ｑ一〇Ｐーオキシダー
ゼと称す）の製造法に関する。
Ｑ−亀ｙｃｅｒｏ−３一ｐｈｏｓｐｈａに：０２ｏｘｊ
ｄｏｒｅｄ肌ｔａｓｅ；以下Ｌ−Ｑ一〇Ｐーオキシダー
ゼと称す）の製造法に関する。
Ｌ一Ｑ一ＧＰーオキシダーゼは、Ｌ一Ｑーグリセロー３
−リン酸および酸素からジヒドロキシアセトン−３ーリ
ン酸および過酸化水素を生ずる反応を触媒するものであ
って、下記反応式〔１〕Ｌ−Ｇが十０２一ＤＨＡＰ＋日
２０２ 〔１〕（ただし式中、Ｌ−○蛇はＬ
−Ｑ−グリセロ−３ーリン酸を意味し、ＤＨＡＰはヒド
ロキシアセトンー３−リン酸を意味する）で表わされ、
ストレブトコツカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属
、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏ蛇ｃｉｌｌｕｓ）属「
ｏィコノストック（戊ｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ベデイ
オ コッカ ス（ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する
菌が生産することが知られている（特関昭５３−７２８
９２号公報）。
−リン酸および酸素からジヒドロキシアセトン−３ーリ
ン酸および過酸化水素を生ずる反応を触媒するものであ
って、下記反応式〔１〕Ｌ−Ｇが十０２一ＤＨＡＰ＋日
２０２ 〔１〕（ただし式中、Ｌ−○蛇はＬ
−Ｑ−グリセロ−３ーリン酸を意味し、ＤＨＡＰはヒド
ロキシアセトンー３−リン酸を意味する）で表わされ、
ストレブトコツカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属
、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏ蛇ｃｉｌｌｕｓ）属「
ｏィコノストック（戊ｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ベデイ
オ コッカ ス（ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する
菌が生産することが知られている（特関昭５３−７２８
９２号公報）。
しかしながら、公知のＬ−Ｑ−ＧＰーオキシダーゼは、
分子量約１５万で、Ｋｍ値＝２８ｈＭであり、特にＫｍ
値が大きく反応性が悪いものであった。本発明者らは、
種々研究した結果、上記の種々の微生物とその贋を異に
するアヱロコッカス（Ａｅｒｏｃｏｃｃ雌）属に属する
菌、アェロコッカス・ビ リ タ ン ス ＩＦＯ１２
２１９（ Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓｖｊｒｉ池ｎｓＩＦＯ
１２２１９、同ＩＦＯ１２３１７が同様にＬ−Ｑ一ＧＰ
ーオキシダーゼを生産することを見出した。本発明は上
記の知見に基いて完成されたもので、アェロコッカス属
に属するＬ−Ｑ−ＧＰ−オキシダーゼ生産菌を培地に培
養し、その培養物からＬ−Ｑ−ＧＰーオキシダーゼを採
取することを特徴とするＬ一Ｑ一ＧＰーオキシダーゼの
製造法であって、このＬ−Ｑ−ＧＰーオキシダーゼは生
体内物質代謝におけるＬ−Ｑ−グリセロ−３−リン酸を
基質とする酸イ控酵素であるため、血清またはその他の
試料中のＬ−Ｑ−グリセロ−３ーリン酸、グリセリン、
グリセライド、ホスフアチジン酸、その他のリン脂質の
定量、グリセロキナーゼなどの酵素活性の測定などに、
必要に応じて他の酵素や呈色試験との組合せを用いて、
研究用試薬、診断用試薬として有用な用途を有するもの
である。
分子量約１５万で、Ｋｍ値＝２８ｈＭであり、特にＫｍ
値が大きく反応性が悪いものであった。本発明者らは、
種々研究した結果、上記の種々の微生物とその贋を異に
するアヱロコッカス（Ａｅｒｏｃｏｃｃ雌）属に属する
菌、アェロコッカス・ビ リ タ ン ス ＩＦＯ１２
２１９（ Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓｖｊｒｉ池ｎｓＩＦＯ
１２２１９、同ＩＦＯ１２３１７が同様にＬ−Ｑ一ＧＰ
ーオキシダーゼを生産することを見出した。本発明は上
記の知見に基いて完成されたもので、アェロコッカス属
に属するＬ−Ｑ−ＧＰ−オキシダーゼ生産菌を培地に培
養し、その培養物からＬ−Ｑ−ＧＰーオキシダーゼを採
取することを特徴とするＬ一Ｑ一ＧＰーオキシダーゼの
製造法であって、このＬ−Ｑ−ＧＰーオキシダーゼは生
体内物質代謝におけるＬ−Ｑ−グリセロ−３−リン酸を
基質とする酸イ控酵素であるため、血清またはその他の
試料中のＬ−Ｑ−グリセロ−３ーリン酸、グリセリン、
グリセライド、ホスフアチジン酸、その他のリン脂質の
定量、グリセロキナーゼなどの酵素活性の測定などに、
必要に応じて他の酵素や呈色試験との組合せを用いて、
研究用試薬、診断用試薬として有用な用途を有するもの
である。
本発明におけるＬ−Ｑ−ＧＰ−オキシダーゼ生産菌とし
ては、例えばアェロコッカス・ビリタンスＩＦＯ１２２
１９、アエロコツカス・ビリタンス花０１２３１７が挙
げられる。
ては、例えばアェロコッカス・ビリタンスＩＦＯ１２２
１９、アエロコツカス・ビリタンス花０１２３１７が挙
げられる。
本発明を実施するに当っては、Ｌ−Ｑ−ＧＰ−オキシダ
ーゼ生産菌を、酵素を生産する通常の方法で培養する。
ーゼ生産菌を、酵素を生産する通常の方法で培養する。
培養の形態は通常液体培養で行なうのが有利である。培
地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるも
のが広く使用され得る。炭素源としては同化可能な炭素
化合物であればよく、例えばグルコース、シユクロース
、ラクトース、マルトース、フラクトース、糠蜜、グリ
セロール、ピルビン酸などが使用される。窒素源として
は利用可能な窒素化合物であればよく、例えばべプトン
、ポリベプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、カゼ
イン加水分解物などが用いられる。その他、リン酸塩、
炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、力ルシウム、カリウム
、ナトリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類が必要に
応じて使用される。培養温度は菌が発育し、Ｌ−Ｑ−Ｇ
Ｐ−オキシダーゼを生産する範囲内で適宜変更し得るが
、好ましくは２５〜３７０程度がよく、また培養時間は
条件によって異なるが、Ｌ−Ｑ−ＧＰ−オキシダーゼが
最高収量に達する時期を見計って適当な時期に培養を終
了すればよく、通常１０〜４鞘時間程度である。
地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるも
のが広く使用され得る。炭素源としては同化可能な炭素
化合物であればよく、例えばグルコース、シユクロース
、ラクトース、マルトース、フラクトース、糠蜜、グリ
セロール、ピルビン酸などが使用される。窒素源として
は利用可能な窒素化合物であればよく、例えばべプトン
、ポリベプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、カゼ
イン加水分解物などが用いられる。その他、リン酸塩、
炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、力ルシウム、カリウム
、ナトリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類が必要に
応じて使用される。培養温度は菌が発育し、Ｌ−Ｑ−Ｇ
Ｐ−オキシダーゼを生産する範囲内で適宜変更し得るが
、好ましくは２５〜３７０程度がよく、また培養時間は
条件によって異なるが、Ｌ−Ｑ−ＧＰ−オキシダーゼが
最高収量に達する時期を見計って適当な時期に培養を終
了すればよく、通常１０〜４鞘時間程度である。
次いで、このようにして得られた培養物からＬ−Ｑ−Ｇ
Ｐ−オキシダーゼを採取するのであるが、本酵素は主と
して菌体内に存在する。
Ｐ−オキシダーゼを採取するのであるが、本酵素は主と
して菌体内に存在する。
本酵素を採取するには、まず得られた培養物を炉過また
は遠心分離などの手段によりその菌体を採取し、次いで
この菌体を種々の機械的方法、またリゾチームなどの酵
素的方法にて破壊し、また必要に応じてエチレンジアミ
ン四酢酸（ＥＤＴＡ）やトリトン×−１００（Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００：商品名）。アデカトール ＳＯ−１２
０（商品名）などの界面活性剤を添加して本酵素を可溶
化して分離、採取する。さらにこのようにして得られた
Ｌ一Ｑ−ＧＰーオキシダーゼ含有溶液は濃縮するか、ま
たは濃縮することなく可溶性塩類、例えば硫安などを用
いて塩析せしめるが、親水性有機溶媒、例えばメタノー
ル、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの添
加により本酵素を沈澱せしめればよい。次いで、この沈
澱物は水または緩衝液に溶解し、半透膜にて透析せしめ
て低分子量の不純物を除去することができる。また、吸
着剤あるいはゲル炉過剤などによる吸着クロマトグラフ
ィーイオン交換クロマトグラフィーあるいはゲル炉過な
どの手段によりＬ−Ｑ一ＧＰーオキシダーゼを精製する
。さらにこれらの手段により得られた酵素溶液は減圧濃
縮、限外炉過膜濃縮、さらに凍結乾燥などの処理により
精製されたＬ−Ｑ−ＧＰ−オキシダーゼを得る。次に、
本発明のＬ一Ｑ−ＣＰ−オキシダ−ゼの力価の測定法、
その性状などについて述べる。
は遠心分離などの手段によりその菌体を採取し、次いで
この菌体を種々の機械的方法、またリゾチームなどの酵
素的方法にて破壊し、また必要に応じてエチレンジアミ
ン四酢酸（ＥＤＴＡ）やトリトン×−１００（Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００：商品名）。アデカトール ＳＯ−１２
０（商品名）などの界面活性剤を添加して本酵素を可溶
化して分離、採取する。さらにこのようにして得られた
Ｌ一Ｑ−ＧＰーオキシダーゼ含有溶液は濃縮するか、ま
たは濃縮することなく可溶性塩類、例えば硫安などを用
いて塩析せしめるが、親水性有機溶媒、例えばメタノー
ル、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの添
加により本酵素を沈澱せしめればよい。次いで、この沈
澱物は水または緩衝液に溶解し、半透膜にて透析せしめ
て低分子量の不純物を除去することができる。また、吸
着剤あるいはゲル炉過剤などによる吸着クロマトグラフ
ィーイオン交換クロマトグラフィーあるいはゲル炉過な
どの手段によりＬ−Ｑ一ＧＰーオキシダーゼを精製する
。さらにこれらの手段により得られた酵素溶液は減圧濃
縮、限外炉過膜濃縮、さらに凍結乾燥などの処理により
精製されたＬ−Ｑ−ＧＰ−オキシダーゼを得る。次に、
本発明のＬ一Ｑ−ＣＰ−オキシダ−ゼの力価の測定法、
その性状などについて述べる。
‘１｝ 力価の測定法０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０） ０．２の【パーオキシダーゼ（０．５帆／
肌，４５Ｕ／泌） 〇．１
のＺ０．３（Ｗ／Ｖ）４−アミノアンチピリン〇．・泌 ０．１ＭＤＬーグリセロー３ーリン酸 ０．１の【０
．２％（Ｖ／Ｖ）Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン
０．２のＺ蒸留水
０．３の【上記組成の反応液１
．０の‘を小試験管に取り、３分間３７℃で予備加温し
、これに２０仏その酵素液を添加して１び分間反応せし
め、次いでこれに０．２５％（Ｗ／Ｖ）ラウリルベンゼ
ンスルホン酸ナトリウム２．０の‘を加えて反応を停止
し、これを５６則血の波長でその吸光度を測定する。
８．０） ０．２の【パーオキシダーゼ（０．５帆／
肌，４５Ｕ／泌） 〇．１
のＺ０．３（Ｗ／Ｖ）４−アミノアンチピリン〇．・泌 ０．１ＭＤＬーグリセロー３ーリン酸 ０．１の【０
．２％（Ｖ／Ｖ）Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン
０．２のＺ蒸留水
０．３の【上記組成の反応液１
．０の‘を小試験管に取り、３分間３７℃で予備加温し
、これに２０仏その酵素液を添加して１び分間反応せし
め、次いでこれに０．２５％（Ｗ／Ｖ）ラウリルベンゼ
ンスルホン酸ナトリウム２．０の‘を加えて反応を停止
し、これを５６則血の波長でその吸光度を測定する。
酵素活性の算出は次式に従う。酵素灘（Ｕ小）＝（鈴）
Ｘ（輪 （ただし、△Ａは５６５ｍｍ‘こおける１０分間での吸
光値を示す。
Ｘ（輪 （ただし、△Ａは５６５ｍｍ‘こおける１０分間での吸
光値を示す。
）‘２ー 基質特異性：Ｌ−Ｇ斑に基質特異性を有する
。
。
前記の力価の測定法におけるＤＬ‐Ｇ斑の代りに、第１
表に記載の化合物を基質として用いてその相対活性を測
定したもので、その結果は第１表に示す通りである。第
１表 ‘３’ 酵素作用：Ｌ−Ｇ蛇および酸素からＤＨＡＰお
よび過酸化水素を生ずる反応を触媒する。
表に記載の化合物を基質として用いてその相対活性を測
定したもので、その結果は第１表に示す通りである。第
１表 ‘３’ 酵素作用：Ｌ−Ｇ蛇および酸素からＤＨＡＰお
よび過酸化水素を生ずる反応を触媒する。
その酵素反応式は、以下の通りである。
Ｌ‐Ｇが十０２一ＤＨＡＦ十日２０２
‘４）至適ｐＨ
ジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．０〜７
．０）、トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）を
用いて、アェロコツカス・ビリダンス『０１２２１９よ
り得られたＬ一Ｑ−ＧＰーオキシダーゼの至通解を求め
た結果、第１図に示す通りであって、本酵素の至適軸は
７．５〜８．９寸近と認められる。
．０）、トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）を
用いて、アェロコツカス・ビリダンス『０１２２１９よ
り得られたＬ一Ｑ−ＧＰーオキシダーゼの至通解を求め
た結果、第１図に示す通りであって、本酵素の至適軸は
７．５〜８．９寸近と認められる。
‘５１熱安定性
アエロコツカス・ビリダンスＩＦＯ１２２１９より得ら
れたＬ−Ｑ−ＧＰ−オキシダーゼを０．１Ｍジメチルグ
ルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し（０
．５Ｕ／の【）、これを０〜７０ｑｏで１０分間加熱し
た後、その溶液中の残存活性を測定した。
れたＬ−Ｑ−ＧＰ−オキシダーゼを０．１Ｍジメチルグ
ルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し（０
．５Ｕ／の【）、これを０〜７０ｑｏで１０分間加熱し
た後、その溶液中の残存活性を測定した。
その結果は第２図に示す通りで４ぴ０付近まで安定であ
る。【６）ｐＨ安定性 アエロコツカス・ビリダンスＩＦＯ１２２１９より得ら
れたＬ−Ｑ一ＧＰーオキシダーゼを、０．１Ｍジメチル
グルタル酸一ＮａＯＨ緩衝液（冊５．０〜７．０）、ト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）に溶解し（０
．５Ｕ／の【）、４５００で１０分間加溢した後、それ
ぞれの残存活性を測定した。
る。【６）ｐＨ安定性 アエロコツカス・ビリダンスＩＦＯ１２２１９より得ら
れたＬ−Ｑ一ＧＰーオキシダーゼを、０．１Ｍジメチル
グルタル酸一ＮａＯＨ緩衝液（冊５．０〜７．０）、ト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）に溶解し（０
．５Ｕ／の【）、４５００で１０分間加溢した後、それ
ぞれの残存活性を測定した。
その結果は、第３図に示す通りである。また上記緩衝液
を用い、酵素濃度０．５ｍ９／机とし、３０ｏｏで２餌
寿間処理した場合の残存活性を測定した結果、第４図に
示す通りで、舟６〜９付近で安定であった。
を用い、酵素濃度０．５ｍ９／机とし、３０ｏｏで２餌
寿間処理した場合の残存活性を測定した結果、第４図に
示す通りで、舟６〜９付近で安定であった。
【７１分子量：セフアデツクスＧ−１５０を用いるゲル
炉適法において分子量７４０００付近であり、ＳＤＳー
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において分子量７５
００の廿近である。
炉適法において分子量７４０００付近であり、ＳＤＳー
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において分子量７５
００の廿近である。
｛８１ Ｋｍ値：約３．２ｈＭ付近である。
このＫｍ値の測定方法は、公知の方法に準じて行なった
もので、詳しくは以下の通りでる。
もので、詳しくは以下の通りでる。
０．２Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．
２泌パーオキシダーゼ（４５Ｕ／の【） ０．
１Ｍ０．３（Ｗ／Ｖ）％４ーアミノアンチピリン０．１
の【０．２（Ｗ／Ｖ）％Ｎ，Ｎージメチルアニリソ〇．
２のＺＬ一Ｑ一ＧＰ−オキシダーゼ（０．０５Ｕ／の‘
）〇．・泌蒸留水 ０
．２泌合計 ０．９私〔反応停止液〕 ０．２５（Ｗ／Ｖ）％ラウリルベンゼンスルホン酸ナト
リウム ２．０泌〔操
作〕上記反応液０．９のＺを小試験管に取り、３７０に
加溢する。
２泌パーオキシダーゼ（４５Ｕ／の【） ０．
１Ｍ０．３（Ｗ／Ｖ）％４ーアミノアンチピリン０．１
の【０．２（Ｗ／Ｖ）％Ｎ，Ｎージメチルアニリソ〇．
２のＺＬ一Ｑ一ＧＰ−オキシダーゼ（０．０５Ｕ／の‘
）〇．・泌蒸留水 ０
．２泌合計 ０．９私〔反応停止液〕 ０．２５（Ｗ／Ｖ）％ラウリルベンゼンスルホン酸ナト
リウム ２．０泌〔操
作〕上記反応液０．９のＺを小試験管に取り、３７０に
加溢する。
これに０．靴Ｍ，０．７５ｍＭ，１．仇ｈＭ，３，帆，
５，帆，７，帆，他Ｍ，２皿ＭのＬ−Ｇ班溶液０．１の
‘を添加して反応を開始し、３７℃で正確に１０分間反
応した後２．０の‘の反応停止液を添加し反応を停止し
た。次いで反応終了液を、波長５６別皿で吸光度測定す
る。このときの最終基質濃度と酵素活性の関係をＬｉｎ
ｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋらの方法により算出する。■
金属イオン、ＥＤＴＡおよびＰＣＭＢ（ｐークロロマ
ーキュリー安息香酸）添加における影響：第２表に示す
通りである。
５，帆，７，帆，他Ｍ，２皿ＭのＬ−Ｇ班溶液０．１の
‘を添加して反応を開始し、３７℃で正確に１０分間反
応した後２．０の‘の反応停止液を添加し反応を停止し
た。次いで反応終了液を、波長５６別皿で吸光度測定す
る。このときの最終基質濃度と酵素活性の関係をＬｉｎ
ｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋらの方法により算出する。■
金属イオン、ＥＤＴＡおよびＰＣＭＢ（ｐークロロマ
ーキュリー安息香酸）添加における影響：第２表に示す
通りである。
第２表
■ リン酸化糖添加における影響：第３表に示す通りで
ある。
ある。
第 ３ 表（Ｌ−Ｇ３Ｐ濃度：１．０ｍＭ■ 界面活性
剤添加における影響：第４表に示す通りである。
剤添加における影響：第４表に示す通りである。
第４
さらに、アエロコツカス・ビリダンス
ＦＯ１２３１７より得られたＬ−Ｑ−ＧＰーオキシダー
ゼも同様の性状を有するものであった。
ゼも同様の性状を有するものであった。
次に実施例を挙げて本発明を具体的に述べるが、本発明
はこれによって何んら限定されるものではない。
はこれによって何んら限定されるものではない。
実施例 １
グリセリン１．０％、ラクトース２．０％、ポリベプト
ン１．０％、酵母エキス１．０％、肉エキス０．５％、
ＫＨ２Ｐ０４０．１％、Ｋ２ＨＰ０４０．１％、ＮａＣ
ＩＯ．２％、ＭｇＳ０４・７４００．０５％の組成より
なる培地（ｐＨ７．０）を３０そ客のジャーフアレメー
タに入れ、１０夕のシリコンＫＳ−６６（消泡剤、商品
名、信越化学Ｋ．Ｋ．製）を添加後１２０ｑ０，２０分
間滅菌する。
ン１．０％、酵母エキス１．０％、肉エキス０．５％、
ＫＨ２Ｐ０４０．１％、Ｋ２ＨＰ０４０．１％、ＮａＣ
ＩＯ．２％、ＭｇＳ０４・７４００．０５％の組成より
なる培地（ｐＨ７．０）を３０そ客のジャーフアレメー
タに入れ、１０夕のシリコンＫＳ−６６（消泡剤、商品
名、信越化学Ｋ．Ｋ．製）を添加後１２０ｑ０，２０分
間滅菌する。
袷後１畑時間予備培養したアェロコツカス・ビリダンス
ＩＦＯ−１２２１３『０一１２３１７をそれぞれ、２０
０の【桶菌し、３０ｑｏで１即時間培養し、培養後、培
養液を５，００仇ｐｍで１０分間遠心して集菌し、得ら
れた菌体はさらに、５００叫の１仇ｈＭリン酸塩緩衝液
（ｐＨ７．０）で洗浄後、リゾチーム溶液（０．４雌／
舷，１０のＭリン酸塩緩衝液）４００羽中に懸濁し、３
７０で６■ご間作用せしめて菌体を破壊し、酵素を可溶
化した後、５，００Ｍ司転で１８分間遠心分離して酵素
液を得る。この際のＬ一Ｑ−ＧＰーオキシダーゼ活性は
次に示す通りであった。菌 株 酵素活性（ｕ／
の【培養液）アエロコツカス・ビリタンスｍＯ−１２２
１９ ０．８０アエロコツカス・ビ
リタンスｍＯ−１２３１７ ０．７８
実施例 ２アェロコツカス・ビリダンスｍ○−１２２１
９を実施例１に記載方法と同様にして培養、得た酵素液
４２０の‘（１６，００肌）に硫安溶液を用いて硫安濃
度０．２４〜０．４８飽和で沈澱した画分を遠心分離に
て集め、その沈澱物をｌｏｗＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）５０泌に溶解し、これを１仇ｈＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に対してセルロースアセテート透析チーフを
用いて透析して、精製したＬ−Ｑ−ＧＰーオキシダーゼ
を得た。
ＩＦＯ−１２２１３『０一１２３１７をそれぞれ、２０
０の【桶菌し、３０ｑｏで１即時間培養し、培養後、培
養液を５，００仇ｐｍで１０分間遠心して集菌し、得ら
れた菌体はさらに、５００叫の１仇ｈＭリン酸塩緩衝液
（ｐＨ７．０）で洗浄後、リゾチーム溶液（０．４雌／
舷，１０のＭリン酸塩緩衝液）４００羽中に懸濁し、３
７０で６■ご間作用せしめて菌体を破壊し、酵素を可溶
化した後、５，００Ｍ司転で１８分間遠心分離して酵素
液を得る。この際のＬ一Ｑ−ＧＰーオキシダーゼ活性は
次に示す通りであった。菌 株 酵素活性（ｕ／
の【培養液）アエロコツカス・ビリタンスｍＯ−１２２
１９ ０．８０アエロコツカス・ビ
リタンスｍＯ−１２３１７ ０．７８
実施例 ２アェロコツカス・ビリダンスｍ○−１２２１
９を実施例１に記載方法と同様にして培養、得た酵素液
４２０の‘（１６，００肌）に硫安溶液を用いて硫安濃
度０．２４〜０．４８飽和で沈澱した画分を遠心分離に
て集め、その沈澱物をｌｏｗＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）５０泌に溶解し、これを１仇ｈＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に対してセルロースアセテート透析チーフを
用いて透析して、精製したＬ−Ｑ−ＧＰーオキシダーゼ
を得た。
なお、その回収率は８３．６％であつた。実施例３：Ｇ
班の定量 上記力価の測定法の反応系におけるＤＬ−Ｇ班の代りに
耳ｈＭ，Ｌ−○がを０〜５０ｒそを用いて、さらにこれ
に水を加えて１０の‘とする。
班の定量 上記力価の測定法の反応系におけるＤＬ−Ｇ班の代りに
耳ｈＭ，Ｌ−○がを０〜５０ｒそを用いて、さらにこれ
に水を加えて１０の‘とする。
この反応液に上記実施例２で得た酵素液（２２肌／泌）
２０ムそを添加し、３７０で１０分間反応を行い、力価
の測定法に従い反応を停止し、５６別ｍで比色定量した
。その結果は第５図に示す通りで、吸光度約１．２付近
まで良好な直線性が得られ、また、対照に用いた日２０
２の結果とも良く一致した。なお図中○‐０は軌Ｍ．Ｌ
−ば−グリセロー３ーリン酸、●−●は２．前Ｍ過酸化
水素を用いた検量線を示す。
２０ムそを添加し、３７０で１０分間反応を行い、力価
の測定法に従い反応を停止し、５６別ｍで比色定量した
。その結果は第５図に示す通りで、吸光度約１．２付近
まで良好な直線性が得られ、また、対照に用いた日２０
２の結果とも良く一致した。なお図中○‐０は軌Ｍ．Ｌ
−ば−グリセロー３ーリン酸、●−●は２．前Ｍ過酸化
水素を用いた検量線を示す。
第１図は本発明のＬ−Ｑ−ＧＰ−オキシダーゼの至適ｐ
Ｈを示し、第２図は本発明のＬ一Ｑ−ＧＰ−オキシダー
ゼの熱安定性を示し、第３図および第４図は本発明のＬ
−Ｑ一ＧＰ−オキシダーゼのｐＨ安定性を示し、第５図
は本発明のＬ−Ｑ−ＧＰ−オキシダーゼのＧ解の定量曲
線を示すものである。 第１図 第２図 第３図 第４図 第５図
Ｈを示し、第２図は本発明のＬ一Ｑ−ＧＰ−オキシダー
ゼの熱安定性を示し、第３図および第４図は本発明のＬ
−Ｑ一ＧＰ−オキシダーゼのｐＨ安定性を示し、第５図
は本発明のＬ−Ｑ−ＧＰ−オキシダーゼのＧ解の定量曲
線を示すものである。 第１図 第２図 第３図 第４図 第５図
Claims (1)
- １ アエロコツカス属に属するＬ−α−グリセロリン酸
オキシダーゼ生産菌を培地に培養し、その培養物からＬ
−α−グリセロリン酸オキシダーゼを採取することを特
徴とするＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼの製造法
。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53088637A JPS6022915B2 (ja) | 1978-07-20 | 1978-07-20 | Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダ−ゼの製造法 |
| GB7924637A GB2030149B (en) | 1978-07-20 | 1979-07-16 | Process for l- -glycerophosphate oxidase |
| DK301679A DK147183C (da) | 1978-07-20 | 1979-07-18 | Fremgangsmaade til fremstilling af l-alfa-glycerophosphatoxidase |
| FR7918591A FR2431534A1 (fr) | 1978-07-20 | 1979-07-18 | Procede pour la production de l'a-glycerophosphate oxydase |
| CA332,153A CA1125205A (en) | 1978-07-20 | 1979-07-19 | PROCESS FOR PRODUCTION OF L-.alpha.-GLYCEROPHOSPHATE OXIDASE |
| IT24490/79A IT1122216B (it) | 1978-07-20 | 1979-07-19 | Procedimento per la produzione di l-alfa-glicerofosfato ossidasi |
| DE2929277A DE2929277C2 (de) | 1978-07-20 | 1979-07-19 | Verfahren zur Herstellung von L-α-Glycerophosphatoxidase |
| US06/059,583 US4275161A (en) | 1978-07-20 | 1979-07-20 | Process for the manufacture of L-α-glycerophosphate oxidase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53088637A JPS6022915B2 (ja) | 1978-07-20 | 1978-07-20 | Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダ−ゼの製造法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58145212A Division JPS6023835B2 (ja) | 1983-08-09 | 1983-08-09 | Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダ−ゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5515746A JPS5515746A (en) | 1980-02-04 |
| JPS6022915B2 true JPS6022915B2 (ja) | 1985-06-04 |
Family
ID=13948321
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP53088637A Expired JPS6022915B2 (ja) | 1978-07-20 | 1978-07-20 | Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダ−ゼの製造法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4275161A (ja) |
| JP (1) | JPS6022915B2 (ja) |
| CA (1) | CA1125205A (ja) |
| DE (1) | DE2929277C2 (ja) |
| DK (1) | DK147183C (ja) |
| FR (1) | FR2431534A1 (ja) |
| GB (1) | GB2030149B (ja) |
| IT (1) | IT1122216B (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5886083A (ja) * | 1981-11-12 | 1983-05-23 | Wako Pure Chem Ind Ltd | グリセロ−ル−３−リン酸オキシダ−ゼの安定化剤 |
| JPS59140900A (ja) * | 1983-01-28 | 1984-08-13 | Toyo Jozo Co Ltd | 新規な酵素的高感度測定法 |
| GB8618469D0 (en) * | 1986-07-29 | 1986-09-03 | Genzyme Biochemicals Ltd | Enzymes |
| GB2213822B (en) * | 1987-12-15 | 1991-12-18 | Toyo Jozo Kk | Dna having genetic information of l-´-glycerophosphate oxidase and application thereof |
| UA72065C2 (en) * | 2004-09-10 | 2005-01-17 | Viridans Ltd Liability Company | Strain aerococcus viridans 167k imb b-7069 with antibacterial activity and "viabac" preparation comprising this strain |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1095447A (en) * | 1976-12-10 | 1981-02-10 | Prakash S. Masurekar | Process for the production of a-glycero-phosphate oxidase |
| US4166005A (en) * | 1976-12-10 | 1979-08-28 | Eastman Kodak Company | Process for the production of α-glycerophosphate oxidase |
-
1978
- 1978-07-20 JP JP53088637A patent/JPS6022915B2/ja not_active Expired
-
1979
- 1979-07-16 GB GB7924637A patent/GB2030149B/en not_active Expired
- 1979-07-18 DK DK301679A patent/DK147183C/da active
- 1979-07-18 FR FR7918591A patent/FR2431534A1/fr active Granted
- 1979-07-19 IT IT24490/79A patent/IT1122216B/it active
- 1979-07-19 DE DE2929277A patent/DE2929277C2/de not_active Expired
- 1979-07-19 CA CA332,153A patent/CA1125205A/en not_active Expired
- 1979-07-20 US US06/059,583 patent/US4275161A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK147183B (da) | 1984-05-07 |
| GB2030149B (en) | 1982-07-21 |
| CA1125205A (en) | 1982-06-08 |
| DK301679A (da) | 1980-01-21 |
| US4275161A (en) | 1981-06-23 |
| IT7924490A0 (it) | 1979-07-19 |
| FR2431534B1 (ja) | 1983-07-08 |
| GB2030149A (en) | 1980-04-02 |
| DK147183C (da) | 1984-10-22 |
| DE2929277A1 (de) | 1980-01-31 |
| FR2431534A1 (fr) | 1980-02-15 |
| JPS5515746A (en) | 1980-02-04 |
| DE2929277C2 (de) | 1986-11-06 |
| IT1122216B (it) | 1986-04-23 |
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