JPS5814198B2 - Ｎａｄｈ−ペルオキシダ−ゼ、その製法及びこれを用いるｈ↓２ｏ↓２の測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、公知のＮＡＤＨ−ベルオキンダーゼとは種々
の特性において異なる微生物からの新規ＮＡＤＨ−ベル
オキシダーゼ、その製法並びに、殊に特異的なオキシダ
ーゼの存在下での複合反応でＨ２０２を測定するために
この新規酵素を使用することに関する。

多くの重要な物質例えばグルコース、尿酸、コレステリ
ン、アミノ酸、アルコール等は、その反応でＨ２０２を
生じるオキシダーゼを用いて酵素的に測定される。

このＨ２Ｏ２は、引続き種々の方法で例えばクロモゲン
の酸化、カタラーゼを用いるアルコールの酸化（ハンツ
の反応； Ｈａｎｔｚ’ｓ ｃｈｅＲｅａｋｔｉｏｎ
）、アルデヒドーデヒドロゲナーゼを用いるアルコール
の酸化等により測定される。

これらのすべての指示反応はいくつかの欠点を有する。

例えばクロモゲンの過酸化は薬剤により阻害され、ハン
ツの反応の使用下における検査は非常に長い反応時間を
必要とし、アルデヒドーデヒドロゲナーゼ上での反応実
施は煩雑であり、かつこの酵素は非常に不安定であるこ
と等である。

従って、これらの欠点を有せず、殊に特異的オキシダ？
ゼとの組合せの際にも使用できるＨ２０の簡単な測定法
が必要である。

Ｈ２０２を形成する特異的オキシダーゼ反応を酵素的測
定に有利に使用されるＮＡＤＨ一反応と組合わせること
は理論的には可能である。

ここでＮＡＤＨは還元型のニコチンアミドーアデニンー
ジヌクレオチドを意味する。

反応：１で触媒作用をするＮＡＤＨ−ベルオキシダーゼ
（ＮＡＤＨ−ＰＯＤ）は既に公知であるＣＡＢＢ５５巻
４１５頁（１９５５年）、ＪＢＣ２２５巻５５７頁（１
９５７年）参照〕。

ＥＣ一屋１．１１．１．１を有するこの酵素は、ストレ
プトコツカス・ファエカリス（ Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｎｓｆａｅｃａｌｉｓ ）１ ０ Ｃ Ｉ及びラク
トハシルス・カセイ（ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｎｓ
ｃａｓｅｉ ）中に発見され、最適ｐＨ値５、４、Ｈ２
０２に対するミハエリス定数？Ｍ２Ｘ１０−’及びＮＡ
ＤＨに対するミハエリス定数１．４Ｘ１０−’を有する
ことが明らかである。

多くのオキシダーゼにとっては、アルカリ性領域のｐＨ
値のみが好適であるが、この公知ＮＡＤＨ−ベルオキシ
ダーゼはｐＨ７．０で既に実際に不活性である［ Ａｒ
ｃｈ． Ｂ ｉｏｃｈｅｍ ． Ｂ ｉｏｐｈｙｓ．１
１１巻５３５頁（１９６５年）参照〕ので、しかも、不
適当なミー・工９ス定数に基づき、この公知ＮＡＤＨ−
ベルオキシダーゼは、実際に特異的なオキシダーゼとの
複合反応でのＨ２０一測定のためには不適当である。

ところで、この公知ＮＡＤＨ−ベルオキシダーゼとは明
らかに異なり、これらの欠点を有せず、酵素的Ｈ２０２
一測定の際に殊に特異的オキシダー？との複合反応で使
用するのに好適なもう１２のＮＡＤＨ−ベルオキシダー
ゼを発見した。

従って、本発明の目的は、酢酸カリウム０．１モルを含
有する０．２Ｍ｝リスー（ヒドロキシメチル）一アミノ
メタン緩衝液（ ｐＨ ６．０ ）中、２５℃で測定し
たＨ２０に対するミハエ９ス定数ＫＭが２．８×１ ０
−’ Ｍで、ＮＡＤＨに対するそれが１．７×１０−
’Ｍであり、安定ｐＨ一値幅４．５〜９，０、最適ｐＨ
一値６〜７を有し、ＮＡＤＨをＨ２０で酸化してＮＡＤ
とＨ２０にする反応に作用するＮＡＤＨ−ベルオキシダ
ーゼである。

このＮＡＤＨ−ベルオキシダーゼは、ｐｎ ６〜７で測
定の際に、５０℃で２時間損失がなかった。

この新規酵素はグリセリン／水（１：１）中で安定であ
り、ｐｎ６．ｏで１５分間加熱する際の温度安定性は５
０℃までで１００％、６０℃までで６５％、６５℃まで
で１５．５％であり、７０℃までで１％以下である。

作用至適温度は室温であんｐＨ ５．０ ， ５．４
， ６．０ ，７．０ ， ７．５ ， ８．０及び９
．５における酵素活性はそれぞれ６７％，９８％，１０
０％，８８％，５６％，３７％及び１９％である。

その活性化剤は、低級の有機カルボン酸塩、例えば酢酸
塩、酪酸塩、コハク酸塩、蓚酸塩、ギ酸塩、乳酸塩であ
り硫酸塩及び塩化物も使用でき、その作用効果は前記の
順序で低下する。

？の阻害剤は重金属であり、その分子量は５９０００で
ある（ディスクー電気泳動による）。

この新規酵素は、その低いＫＭ値に基づき、Ｈ２０２一
測定にとって他の公知酵素よりも著るしく好適である。

ＫＭが大きくなるに従がい、測定時にＨ２０一濃度も常
に高くなければならない。

しかしながら、Ｈ２０一濃度が高くなると、試料中に通
例存在するカタラーゼの影響も大きくなる。

しかしながら、カタラーゼとＨ２０との競合によシ、結
果は正しくなる。

本発明の新規酵素は、公知酵素と同様にフラポプロテイ
ンであるので黄色である。

グリセリン／水１：１中で、この酵素は、＋４℃で数ケ
月安定である。

ＮＡＤＰＨを有して、ＮＡＤＨに比べて約８％の反応速
度を有する公知酵素とは反対に、ＮＡＤＰＨはＮＡＤＨ
と代替できない。

この酵素は、トリス緩衝液中、アセテートー又はグロピ
オネートーイオンの存在で、最適ｐＨ値６．０を有し、
酢酸ナトリウム緩衝液中、ｐＨ５．４（従って、公知酵
素の最適条件下）での活性は、約２０％低い。

ｐＨ９．０ではこの活性はなお最適の約２０％である。

本発明により、この新規酵素は、ストレプトコツカス・
ファエカリス（ Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆａｅ
ｃａｌｉｓ） ＡＴ Ｃ Ｃ ８ ０ ４ ３から得ら
れる。

その取得は、該微生物の可溶化によるか又は界面活性剤
での処理により、酵素を遊離させ、次いで、これを溶液
から単離させることにより行なう。

好適な可溶化法は、例えば、超音波作用、ガラスパール
を用いる磨砕、高い剪断力の作用等である。

これらのすべての可溶化法は公知であり、微生物にとっ
て慣用のことである。

界面活性剤での処理は有利に、２５〜６０℃の温度で行
なう。

約４．５〜６．０の弱酸性ｐＨ値で４５〜５５℃での処
理が有利である。

一般に、１５〜３０分で充分でアシ、その作用時間は、
欠点なしに著るしく超過することができる。

例えば５５℃で３時間の反応時間でもなお非常に良好な
収率が得られる。

この場合、機械的可溶化法の際よりも少ない不純物が溶
解し従って当初から純粋な酵素が得られるので、界面活
性剤での処理が有利である。

界面活性剤としては非イオン性のものが有利である。

特に、ポリエ％レングリコールエステル例えば、アルキ
ルアリールポリエ％レングリコールエステル例えばトリ
トン（ Ｔｒｉｔｏｎ ） Ｘ−１ ０ ０が有利であ
る。

この可溶化法の特別な利点は、障害性のＮＡＤＨ−オキ
シダーゼの含分が特に僅かであることにもある。

ここの酵素を得るために、例えば遠心分離により溶液か
ら不溶物を除き、得られる澄明な上澄液からこの酵素を
含有する蛋白質フラクションを沈殿させることができる
。

沈殿のために、生化学に慣用の手段例えば硫酸アルミニ
ウムを用いる塩析、有機溶剤例えばアセトン又はメタノ
ールによる沈殿、ポリイオン例えばポリエ％レンイミン
等を用いる沈殿が好適である。

粗製酵素の精製は例えば吸着剤例えばカルボキシメ％ル
セルロース網状化デキストラン、イオン交換体等を用い
るクロマトグラフイにより行なうことができる。

更に、この酵素から、酸処理によ如付随物質を除くこと
もできる。

この酸処理は、４．２〜４．８のＰＨ一値で、１０〜２
５分間行なうのが有利である。

従って、有利な精製法は、酵素水溶液をｐＨ４．２〜４
．８に調節し、不溶分を分離除去し、上澄液中に存在す
る酵素をポリエ％レンイミンで分別することによりなる
。

この取得法のすべての工程を緩衝液中で実施することが
理解される。

この際特に好適な緩衝液は、燐酸塩緩衝液、トリスー緩
衝液及び酢酸塩緩衝液である。

しかしながら、他の慣用の緩衝液例えばグリシン緩衝液
、ホウ酸塩緩衝液等も使用可能である。

本発明のもう１つの目的は、この新規ＮＡＤＨ−ベルオ
キシダーゼを、特異的オキシダーゼを用いる単純又は複
合一反応でのＨ２０２の測定に使用することである。

この測定は、６．０〜９．０のｐＨ一値で行なうのが有
利である。

こうして、特異的オキシダーゼ反応をＮＡＤＨ−ＮＡＤ
一反応の測定と連結することができる。

最後の反応は、公知のように、ＮＡＤＨ一濃度変化に比
例する吸光度変化の測定により、特に簡単に追跡するこ
とができる。

本発明における特異的オキシダーゼとは、特定の基質及
び酸素と反応して、Ｈ２０２を形成させる酸素である。

本発明における特異的オキシダーゼとしては、グリコー
スオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミ
ノ酸オキシダーゼ、コレステリンオキシダーゼ、アルコ
ールオキシダーゼ、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダ
ーゼが有利に使用される。

これに応じて、複合反応でグルコース、Ｄ一アミノ酸例
えばＤ−アラ二ン、Ｌ−アミノ酸例えばＬ一ロイシン、
コレステリン及びコレステリンエステル、低級アルコー
ル、尿酸、キサンチン及びヒポキサンチンが測定できる
。

単純反応では、Ｈ２０２そのもの（即ちオキシダーゼ系
の存在における中間生成物として生じるものだけでない
）を測定することができる。

本発明のＮＡＤＨ−ベルオキシダーゼの測定は、次の試
験により有利に実施できる： トリスー酢酸カリウム緩衝液 （トリス０．２Ｍ＋酢酸カリウム０．１５Ｍ）〔トリス
２．４２ｇ＋酢酸カリウム１．４１をＨ２０？０ｍｌ中
に溶かし、２Ｎ酢酸でｐＨ６．０に調節しＨ２Ｏを加え
て１００ｍｌとした）２．６８ｍｌＮＡＤＨ（６ｍＭ）
［ＮＡＤＨ５７ｍｇをＨ２０ １ｍｌ中に溶かした〕
０．２０１ｒｌｌ 試料ＮＡＩ）Ｈ−ベルオキシダーゼ ０．０２ｍｌを
混合し、３６５ｎｍＸｄ＝１ｃｒｒ１、２５℃で、前変
化（ Ｖｏｒｌａｕｆ ）△Ｅ ／ｙｍｒを記録する。

この前変化（吸光度減少）はＮＡＤＨ−オキシダーゼの
計算のだめに役立つ。

Ｈ２０２〔４０ｍモル（ ３０％Ｈ２００．０５ｄをＨ
２０ＩＯｒＩ１ｌで稀釈）１ ０．１０ｍ
／を混合し、吸光度変化／一を測定する（△Ｅ／−＋ｍ
ＬＮＡＤＨ−ベルオキシダーゼー活性の計算のために、
ＮＡＤＨ−オキシダーゼー前変化の△Ｅ／−ｉｎを引く
。

トリスー酢酸塩一緩衝液を使用するのが有利であるが、
ＮＡＤＨ−ＰＯＤの使用は、この緩衝液のみに限定され
ない。

ＮＡＤＨ−ＰＯＤを用いるＨ２０２の測定は、特に、酢
酸ナトリウム、ピベラジン、燐酸カリウム、二燐酸カリ
ウム、ホウ酸塩／クエン酸塩、グ９シルーグリシン、ト
リエタノールアミン・ＨＣｌ又はＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−
ヒドロキシエチルピペラジンーＮ一エタンースルホン酸
）を緩衝液系として用いて実施することができる。

相応する方法で、Ｈ２０２一測定を実施することもでき
、この際ＮＡＤＨ−ＰＯＤを過剰に加え、吸光度変化に
応用するＨ２０２一量を測定する。

この測定は最終点法で、又は動的に即ち、特定の短時間
内の吸光度変化を測定することによシ行なう？とができ
る。

前記のトリスー酢酸カリウム緩衝液中、ＰＨ８−ＯＲび
前記測定条件下におけるＨ２０２一測定の詳細及び時間
経過を添付図面に示す。

第１図は、横軸にＨ２０一量を示し、縦軸に吸光度変化
を示す検量線図であり、第２図は、２５℃における時間
と吸光度減少の関係を示す図である。

最初に、Ｈ２０２０．４μＭｏｌを添加した。これら２
つの図面は、本発明による酵素が定量的なＨ２０２一測
定に使用できることを示している。

次に実施例につき本発明を説明する。

例ｌ 酵素の取得及び精製 ストレプトコツカス・ファエカリスＡＴＣＣ８０４３を
０．０２Ｍ燐酸カリウム（ ｐＨ ５．０ ）中のトリ
トン（ＴＲＩＴＯＮ）Ｘ−１００の１％溶液と共に３０
分間５５゛℃に加熱する。

次いで、４℃に冷却し、不溶分を分離除去する。

活性１．７７Ｕ／一及び特異活性０．７７Ｕ／■を有す
る水溶液が得られる。

得られた溶液に、全活性が沈殿中に認められるまで硫酸
アンモニウムを加える。

沈殿を涙過し、燐酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）中に入れ、
モレキュラシーブを通して脱塩する。

こうして得た酵素溶液を直接又は予め濃縮の後に凍結菟
燥によシ又は３．０Ｍ硫酸アンモニウム液（ｐＨ約７）
中に入れて使用することができる。

出発溶液を、予め酵素の分離をすることなく、硫酸アン
モニウム沈殿により次のように更に精製するのが有利で
ある： 溶液を酢酸でｐＨ４．４に調節し、２０分間放置？る。

次いで、不溶分を沢別する。上澄液をポリエチレンイミ
ン溶液に少量宛加え、その都度生じる不溶分を沢過する
。

酵素含有フラクションを改めて緩衝液中に溶かし、ジエ
チルアミノエチルセルロースを通すクロマトグラフイに
かける。

引続き、網状化されたデキストランを通して脱塩する，
こうして、約４５Ｕ／７ｖの製品が得られる。

例２ ＮＡＤＨ−ＰＯＤの活性と試験に使用した緩衝液との関
係 ０．１Ｍ緩衝液（Ｈ２０１ｍＭ，ＮＡＤＨ０．４ｍＭ）
中で測定。

例３ 試験系でのｐｎ値がＮＡＤＨ−ＰＯＤの活性に及ぼす影
響： ０．１Ｍ｝リスー酢酸塩緩衝液（Ｈ２０２１ｍＭ及びＮ
ＡＤＨ０．４ｍＭ）中で測定 例４ ウリカーゼを用いる尿酸測定 次式に応じて測定を行なう： ウリカーゼ、本発明によるＮＡＤＨ−ＰＯＤ及びＮＡＤ
Ｈを、それぞれ酢酸カリウム０．１５Ｍを含有する種々
のｐＨ値の０．２Ｍ｝！Ｊスー酢酸塩緩衝液中に溶かす
。

次いで、尿酸０．２μモル食有水溶液を最初に添加した
。

次の結果が得られた：スピルギルス・フラプスからのウ
リカーゼＩＵ，試験料３−、２５℃、３６５ｎｍ） で
の尿酸測定精度（４）（ｐＨ８で５分反応時間の際の値
＝１００係に比べて） 例５ グリコースオキシダーゼ（ＣＯＤ）を用いるグリコース
測定 次式に従って測定する： 測定は、ｐＨ ７．０で、ＧＯＤ２１０Ｕ．ＮＡＤＨ−
ＰＯＤ０．２Ｕ及びムタロターゼ６０Ｕの使用下に実施
した。

尿中のグルコースの測定は、公知法ＣＯＤ−ペリドＲ［
ＧＯＤ−Ｐｅｒｉｄ Ｒ ：西ドイツ特許第１６４８
８４０号明細書、及びＨ．Ｕ．ベルクマイヤーの前記文
献３版２巻、１２５７頁（１９７４年）参照〕で得られ
た値の１００％が得られた。

例６ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｄ−ＡＯＤ）を用いるＤ−
アラニンの測定 測定は次式により行なう： 測定は、ｐＨ８．５で、ＮＡＤＨ−ＰＯＤ０．２５Ｕ，
Ｄ−ＡＯＤ２０Ｕ，ラクテートデヒドロゲナーゼ５Ｕの
使用下に、２５℃で実施した。

２５℃で２０分恒温保持の際に、測定精度は１００％で
あった。

参照方法：Ｈ．Ｕ．ベルグマイヤーの前記文献３版■巻
１７３１頁（１９７４年）のＭ． グラスル（Ｇｒａβｌ）の方法 例７ クロタルス・テリフイクス（ Ｃｒｏｔａｌｕｓｔｅｒ
ｒｉｆｉｃｕｓ ）からのし−アミノ酸オキシターゼ（
Ｌ−ＡＯＤ）を用いるし一ロイシンの測定測定は次式に
従って行なう： ｐＨ７．５〜８．０で、トリスーアセテートー緩衝液（
０．２Ｍ）（これは酢酸塩０．１５Ｍを含有）中で実施
した。

試験時に本発明によるＮＡＤＨ−ＰＯＤ０．２Ｕ及びＬ
−ＡＯＤ０．７Ｕの添加の際に、測定精度は約１００％
であった。

Ｌ一口イシン０，２μモルの濃度の際に、反応時間は約
２０分であった。

例８ コレステリンオキシダーゼ及びコレステリンエステラー
ゼを用いるコレステリンエステルー測定測定は次式に従
って行なう： 慣用のコレステリンー標準液及び血清を使用した。

コレステリン０．２μモルを有する慣用の標準液を用い
ての測定精度は、６．０〜９．０ＯｐＨ値、９〜１２分
で９８〜１０２％であった。

試験量３一中で、ＮＡＤＨ−ＰＯＤ０．ＩＵ，コレステ
リンオキシダーゼ２Ｕを使用した。

エステル化されたコレステリン分のエタノール性ＫＯＨ
を用いる鹸化下における血清中のコレステリン測定で測
定精度は９５〜１０５チであった。

例９ メタノールーオキシダーゼ（ＭＯＤ）を用いるアルコー
ルの測定 測定は次式に従って行なう： 測定は９．０〜９．５のｐＨ値でグリシンーピ口燐酸ナ
トリウム緩衝液中で、セミ力ルバジドの添加のもとに行
なった。

使用した酵素量は、ＮＡＤＨ−ＰＯＤ０．３Ｕ及びＭＯ
Ｄ８Ｕであった。

メタノール及びエタノール０．２μモルでの測定精度は
１００チであった。

イソプロパノールを用いてもこの測定を実施することが
できた。

例１０ キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）を用いるキサンチン
及びヒポキサンチンの測定 測定は次式に従って行なう： 測定はｐＨ８．０で、トリスー緩衝液を用い、前記の例
に記載と同様にして行なった。

測定精度はキサンチンもしくはヒポキサンチン１００％
であった。

参照方法として、Ｈ．Ｕ．ベルクマイヤーのメトーデン
・デル・エンツイマテイッシエン・アナリイゼ３版、■
巻１９８８頁（１９７４年）に記載の方法を使用した。

【図面の簡単な説明】

第１図はＨ２０２量と吸光度変化の関係を示す検量線図
、第２図は時間と吸光度低下の関係を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酢酸カリウム０．１モルを含有する０．２Ｍトリス
   緩衝液（ ｐＨ ６．０ ）中、２５℃で測定したＨ２
   ０２に対するミハエリス定数が２．８・１０−５Ｍであ
   り、ＮＡＤＨに対するミハエリス定数が１．７・１０−
   ５Ｍであり、安定ｐＨ一値幅は４．５〜９．０、最適ｐ
   Ｈ一値は６〜７、作用至適温度は室温であり，、５９０
   ０００分子量を有し、グリセリン／水（１：１）中で安
   定であり、その活性化剤は低級の有機カルボン酸塩であ
   り、その阻害剤は重金属であることを特徴とする、ＮＡ
   ＤＨをＨ，０２により酸化してＮＡＤとＨ２０にする作
   用をするＮＡＤＨ−ベルオキシダーゼ。 ２ ストレプトコツカス・ファエカリスＡＴＣＣ８０４
   ３から、可溶化によるか又は界面活性剤での処理により
   酵素を遊離させ、この溶液から酵素を取得することを特
   徴とする、酢酸カリウム０．１モル含有０．２Ｍトリス
   緩衝液（ｐＨ６．０）中、２５℃で測定したＨ２０２に
   対するミノ・エリス定数が２．８・１０−５Ｍであり、
   ＮＡＤＨに対するミハエリス定数が１．７・１０−５Ｍ
   であり、安定ｐＨ一値幅は４．５〜９．０、最適ｐＨ一
   値は６〜７、作用至適温度は室温であり、５９０００の
   分子量を有し、グリセリン／水（１：１）中で安定であ
   り、かつその活性化剤は低級の有機カルボン酸塩、その
   阻害剤は重金属である、ＮＡＤＨ−ベルオキシダーゼの
   製法。 ３ 酵素溶液を４．２〜４．８のｐＨ値に調節し、不溶
   分を分離除去し、瀘液でポリエチレンイミンを用いて分
   別を行なう、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 酢酸カリウム０．１モル含有０．２Ｍトリス緩衝液
   （ｐＨ６．０）中、２５℃で測定したＨ２０２に対する
   ミハエリス定数が２．８・１０−５Ｍで、ＮＡＤＨに対
   するミハエリス定数が１．７・１０−５Ｍであり、安定
   ｐＨ−値幅は４．５〜９．０、最適ｐＨ一値は６〜７、
   作用至適温度は室温であり、５９０００の分子量を有し
   、グリセリン／水（１：１）中で安定であり、その活性
   化剤は低級の有機カルボン酸塩であり、その阻害剤は重
   金属であり、ＮＡＤＨをＨ２０２により酸化してＮＡＤ
   とＨ２０とになる作用をするＮＡＤＨ−ベルオキシダー
   ゼを用いることを特徴とする、ｐＨ６．０〜９．０での
   特異的オキンダーゼを用いる単純反応又は複合反？で、
   ＮＡＤＨ濃度変化に比例する吸光度変化を測定すること
   よジなるＨ２０の測定法。 ５ グ９コースオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダー
   ゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、コレステリンオキシダ
   ーゼ、アルコールオキシダーゼ、ウリカーゼ又はキサン
   チンオキシダーゼを用いる複合反応で実施する、特許請
   求の範囲第４項記載の方法。