JPS6134800B2 - - Google Patents
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- JPS6134800B2 JPS6134800B2 JP49035128A JP3512874A JPS6134800B2 JP S6134800 B2 JPS6134800 B2 JP S6134800B2 JP 49035128 A JP49035128 A JP 49035128A JP 3512874 A JP3512874 A JP 3512874A JP S6134800 B2 JPS6134800 B2 JP S6134800B2
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はコレステリン、しかも総コレステリン
または結合形コレステリンの定量法に関する。
または結合形コレステリンの定量法に関する。
コレステリンは例えば、血清等の生物的物質中
に一部は遊離のまま、一部は結合してエステルと
して存在している。結合形コレステリンまたは総
コレステリンを定量するためには、先ず結合形の
コレステリンを遊離させることが必要であるが、
そのことは従来、アルカリ性条件、例えばアルコ
ール性水酸化カリウム溶液を用いる齢化によつて
行われた。そうして、遊離したコレステリンは公
知方法により、化学的ないしは酵素的に定量され
た。化学的定量法としては、例えばリーベルマ
ン・ブルヒアルト（Liebermann―Burchard）の
方法があり、酵素的定量はコレステリンオキシタ
ーゼ、コレステリンデヒドロゲナーゼ又はコレス
テリンデヒドラーゼを用いて行うことができる。
に一部は遊離のまま、一部は結合してエステルと
して存在している。結合形コレステリンまたは総
コレステリンを定量するためには、先ず結合形の
コレステリンを遊離させることが必要であるが、
そのことは従来、アルカリ性条件、例えばアルコ
ール性水酸化カリウム溶液を用いる齢化によつて
行われた。そうして、遊離したコレステリンは公
知方法により、化学的ないしは酵素的に定量され
た。化学的定量法としては、例えばリーベルマ
ン・ブルヒアルト（Liebermann―Burchard）の
方法があり、酵素的定量はコレステリンオキシタ
ーゼ、コレステリンデヒドロゲナーゼ又はコレス
テリンデヒドラーゼを用いて行うことができる。
周知のように種々の異なるコレステリンエステ
ル並びに遊離のコレステリンは吸光係数が異なつ
ているから、化学的定量法の場合には予めコレス
テリンエステルをアルカリ性で加水分解して遊離
コレステリンに変える必要があつた。
ル並びに遊離のコレステリンは吸光係数が異なつ
ているから、化学的定量法の場合には予めコレス
テリンエステルをアルカリ性で加水分解して遊離
コレステリンに変える必要があつた。
この結合型コレステリンのアルカリ性齢化は煩
雑で時間がかかる。その上、使用される腐蝕性の
強い試薬がコレステリンを分解してしまう可能性
がある。その様な分解を阻止し、分析結果を適正
なものとするためには、温和な条件下でその加水
分解を行わなければならないが、その場合、定量
のための所要時間が増大する。
雑で時間がかかる。その上、使用される腐蝕性の
強い試薬がコレステリンを分解してしまう可能性
がある。その様な分解を阻止し、分析結果を適正
なものとするためには、温和な条件下でその加水
分解を行わなければならないが、その場合、定量
のための所要時間が増大する。
そして、加水分解に続いてコレステリンの定量
を酵素的方法により行おうとする場合は、アルカ
リ性でコレステリンを遊離させることは有利でな
い。強いアルカリ性媒体中では酵素は不活性化さ
れてしまうので、加水分解後の生成物に酸を添加
して、そのPHを５〜８に調整しなければ、酵素に
よる測定は実施できない。それらのことによつ
て、総コレステリン又は結合型コレステリンの定
量のためには時間がかかり、かつ操作費用も嵩む
のである。
を酵素的方法により行おうとする場合は、アルカ
リ性でコレステリンを遊離させることは有利でな
い。強いアルカリ性媒体中では酵素は不活性化さ
れてしまうので、加水分解後の生成物に酸を添加
して、そのPHを５〜８に調整しなければ、酵素に
よる測定は実施できない。それらのことによつ
て、総コレステリン又は結合型コレステリンの定
量のためには時間がかかり、かつ操作費用も嵩む
のである。
従つて本発明の課題は、その様な欠点を除去し
た、総コレステリン又は結合型コレステリンの定
量法を創製するにある。
た、総コレステリン又は結合型コレステリンの定
量法を創製するにある。
この課題は本発明により、結合型コレステリン
をコレステリンエステラーゼを用いてコレステリ
ンを遊離させ、次いで遊離したコレステリンを公
知方法により定量することによつて達成された。
をコレステリンエステラーゼを用いてコレステリ
ンを遊離させ、次いで遊離したコレステリンを公
知方法により定量することによつて達成された。
コレステリンエステラーゼを用いるとき結合型
コレステリン加水分解は迅速かつ定量的に行うこ
とができる。この方法はその後の遊離コレステリ
ンの定量をも酵素、例えばコレステリンオキシタ
ーゼ又はコレステリンデヒドラーゼを用いて行う
場合に、極めて有利である。こうして、本発明の
方法により、全酵素的なコレステリンの定量が可
能となる。従つて医学的な診断法は著しく改良さ
れ、自動分析機（Analysenautmat）を用いての
その方法の実施が可能となる。
コレステリン加水分解は迅速かつ定量的に行うこ
とができる。この方法はその後の遊離コレステリ
ンの定量をも酵素、例えばコレステリンオキシタ
ーゼ又はコレステリンデヒドラーゼを用いて行う
場合に、極めて有利である。こうして、本発明の
方法により、全酵素的なコレステリンの定量が可
能となる。従つて医学的な診断法は著しく改良さ
れ、自動分析機（Analysenautmat）を用いての
その方法の実施が可能となる。
なるほど肝臓、膵臓中にコレステリンエステラ
ーゼ作用があることは既に公知であつた。しか
し、この種の酵素が定量的な分析法を可能ならし
める程度にコレステリンのエステルを迅速完全な
齢化に好適であろうとは予想できなかつた。それ
というのも確認された分解率は定量的ではなく、
最高80％にしか達しなかつたからである（J.Biol.
Chem.207、665―670（1954）参照）。
ーゼ作用があることは既に公知であつた。しか
し、この種の酵素が定量的な分析法を可能ならし
める程度にコレステリンのエステルを迅速完全な
齢化に好適であろうとは予想できなかつた。それ
というのも確認された分解率は定量的ではなく、
最高80％にしか達しなかつたからである（J.Biol.
Chem.207、665―670（1954）参照）。
結合型コレステリンは生物的物質中に種々の異
なる酸のエステルとして存在している。コレステ
リンエステラーゼが分析方法として使用できるた
めには、存在する全てのエステルをほぼ同じ速度
で且つ同じ精度で定量的に分解する能力を持つて
いることが必要である。しかし、公知のコレステ
リンエステラーゼは異なるコレステリンエステル
に対する分解性能が著しく相異なつていることが
知られていた。そのような酵素の性能からして、
コレステリンエステラーゼが存在する全てのコレ
ステリンエステルを極めて短期間に定量的に分解
しうるということは驚くべきことである。
なる酸のエステルとして存在している。コレステ
リンエステラーゼが分析方法として使用できるた
めには、存在する全てのエステルをほぼ同じ速度
で且つ同じ精度で定量的に分解する能力を持つて
いることが必要である。しかし、公知のコレステ
リンエステラーゼは異なるコレステリンエステル
に対する分解性能が著しく相異なつていることが
知られていた。そのような酵素の性能からして、
コレステリンエステラーゼが存在する全てのコレ
ステリンエステルを極めて短期間に定量的に分解
しうるということは驚くべきことである。
今、微生物からのコレステリンエステラーゼが
本発明に特に好適であることが実証された。この
コレステリンエステラーゼは分解速度および種々
の異なるコレステリンエステルに対する作用に就
いてその他の起源のコレステリンエステラーゼよ
り優れていることが実証され、従つて本発明にお
いて有利に使用される。
本発明に特に好適であることが実証された。この
コレステリンエステラーゼは分解速度および種々
の異なるコレステリンエステルに対する作用に就
いてその他の起源のコレステリンエステラーゼよ
り優れていることが実証され、従つて本発明にお
いて有利に使用される。
更に、種々の微生物そのものは、特に有効なコ
レステリンエステラーゼを含有していて、本発明
においてコレステリンエステラーゼを分離精製す
ることなく、そのままで使用できることが判つ
た。そのことは、特にそれらは入手が容易な許り
でなく、コレステリンエステラーゼを分離したり
濃縮したりする必要がないため、異なるコレステ
リンエステルに特異的な作用を持つ多くのエステ
ラーゼの混合物が持つている、すべての結合型コ
レステリンを定量的に測定するという可能性が、
その精製の際に損なわれてしまうという危険性が
回避できるという利点を有している。
レステリンエステラーゼを含有していて、本発明
においてコレステリンエステラーゼを分離精製す
ることなく、そのままで使用できることが判つ
た。そのことは、特にそれらは入手が容易な許り
でなく、コレステリンエステラーゼを分離したり
濃縮したりする必要がないため、異なるコレステ
リンエステルに特異的な作用を持つ多くのエステ
ラーゼの混合物が持つている、すべての結合型コ
レステリンを定量的に測定するという可能性が、
その精製の際に損なわれてしまうという危険性が
回避できるという利点を有している。
その上、一般にリポイド被膜に結合したコレス
テリンエステラーゼの精製は煩雑であり、それゆ
え、精製せずに使用できる微生物製剤に比較して
価格の点からしても有利でなく、日常的診断には
むしろ不適当な製剤ができる。
テリンエステラーゼの精製は煩雑であり、それゆ
え、精製せずに使用できる微生物製剤に比較して
価格の点からしても有利でなく、日常的診断には
むしろ不適当な製剤ができる。
本発明による方法で、カンジダ・ルゴサ
（Candida rugosa）［シリンドラシア
（Cylindracea）ともいわれる］ATCC 14830また
はWS90031およびアスペルギルス・spec.
Aspergillus spec.）WS90030からのコレステリ
ンエステラーゼを使用すると特に有利な結果が得
られた。これら２種類の微生物は本発明におい
て、そのまま又は前処理した形、例えばアセトン
乾菌末（Acetontrock enpulver）として使用す
ることができる。しかしながら該微生物からの濃
縮したコレステリンエステラーゼ製剤を使用する
ことも可能である。その際、特に有利な点は確実
な濃縮をこの場合には非常に容易に成し遂げうる
ということである。前記のカンジダ・ルゴサは大
工業的に生産され、市場で入手しうる微生物であ
る。慣用の市販形はラクトースで安定化されたア
セトン乾菌末であるが、本発明に特に好適である
ことが実証された。類似の有利な特性は下記のも
のに於いても明らかになつている。
（Candida rugosa）［シリンドラシア
（Cylindracea）ともいわれる］ATCC 14830また
はWS90031およびアスペルギルス・spec.
Aspergillus spec.）WS90030からのコレステリ
ンエステラーゼを使用すると特に有利な結果が得
られた。これら２種類の微生物は本発明におい
て、そのまま又は前処理した形、例えばアセトン
乾菌末（Acetontrock enpulver）として使用す
ることができる。しかしながら該微生物からの濃
縮したコレステリンエステラーゼ製剤を使用する
ことも可能である。その際、特に有利な点は確実
な濃縮をこの場合には非常に容易に成し遂げうる
ということである。前記のカンジダ・ルゴサは大
工業的に生産され、市場で入手しうる微生物であ
る。慣用の市販形はラクトースで安定化されたア
セトン乾菌末であるが、本発明に特に好適である
ことが実証された。類似の有利な特性は下記のも
のに於いても明らかになつている。
アクチノミセス・アウレオベルチシリウム
（Actinomyces aureoverticillium） WS90002 アクチノミセス・シアネオフスカツス
（Actinomyces cyaneofuscatus） WS90003 アクチノミセス・グリセオミシニ（Actinomyces
grisemycini） WS90004 アクチノミセス・ロンギスポルス―fl.
（Actinomyces longisporus―fl.） WS90005 アクチノミセス・マラキチクス（Actinomyces
malachiticus） WS90006 アクチノミセス・ロゼオルス（Actinomyces
roseolus） WS90007 アクチノミセス・トキシトリシニ（Actinomyces
toxytricini） WS90008 アクチノミセス・バリアビリス（Actinomyces
variabilis） WS90009 ストレプトミセスspec（Streptomyces spec.）
WS90010 ストレプトミセス・アウトトロフイクス
（Streptomyces autorophicus） WS90011 ストレプトミセス・カネスセンス
（Streptomyces canescens） WS90012 ストレプトミセス・カルトレウシス
（Streptomyces chartreusis） WS90013 ストレプトミセス・ミキガネンシス
（Streptmyces michiganensis） WS90014 ストレプトミセス・ムリヌス（Streptomyces
murinus） WS90015 ストレプトミセス・ハキジヨエンシス
（Streptomyces hachijoensis） WS90016 ストレプトミセス・カエレステス
（Streptomyces caelestes） WS90017 ストレプトミセス・テンダエ（Streptomyces
tendae） WS90018 カンジダ・ミコデルマ（Candida mycoderma）
WS90021 カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）
WS90021 カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）
WS90022 カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）
WS90023 カンジダspes.（Candida spec.） WS90024 クニングハメラ・エレガンス（Cunninghamella
elegans） WS90025 ムコル・ムセド（Mucor mucedo） WS90026 ペニシリウムspec.（Penicilium spec.）
WS90028 アスペルギルスspec.（Aspergillus spec.）
WS90029 これら微生物起源の優れた上記コレステリンエ
ステラーゼの他に、ノカルデア・ルルブラ
WS90019、リゾプスspec.WS90027、プソイドモ
ナス属、シゾフイルム属等、その他の微生物起源
のコレステリンエステラーゼを使用することもで
きる。
（Actinomyces aureoverticillium） WS90002 アクチノミセス・シアネオフスカツス
（Actinomyces cyaneofuscatus） WS90003 アクチノミセス・グリセオミシニ（Actinomyces
grisemycini） WS90004 アクチノミセス・ロンギスポルス―fl.
（Actinomyces longisporus―fl.） WS90005 アクチノミセス・マラキチクス（Actinomyces
malachiticus） WS90006 アクチノミセス・ロゼオルス（Actinomyces
roseolus） WS90007 アクチノミセス・トキシトリシニ（Actinomyces
toxytricini） WS90008 アクチノミセス・バリアビリス（Actinomyces
variabilis） WS90009 ストレプトミセスspec（Streptomyces spec.）
WS90010 ストレプトミセス・アウトトロフイクス
（Streptomyces autorophicus） WS90011 ストレプトミセス・カネスセンス
（Streptomyces canescens） WS90012 ストレプトミセス・カルトレウシス
（Streptomyces chartreusis） WS90013 ストレプトミセス・ミキガネンシス
（Streptmyces michiganensis） WS90014 ストレプトミセス・ムリヌス（Streptomyces
murinus） WS90015 ストレプトミセス・ハキジヨエンシス
（Streptomyces hachijoensis） WS90016 ストレプトミセス・カエレステス
（Streptomyces caelestes） WS90017 ストレプトミセス・テンダエ（Streptomyces
tendae） WS90018 カンジダ・ミコデルマ（Candida mycoderma）
WS90021 カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）
WS90021 カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）
WS90022 カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）
WS90023 カンジダspes.（Candida spec.） WS90024 クニングハメラ・エレガンス（Cunninghamella
elegans） WS90025 ムコル・ムセド（Mucor mucedo） WS90026 ペニシリウムspec.（Penicilium spec.）
WS90028 アスペルギルスspec.（Aspergillus spec.）
WS90029 これら微生物起源の優れた上記コレステリンエ
ステラーゼの他に、ノカルデア・ルルブラ
WS90019、リゾプスspec.WS90027、プソイドモ
ナス属、シゾフイルム属等、その他の微生物起源
のコレステリンエステラーゼを使用することもで
きる。
既述の様に、本発明方法の特に重要な利点は、
全酵素的な総コレステリンの定量が可能になると
いう点に存する。その際、微生物からの有利なコ
レステリンエステラーゼ製剤を用いてエステルか
らコレステリンを迅速かつ定量的に遊離させるこ
とができることは重要である。特に前記の有利な
微生物を用いて、これを直接添加することによつ
て非常に僅かな量で、かつ後続するコレステリン
の酵素的定量で望まれるPH値―及び温度条件下
で、数分間以内にコレステリンを定量的に分離す
ることが可能である。その際、この種の微生物に
使用される炭水化物を基体とする常用の安定化剤
はこの全酵素的コレステリン定量法の実施の障害
とならないことが判明した。
全酵素的な総コレステリンの定量が可能になると
いう点に存する。その際、微生物からの有利なコ
レステリンエステラーゼ製剤を用いてエステルか
らコレステリンを迅速かつ定量的に遊離させるこ
とができることは重要である。特に前記の有利な
微生物を用いて、これを直接添加することによつ
て非常に僅かな量で、かつ後続するコレステリン
の酵素的定量で望まれるPH値―及び温度条件下
で、数分間以内にコレステリンを定量的に分離す
ることが可能である。その際、この種の微生物に
使用される炭水化物を基体とする常用の安定化剤
はこの全酵素的コレステリン定量法の実施の障害
とならないことが判明した。
前述の様に、微生物から分離濃縮したコレステ
リンエステラーゼを本発明による方法に使用する
こともできる。好適な濃縮は、微生物またはその
他の生物的物質のアセトン乾菌末を原料とし、か
つ該粉末に透析、弱塩基性の陰イオン交換体を用
いる処理及び硫酸アンモニウム分別を行うことに
よつて、達成することができる。このようにして
容易にコレステリンエステラーゼの20ないし30倍
の濃縮が達成される。弱塩基性の陰イオン交換体
としては、ジエチルアミノエタノール基で変性し
た炭水化物を基体とする製品が特に好適であると
実証された。硫酸アンモニウム分別で有利には硫
酸アンモニウム1.8と2.4モルの間のフラクシヨン
が得られる。こうして得た酵素フラクシヨンを次
いで有利には前記交換体材料でクロマトグラフイ
ーにかける。
リンエステラーゼを本発明による方法に使用する
こともできる。好適な濃縮は、微生物またはその
他の生物的物質のアセトン乾菌末を原料とし、か
つ該粉末に透析、弱塩基性の陰イオン交換体を用
いる処理及び硫酸アンモニウム分別を行うことに
よつて、達成することができる。このようにして
容易にコレステリンエステラーゼの20ないし30倍
の濃縮が達成される。弱塩基性の陰イオン交換体
としては、ジエチルアミノエタノール基で変性し
た炭水化物を基体とする製品が特に好適であると
実証された。硫酸アンモニウム分別で有利には硫
酸アンモニウム1.8と2.4モルの間のフラクシヨン
が得られる。こうして得た酵素フラクシヨンを次
いで有利には前記交換体材料でクロマトグラフイ
ーにかける。
特に有利な結果はコレステリンエステル含有の
培養媒体を用いて培養した微生物を用いてえられ
る。その場合、培養の間にコレステリンエステル
又はコレステリンエステルの混合物を唯一の炭素
源として添加したもよいし又はその他の炭素源と
共に使用してもよい。多工程培養法で得られた微
生物を使用するのが有利であり、その際、該微生
物を第一工程では例えばグリセリンの様な好適な
炭素供給体上で培養し、かつ第二工程ではコレス
テリンエステル上で培養する。好適な培養法は例
えば西ドイ特許公開公報第2224133号及び同第
2307518号に詳説されている。
培養媒体を用いて培養した微生物を用いてえられ
る。その場合、培養の間にコレステリンエステル
又はコレステリンエステルの混合物を唯一の炭素
源として添加したもよいし又はその他の炭素源と
共に使用してもよい。多工程培養法で得られた微
生物を使用するのが有利であり、その際、該微生
物を第一工程では例えばグリセリンの様な好適な
炭素供給体上で培養し、かつ第二工程ではコレス
テリンエステル上で培養する。好適な培養法は例
えば西ドイ特許公開公報第2224133号及び同第
2307518号に詳説されている。
本発明により有利に使用されるカンジダ・ルゴ
サATCCからのコレステリンエステラーゼはPH５
とPH6.5の間の弱酸性範囲で非常に良好な安定性
を有する。この酵素の至適PH値は7.5である。酵
素の特性は、反応媒体の塩含有量が比較的高い場
合に特に良好な接触反応が進行することである。
従つて有利には0.2〜0.8モル、特に0.4〜0.6モル
の緩衝溶液中で操作する。PH値は4.5と7.5の間の
範囲であつてよく、有利には前記したPH５〜6.5
の範囲である有利にはコレステリンエステラーゼ
の作用は表面活性物質の添加により高められる。
特に有利なのはヒドロキシポリエトキシドデカン
を添加することである。既述の様に、特に有利に
は本発明の方法は完全に酵素的に、すなわち後続
するコレステリン定量を同様に有利にはコレステ
リンオキシターゼを使用して酵素的に実施され
る。しかしながらコレステリンデヒドラーゼ又は
コレステリンデヒドロゲナーゼを使用することも
できる。
サATCCからのコレステリンエステラーゼはPH５
とPH6.5の間の弱酸性範囲で非常に良好な安定性
を有する。この酵素の至適PH値は7.5である。酵
素の特性は、反応媒体の塩含有量が比較的高い場
合に特に良好な接触反応が進行することである。
従つて有利には0.2〜0.8モル、特に0.4〜0.6モル
の緩衝溶液中で操作する。PH値は4.5と7.5の間の
範囲であつてよく、有利には前記したPH５〜6.5
の範囲である有利にはコレステリンエステラーゼ
の作用は表面活性物質の添加により高められる。
特に有利なのはヒドロキシポリエトキシドデカン
を添加することである。既述の様に、特に有利に
は本発明の方法は完全に酵素的に、すなわち後続
するコレステリン定量を同様に有利にはコレステ
リンオキシターゼを使用して酵素的に実施され
る。しかしながらコレステリンデヒドラーゼ又は
コレステリンデヒドロゲナーゼを使用することも
できる。
コレステリンオキシターゼを用いる定量は例え
ば特開昭49―62193号に記載されている。該公開
公報に記載の方法は有利に本発明の方法と組合せ
ることができる。その際、原則的には酵素消費
量、H2O2生成又はコレステノン生成を測定する
ことができる。
ば特開昭49―62193号に記載されている。該公開
公報に記載の方法は有利に本発明の方法と組合せ
ることができる。その際、原則的には酵素消費
量、H2O2生成又はコレステノン生成を測定する
ことができる。
酵素消費量の測定は例えばガスクロマトグラフ
イー、ポーラロメトリーにより又は偏光法により
実施することができる。該測定法は自体公知であ
る。生成した過酸化水素は滴定分析、電位差滴定
法、ポーラログラフイー及び比色分析並びに酵素
法により定量することができる。カタラーゼ又は
ペルオキシダーゼを使用する酵素定量が有利であ
り、特にβ―ジケトン、例えばアセチルアセト
ン、低級アルコール及びアンモニウムイオンを含
有する緩衝液の存在下でのカタラーゼを用いる定
量又は発色体、例えば２，2′―アミノベンズチア
ゾリンスルホン酸の存在でペルオキシダーゼを用
いる定量が有利である。コレステノンはケト試
薬、例えば２，４―ジニトロフエニルヒドラジン
を用いるか又は240nm光度計を用いて測定され
る。
イー、ポーラロメトリーにより又は偏光法により
実施することができる。該測定法は自体公知であ
る。生成した過酸化水素は滴定分析、電位差滴定
法、ポーラログラフイー及び比色分析並びに酵素
法により定量することができる。カタラーゼ又は
ペルオキシダーゼを使用する酵素定量が有利であ
り、特にβ―ジケトン、例えばアセチルアセト
ン、低級アルコール及びアンモニウムイオンを含
有する緩衝液の存在下でのカタラーゼを用いる定
量又は発色体、例えば２，2′―アミノベンズチア
ゾリンスルホン酸の存在でペルオキシダーゼを用
いる定量が有利である。コレステノンはケト試
薬、例えば２，４―ジニトロフエニルヒドラジン
を用いるか又は240nm光度計を用いて測定され
る。
総コレステリン又は結合型コレステリンをコレ
ステリンエステラーゼを用いて全酵素的に定量す
る場合、有利にはノカルデイア・エリトロポリス
（Nocardia erythropolis）ATCC17895、ノカル
デイア・エリトロポリスATCC4277、ノカルデイ
ア・ホルミカ（Nocardia formica）ATCC14811
又はプロアクテイノミセス・エリトロポリス
（Proacinomyces erythropolis）NCIB9158からの
オキシダーゼを使用する。
ステリンエステラーゼを用いて全酵素的に定量す
る場合、有利にはノカルデイア・エリトロポリス
（Nocardia erythropolis）ATCC17895、ノカル
デイア・エリトロポリスATCC4277、ノカルデイ
ア・ホルミカ（Nocardia formica）ATCC14811
又はプロアクテイノミセス・エリトロポリス
（Proacinomyces erythropolis）NCIB9158からの
オキシダーゼを使用する。
その他、本発明はコレステリンエステラーゼ及
び遊離コレステリンの定量用試薬からなるコレス
テリン定量試薬に関する。有利にはこの種の試薬
は、微生物起源のコレステリンエステラーゼ、コ
レステリンオキシターゼ、H2O2測定用の系、コ
レステノン測定用の系からなつている。その際、
コレステリンエステラーゼとして前記微生物の一
つが特にアセトン乾菌末の形で使用されているか
又はそれから得られるコレステリンエステラーゼ
活性を有する蛋白フラクシヨンを使用した試薬が
極めて有利である。
び遊離コレステリンの定量用試薬からなるコレス
テリン定量試薬に関する。有利にはこの種の試薬
は、微生物起源のコレステリンエステラーゼ、コ
レステリンオキシターゼ、H2O2測定用の系、コ
レステノン測定用の系からなつている。その際、
コレステリンエステラーゼとして前記微生物の一
つが特にアセトン乾菌末の形で使用されているか
又はそれから得られるコレステリンエステラーゼ
活性を有する蛋白フラクシヨンを使用した試薬が
極めて有利である。
詳細かつ有利な実施例ではこの種の試薬は、コ
レステリンオキシターゼ、前記微生物の一つから
のコレステリンエステラーゼ製剤、カタラーゼ、
アセチルアセトン、メタノール及びアンモウムイ
オン含有の緩衝剤（単独又は混同して）からな
る。その他の有利な実施例では試薬コレステリン
エステラーゼ、前記した微生物からのコレステリ
ンエステラーゼ活性を有する製剤、ペルオキシタ
ーゼ、発色体及び緩衝剤（単独又は混同して）か
らなつている。発色体としては２，2′―アミノベ
ンズチアゾリンスルホン酸が有利である。
レステリンオキシターゼ、前記微生物の一つから
のコレステリンエステラーゼ製剤、カタラーゼ、
アセチルアセトン、メタノール及びアンモウムイ
オン含有の緩衝剤（単独又は混同して）からな
る。その他の有利な実施例では試薬コレステリン
エステラーゼ、前記した微生物からのコレステリ
ンエステラーゼ活性を有する製剤、ペルオキシタ
ーゼ、発色体及び緩衝剤（単独又は混同して）か
らなつている。発色体としては２，2′―アミノベ
ンズチアゾリンスルホン酸が有利である。
その他の有利な実施例では本発明による試薬は
コレステリンオキシダーゼ、前記微生物の一つか
らのコレステリンエステラーゼ製剤及びヒトラゾ
ン生成下にケト基と反応するヒドラジン誘導体並
びに場合により緩衝剤からなる。ヒドラジン誘導
体としては２，４―ジニトロフエニルヒドラジン
が有利である。
コレステリンオキシダーゼ、前記微生物の一つか
らのコレステリンエステラーゼ製剤及びヒトラゾ
ン生成下にケト基と反応するヒドラジン誘導体並
びに場合により緩衝剤からなる。ヒドラジン誘導
体としては２，４―ジニトロフエニルヒドラジン
が有利である。
前記の有利な試薬組合物は、前記成分の他に付
加的に常用の溶剤、安定化剤又は（及び）表面活
性物質を含有してもよい。これらの添加物はすべ
て当業者に公知で、過酸化水素又はコレステノン
の検出系に常用されている。有利には前記の試薬
組合せ物は主成分を下記の量比で含有する： (1) PH５〜７のアンモウムイオン含有の緩衝剤
100ml中にコレステリンオキシターゼ13〜150単
位、微生物・コレステリンエステラーゼ0.05〜
0.5mg、カタラーゼ２×104〜５×105単位、ア
セチンアセトン0.05〜0.2ml及びメタノール２
〜10ml並びに、場合により表面活性剤、有利に
はヒドロキシポリエトキシドデカン0.02〜0.3
ml。
加的に常用の溶剤、安定化剤又は（及び）表面活
性物質を含有してもよい。これらの添加物はすべ
て当業者に公知で、過酸化水素又はコレステノン
の検出系に常用されている。有利には前記の試薬
組合せ物は主成分を下記の量比で含有する： (1) PH５〜７のアンモウムイオン含有の緩衝剤
100ml中にコレステリンオキシターゼ13〜150単
位、微生物・コレステリンエステラーゼ0.05〜
0.5mg、カタラーゼ２×104〜５×105単位、ア
セチンアセトン0.05〜0.2ml及びメタノール２
〜10ml並びに、場合により表面活性剤、有利に
はヒドロキシポリエトキシドデカン0.02〜0.3
ml。
(2) PH６〜８の緩衝剤100ml中、コレステリンオ
キシターゼ３〜40単位、微生物・コレステリン
エステラーゼ0.05〜0.5mg並びにペルオキシタ
ーゼ２×102〜１×104単位、２，2′―アミノベ
ンズチアゾリンスルホン酸50〜200mg並びに場
合により表面活性剤、特にヒドロキシポリエト
キシデカン0.05〜0.5ml。
キシターゼ３〜40単位、微生物・コレステリン
エステラーゼ0.05〜0.5mg並びにペルオキシタ
ーゼ２×102〜１×104単位、２，2′―アミノベ
ンズチアゾリンスルホン酸50〜200mg並びに場
合により表面活性剤、特にヒドロキシポリエト
キシデカン0.05〜0.5ml。
(3) PH６〜８の乾緩衝剤10ml中、コレステリンオ
キシターゼ0.1〜１単位、微生物・コレステリ
ンエステラーゼ0.05〜0.5mg、２，４―ジニト
ロフエニルヒドラジンの１ミリモル溶液１〜５
ml並びに場合により表面活性剤0.005〜0.1ml。
キシターゼ0.1〜１単位、微生物・コレステリ
ンエステラーゼ0.05〜0.5mg、２，４―ジニト
ロフエニルヒドラジンの１ミリモル溶液１〜５
ml並びに場合により表面活性剤0.005〜0.1ml。
(4) PH５〜９の緩衝剤、有利にはPH7.5の0.5モル
の燐酸ナトリウム緩衝剤50ml中、コレステリン
オキシターゼ２〜100単位、微生物・コレステ
リンエステラーゼ0.05〜0.5mg並びに場合によ
り表面活性剤（有利にはヒドロキシポリエトキ
シドデカン）0.1〜2.0ml。
の燐酸ナトリウム緩衝剤50ml中、コレステリン
オキシターゼ２〜100単位、微生物・コレステ
リンエステラーゼ0.05〜0.5mg並びに場合によ
り表面活性剤（有利にはヒドロキシポリエトキ
シドデカン）0.1〜2.0ml。
本発明による方法及び試薬を用いて結合型コレ
ステリンの極めて迅速で完全な鹸化を行なうこと
ができる。例えばカンジダ・ルゴサATCC14830
又はアスペルギルスsp.WS90030のアセトン乾菌
末を0.1〜0.3mgの量で添加する場合には、コレス
テリンオキシターゼを用いるコレステリン測定の
条件下で本発明による結合型コレステリンの定量
的分解は１〜３分間以内に達成される。
ステリンの極めて迅速で完全な鹸化を行なうこと
ができる。例えばカンジダ・ルゴサATCC14830
又はアスペルギルスsp.WS90030のアセトン乾菌
末を0.1〜0.3mgの量で添加する場合には、コレス
テリンオキシターゼを用いるコレステリン測定の
条件下で本発明による結合型コレステリンの定量
的分解は１〜３分間以内に達成される。
次に本発明を実施例につき詳説する。
実施例 １
特開昭49―62193号の例１に記載の方法を使用
して血清中の遊離コレステリンの含量約63mg％
（100ml中63mg）を測定した。結合型コレステリン
を測定するためにその血清の比較試料をアルコー
ル性水酸酸化カリウム溶液で30分間70℃で処理し
た。中和し、かつ存在するコレステリンを新たに
測定して、コレステリンの総含量181mg％が得ら
れた。そのことから、100ml当りコレステリン118
mgが結合型で存在していたことが判る。
して血清中の遊離コレステリンの含量約63mg％
（100ml中63mg）を測定した。結合型コレステリン
を測定するためにその血清の比較試料をアルコー
ル性水酸酸化カリウム溶液で30分間70℃で処理し
た。中和し、かつ存在するコレステリンを新たに
測定して、コレステリンの総含量181mg％が得ら
れた。そのことから、100ml当りコレステリン118
mgが結合型で存在していたことが判る。
同じ方法を未処理血清を用いて繰返した。測定
の始めに市販のカンジダ・ルゴサATCC14830―
アセトン乾菌末（プロテインに対し）0.3mgを添
加した。３分間後にポーラログラフイーによる測
定で、総コレステリン含量183mg％が得られた。
の始めに市販のカンジダ・ルゴサATCC14830―
アセトン乾菌末（プロテインに対し）0.3mgを添
加した。３分間後にポーラログラフイーによる測
定で、総コレステリン含量183mg％が得られた。
実施例 ２
コレステリンエステラーゼ活性度を増大するた
めにカンジダ・ルゴサATCC14830を燐酸カリウ
ム緩衝液に溶かし、同一の緩衝液で透析した。安
定化剤として含有するラクトースを除去した後、
透析した溶液中にコレステリンエステラーゼ比活
性度0.3単位／蛋白質mgが得られた。
めにカンジダ・ルゴサATCC14830を燐酸カリウ
ム緩衝液に溶かし、同一の緩衝液で透析した。安
定化剤として含有するラクトースを除去した後、
透析した溶液中にコレステリンエステラーゼ比活
性度0.3単位／蛋白質mgが得られた。
こうして得た溶液をジエチルアミノエタノール
基で変性したデキストランを基体とするイオン交
換体と撹拌混合し、PH6.0の0.2M燐酸塩緩衝液で
溶離した。溶離物中にコレステリンエステラーゼ
比活性度1.2単位／mgが得られた。
基で変性したデキストランを基体とするイオン交
換体と撹拌混合し、PH6.0の0.2M燐酸塩緩衝液で
溶離した。溶離物中にコレステリンエステラーゼ
比活性度1.2単位／mgが得られた。
こうして得た溶液に硫酸アンモニウム分別を行
つた。1.8と2.4Mの間の硫酸アンモニウムで沈殿
するプロテインフラクシヨンを分離した。該フラ
クシヨンはコレステリンエステラーゼ比活性度
2.5単位／mgを有していた。
つた。1.8と2.4Mの間の硫酸アンモニウムで沈殿
するプロテインフラクシヨンを分離した。該フラ
クシヨンはコレステリンエステラーゼ比活性度
2.5単位／mgを有していた。
得られた生成物を新たにPH6.0の燐酸塩緩衝液
に溶かし、同じ緩衝液に対して透析して塩を除去
し、次いで前記のものと同じ陰イオン交換体を充
填したカラムを用いてクロマトグラフイーにかけ
た。後、再びPH6.0の0.2M燐酸塩緩衝液を用いて
溶離した。コレステリンエステラーゼ活性を有す
るフラクシヨンで７単位／蛋白質mgの比活性度が
得られた。
に溶かし、同じ緩衝液に対して透析して塩を除去
し、次いで前記のものと同じ陰イオン交換体を充
填したカラムを用いてクロマトグラフイーにかけ
た。後、再びPH6.0の0.2M燐酸塩緩衝液を用いて
溶離した。コレステリンエステラーゼ活性を有す
るフラクシヨンで７単位／蛋白質mgの比活性度が
得られた。
こうして得た濃縮コレステリンエステラーゼ製
剤を例１に記載したようにコレステリン測定に使
用した。しかしながら使用量はプロテインに対し
て0.001mgにすぎなかつた。結果は例１の結果に
対応している。
剤を例１に記載したようにコレステリン測定に使
用した。しかしながら使用量はプロテインに対し
て0.001mgにすぎなかつた。結果は例１の結果に
対応している。
カンジダ・ルゴサからのコレステリンエステラ
ーゼは酵素精製の常法により、更に精製すること
ができる。前記濃縮工程の代りにその他の常用の
生物化学的精製工程、例えばポリエチレンイミ
ン、有機溶剤又は塩を用いる沈殿又は分別、分子
篩を用いるクロマトグラフイー又はジエチルアミ
ノエタノール基以外の官能基を有する弱い陰イオ
ン交換体、プロタミンスルフエート沈殿法等も使
用することができる。
ーゼは酵素精製の常法により、更に精製すること
ができる。前記濃縮工程の代りにその他の常用の
生物化学的精製工程、例えばポリエチレンイミ
ン、有機溶剤又は塩を用いる沈殿又は分別、分子
篩を用いるクロマトグラフイー又はジエチルアミ
ノエタノール基以外の官能基を有する弱い陰イオ
ン交換体、プロタミンスルフエート沈殿法等も使
用することができる。
実施例 ３
血清もしくはコレステリン標準液0.5mlに、0.4
％のヒドロキシポリエトキシドデカンを含有する
PH7.5の0.5M燐酸カリウム緩衝液1.0ml及び例２の
コレステリンエステラーゼ2.5単位を添加する。
該反応混合物を37℃で40分間恒温で保持する。次
いで該溶液0.25mlを酢酸２部、無水酢酸３部、及
び硫酸１部を含有するコレステリン試薬３mlに加
える（リーベルマン・ブルヒアルト試薬）。
％のヒドロキシポリエトキシドデカンを含有する
PH7.5の0.5M燐酸カリウム緩衝液1.0ml及び例２の
コレステリンエステラーゼ2.5単位を添加する。
該反応混合物を37℃で40分間恒温で保持する。次
いで該溶液0.25mlを酢酸２部、無水酢酸３部、及
び硫酸１部を含有するコレステリン試薬３mlに加
える（リーベルマン・ブルヒアルト試薬）。
標準液を対照として、代表的試料中の総コレス
テリン170mg％の値が得られた。コレステリンエ
ステルをアルコール性水酸化カリウム溶液を用い
て鹸化する比較定量の結果は165mg％であつた。
テリン170mg％の値が得られた。コレステリンエ
ステルをアルコール性水酸化カリウム溶液を用い
て鹸化する比較定量の結果は165mg％であつた。
実施例 ４
血清0.02mlにヒドロキシポリエトキシドデカン
0.4％を含有する0.5M燐酸カリウム緩衝液10ml及
び例２のコレステリンエステラーゼ0.2単位を添
加する。反応溶液を37℃で60分間恒温に保持す
る。その後、適当な分光光度計中で240nmで吸光
度（E1）を読み取りかつ、反応をブレビバクテリ
ウム・ステロリクム（Brevibacterium
stericium）からのステリンデヒドラーゼ0.1単位
を用いて開始させる。15分間後に新に吸光度
（E2）を読み取る。生成した△４―コレステリン
の濃度、従つてコレステリンの濃度は、240nmに
おける△４―コレステリンのモル吸光係数を考慮
して第１回目の読み取りとの差から計算される。
典型的試料の測定により総コレステリン183mg％
が得られた。
0.4％を含有する0.5M燐酸カリウム緩衝液10ml及
び例２のコレステリンエステラーゼ0.2単位を添
加する。反応溶液を37℃で60分間恒温に保持す
る。その後、適当な分光光度計中で240nmで吸光
度（E1）を読み取りかつ、反応をブレビバクテリ
ウム・ステロリクム（Brevibacterium
stericium）からのステリンデヒドラーゼ0.1単位
を用いて開始させる。15分間後に新に吸光度
（E2）を読み取る。生成した△４―コレステリン
の濃度、従つてコレステリンの濃度は、240nmに
おける△４―コレステリンのモル吸光係数を考慮
して第１回目の読み取りとの差から計算される。
典型的試料の測定により総コレステリン183mg％
が得られた。
ステリンデヒドラーゼの代りにコレステリンオ
キシダーゼ［ノカルデイア・エリトロポリス
（Nocardia erythropolis）から］を用いる比較定
量では総コレステリン181mg％であつた。
キシダーゼ［ノカルデイア・エリトロポリス
（Nocardia erythropolis）から］を用いる比較定
量では総コレステリン181mg％であつた。
参考例 １
燐酸水素二アンモニウム10ｇを水100mlに溶か
し85％の燐酸でPH7.0に調整する。次いでカタラ
ーゼ105単位を添加する。こうして得た溶液で、
アセチルアセトン0.2ml、メタノール10ml及びヒ
ドロキシポリエトキシドデカン0.1ｇの混合物を
100mlにする。該溶液にリゾプスspec.
（Rhizopus spec.）WS90027からのコレステリン
エステラーゼ2.5単位を添加する。
し85％の燐酸でPH7.0に調整する。次いでカタラ
ーゼ105単位を添加する。こうして得た溶液で、
アセチルアセトン0.2ml、メタノール10ml及びヒ
ドロキシポリエトキシドデカン0.1ｇの混合物を
100mlにする。該溶液にリゾプスspec.
（Rhizopus spec.）WS90027からのコレステリン
エステラーゼ2.5単位を添加する。
こうして得た溶液5.0mlを血清0.02mlもしくは
コレステリン200mg％を含有するコレステリン標
準溶液0.02mlと混合する。血清含有の試料の少量
に、コレステリンオキシターゼ各々0.1単位を添
加し、37℃で60分間恒温に保持する。次いで生成
した色素を試料盲検値を考慮して405nmで光度計
を用いて測定する。
コレステリン200mg％を含有するコレステリン標
準溶液0.02mlと混合する。血清含有の試料の少量
に、コレステリンオキシターゼ各々0.1単位を添
加し、37℃で60分間恒温に保持する。次いで生成
した色素を試料盲検値を考慮して405nmで光度計
を用いて測定する。
血清含有試料のコレステリン含量は、標準液を
基準量として用いて、総コレステリン154mg％で
あつた。リゾプスspec.WS90027からのコレステ
リンエステラーゼの代りに、カンジダ・ルゴサ
ATCC1483からのコレステリンエステラーゼを用
いる対照測定でも、同一の値が得られた。
基準量として用いて、総コレステリン154mg％で
あつた。リゾプスspec.WS90027からのコレステ
リンエステラーゼの代りに、カンジダ・ルゴサ
ATCC1483からのコレステリンエステラーゼを用
いる対照測定でも、同一の値が得られた。
参考例 ２
胆汁酸ナトリウム3mモル／、４―アミノフ
エナゾン0.82mモル／、フエノール14mモル／
、燐酸ナトリウム―緩衝液PH6.7の100mモル／
、カルボワツクス―6000の0.17mモル／及び
ペルオキシターゼ5.7mg／mlを含む試薬１mlに、
総コレステリン含量142mg／dlのヒト血清0.01ml
及びコレステリンオキシターゼ0.02ml（１mg／
ml）を加えた。遊離コレステリンの測定は２分間
以内で終了した。このテストバツチに膵臓からの
コレステリンエステラーゼ0.05ml（1.17mg／ml）
を加えて行うエステル化コレステリンの測定は30
分間続いた。
エナゾン0.82mモル／、フエノール14mモル／
、燐酸ナトリウム―緩衝液PH6.7の100mモル／
、カルボワツクス―6000の0.17mモル／及び
ペルオキシターゼ5.7mg／mlを含む試薬１mlに、
総コレステリン含量142mg／dlのヒト血清0.01ml
及びコレステリンオキシターゼ0.02ml（１mg／
ml）を加えた。遊離コレステリンの測定は２分間
以内で終了した。このテストバツチに膵臓からの
コレステリンエステラーゼ0.05ml（1.17mg／ml）
を加えて行うエステル化コレステリンの測定は30
分間続いた。
この実験を膵臓からのコレステリンエステラー
ゼの代りに微生物（リゾプスspec.WS90027）か
らの等量のコレステリンエステラーゼを使用して
繰返した場合、反応即ち、総コレステリンの測定
は８分間以内で終了した。
ゼの代りに微生物（リゾプスspec.WS90027）か
らの等量のコレステリンエステラーゼを使用して
繰返した場合、反応即ち、総コレステリンの測定
は８分間以内で終了した。
なお、コレステリンエステラーゼとしてリゾプ
スspec.WS90027の代わりにプソイドモナスspec.
DSM1280からのものを用いても同様の結果が得
られた。
スspec.WS90027の代わりにプソイドモナスspec.
DSM1280からのものを用いても同様の結果が得
られた。
実施例 ５
3mmol／のコール酸ナトリウム、
0.82mmol／の４―アミノフエナゾン、
14mmol／のフエノール、100mmol／の燐酸
ナトリウム―PH6.7、0.17mmol／のカルボワツ
クス6000及び5.7mg／のパーオキシターゼを含
有する試薬１mlに、0.01mlのヒト血清を添加し
た。その血清は142mg／dlの総コレステリンを含
有していた。この溶液に、ムコル・ムセド
WS90026から造つた2.5単位のコレステリンエス
テラーゼとノカルヂア エリスロポリスから造つ
たコレステリン―オキシターゼ0.1単位を加え
た。
0.82mmol／の４―アミノフエナゾン、
14mmol／のフエノール、100mmol／の燐酸
ナトリウム―PH6.7、0.17mmol／のカルボワツ
クス6000及び5.7mg／のパーオキシターゼを含
有する試薬１mlに、0.01mlのヒト血清を添加し
た。その血清は142mg／dlの総コレステリンを含
有していた。この溶液に、ムコル・ムセド
WS90026から造つた2.5単位のコレステリンエス
テラーゼとノカルヂア エリスロポリスから造つ
たコレステリン―オキシターゼ0.1単位を加え
た。
５分後に総コレステリンの測定を終了した。標
準液を対照として、141mg／dlの値が得られた。
準液を対照として、141mg／dlの値が得られた。
実施例 ６
3mmol／のコール酸ナトリウム、
0.82mmol／の４―アミノフエナゾン、
14mmol／のフエノール、100mmol／の燐酸
ナトリウム−PH6.7、0.17mmol／のカルボワツ
クス6000及び5.7mg／のパーオキシターゼを含
有する試薬１mlに0.01mlのヒト血清を添付した。
その血清は142mg／dlの総コレステリンを含有し
ていた。この溶液に、アクチノミセス・アウレオ
ベルチリシウムWS90002から造つた2.5単位のコ
レステリンエステラーゼとノカルヂア エリスロ
ポリスから造つた0.1単位のコレステリン―オキ
シターゼを加えた。
0.82mmol／の４―アミノフエナゾン、
14mmol／のフエノール、100mmol／の燐酸
ナトリウム−PH6.7、0.17mmol／のカルボワツ
クス6000及び5.7mg／のパーオキシターゼを含
有する試薬１mlに0.01mlのヒト血清を添付した。
その血清は142mg／dlの総コレステリンを含有し
ていた。この溶液に、アクチノミセス・アウレオ
ベルチリシウムWS90002から造つた2.5単位のコ
レステリンエステラーゼとノカルヂア エリスロ
ポリスから造つた0.1単位のコレステリン―オキ
シターゼを加えた。
３分後に総コレステリンの測定を終了した。標
準液を対照として測定して143mg／dlなる値が得
られた。
準液を対照として測定して143mg／dlなる値が得
られた。
実施例 ７
3mmol／のコール酸ナトリウム、
0.82mmol／の４―アミノフエナゾン、
14mmol／のフエノール、100mmol／の燐酸
ナトリウム−PH6.7、0.17mmol／のカルボワツ
クス6000及び5.7mg／のパーオキシターゼを含
有する試薬１mlに0.01mlのひとの血清を添付し
た。その血清は142mg／dlの総コレステリンを有
していた。この溶液に、ストレプトミセス・アウ
トトロフイクスWS90011から造つた2.5単位のコ
レステリンエステラーゼとノカルヂアエリスロポ
リスから造つた0.1単位のコレステリン―オキシ
ターゼも加えた。
0.82mmol／の４―アミノフエナゾン、
14mmol／のフエノール、100mmol／の燐酸
ナトリウム−PH6.7、0.17mmol／のカルボワツ
クス6000及び5.7mg／のパーオキシターゼを含
有する試薬１mlに0.01mlのひとの血清を添付し
た。その血清は142mg／dlの総コレステリンを有
していた。この溶液に、ストレプトミセス・アウ
トトロフイクスWS90011から造つた2.5単位のコ
レステリンエステラーゼとノカルヂアエリスロポ
リスから造つた0.1単位のコレステリン―オキシ
ターゼも加えた。
３分後に総コレステリンの測定を終了した。標
準液を対照として141mg／dlの値が得られた。
準液を対照として141mg／dlの値が得られた。
実施例 ８
3mmol／のコール酸ナトリウム、
0.82mmol／の４―アミノフエナゾン、
14mmol／のフエノール、100mmol／の燐酸
ナトリウム−PH6.7、0.17mmol／のカルボワツ
クス6000及び5.7mg／のパーオキシターゼを含
有する試薬１mlに0.01mlのひとの血清を添付し
た。その血清は142mg／dlの総コレステリンを有
していた。この溶液に、カンジダ・アルビカンス
WS90021から造つた2.5単位のコレステリンエス
テラーゼとノカルヂア エリスロポリスから造つ
た0.1単位のコレステリン―オキシターゼを加え
た。
0.82mmol／の４―アミノフエナゾン、
14mmol／のフエノール、100mmol／の燐酸
ナトリウム−PH6.7、0.17mmol／のカルボワツ
クス6000及び5.7mg／のパーオキシターゼを含
有する試薬１mlに0.01mlのひとの血清を添付し
た。その血清は142mg／dlの総コレステリンを有
していた。この溶液に、カンジダ・アルビカンス
WS90021から造つた2.5単位のコレステリンエス
テラーゼとノカルヂア エリスロポリスから造つ
た0.1単位のコレステリン―オキシターゼを加え
た。
５分後に総コレステリンの測定を終了した。標
準液を対照として測定して144mg／dlなる値が得
られた。
準液を対照として測定して144mg／dlなる値が得
られた。
実施例 ９
3mmol／のコール酸ナトリウム、
0.82mmol／の４―アミノフエナゾン、
14mmol／のフエノール、100mmol／の燐酸
ナトリウム−PH6.7、0.17mmol／のカルボワツ
クス6000及び5.7mg／のパーオキシターゼを含
有する試薬１mlに0.01mlのヒト血清を添付した。
その血清は142mg／dlの総コレステリンを有して
いた。
0.82mmol／の４―アミノフエナゾン、
14mmol／のフエノール、100mmol／の燐酸
ナトリウム−PH6.7、0.17mmol／のカルボワツ
クス6000及び5.7mg／のパーオキシターゼを含
有する試薬１mlに0.01mlのヒト血清を添付した。
その血清は142mg／dlの総コレステリンを有して
いた。
この溶液にアスペルギルスspec.WS90026から
造つた2.5単位のコレステリンエステラーゼとノ
カルヂア エリスロポリスから造つた0.1単位の
コレステリン―オキシターゼを加えた。４分後に
総コレステリンの測定を終了した。標準液を対照
として測定して142mg／dlなる値が得られた。
造つた2.5単位のコレステリンエステラーゼとノ
カルヂア エリスロポリスから造つた0.1単位の
コレステリン―オキシターゼを加えた。４分後に
総コレステリンの測定を終了した。標準液を対照
として測定して142mg／dlなる値が得られた。
実施例 10
3mmol／のコール酸ナトリウム、
0.82mmol／の４―アミノフエナゾン、
14mmol／のフエノール、100mmol／の燐酸
ナトリウム−PH6.7、0.17mmol／のカルボワツ
クス6000及び5.7mg／のパーオキシターゼを含
有する試薬１mlに0.01mlのヒト血清を添付した。
その血清は142mg／dlの総コレステリンを有して
いた。この溶液にノカルヂア ルブラWS90019
から造つた2.5単位のコレステリンエステラーゼ
とノカルヂア エリスロポリスから造つた0.1単
位のコレステリン―オキシターゼを加えた。５分
後に総コレステリンの測定を終了した。標準液を
対照として測定して144mg／dlなる値が得られ
た。
0.82mmol／の４―アミノフエナゾン、
14mmol／のフエノール、100mmol／の燐酸
ナトリウム−PH6.7、0.17mmol／のカルボワツ
クス6000及び5.7mg／のパーオキシターゼを含
有する試薬１mlに0.01mlのヒト血清を添付した。
その血清は142mg／dlの総コレステリンを有して
いた。この溶液にノカルヂア ルブラWS90019
から造つた2.5単位のコレステリンエステラーゼ
とノカルヂア エリスロポリスから造つた0.1単
位のコレステリン―オキシターゼを加えた。５分
後に総コレステリンの測定を終了した。標準液を
対照として測定して144mg／dlなる値が得られ
た。
実施例 11
3mmol／のコール酸ナトリウム、
0.82mmol／の４―アミノフエナゾン、
14mmol／のフエノール、100mmol／の燐酸
ナトリウム−PH6.7、0.17mmol／のカルボワツ
クス6000及び5.7mg／のパーオキシターゼを有
する試薬１mlに0.01mlのヒト血清を添付した。そ
の血清は142mg／dlの総コレステリンを有してい
た。この溶液にペニシリウムspec.WS90028から
造つた2.5単位のコレステリンエステラーゼとノ
カルヂア エリスロポリスから造つた0.1単位の
コレステリン―オキシターゼを加えた。５分後に
総コレステリンの測定を終了した。標準液を対照
として測定して139mg／dlなる値が得られた。
0.82mmol／の４―アミノフエナゾン、
14mmol／のフエノール、100mmol／の燐酸
ナトリウム−PH6.7、0.17mmol／のカルボワツ
クス6000及び5.7mg／のパーオキシターゼを有
する試薬１mlに0.01mlのヒト血清を添付した。そ
の血清は142mg／dlの総コレステリンを有してい
た。この溶液にペニシリウムspec.WS90028から
造つた2.5単位のコレステリンエステラーゼとノ
カルヂア エリスロポリスから造つた0.1単位の
コレステリン―オキシターゼを加えた。５分後に
総コレステリンの測定を終了した。標準液を対照
として測定して139mg／dlなる値が得られた。
実施例 12
3mmol／のコール酸ナトリウム、
0.82mmol／の４―アミノフエナゾン、
14mmol／のフエノール、100mmol／の燐酸
ナトリウム−PH6.7、0.17mmol／のカルボワツ
クス6000及び5.7mg／のパーオキシターゼを含
有する試薬１mlに0.01mlのヒト血清を添付した。
その血清は142mg／dlの総コレステリンを有して
いた。この溶液にクニングハメラエレガンス
WS90025から造つた2.5単位のコレステリンエス
テラーゼとノカルヂア エリスロポリスから造つ
た0.1単位のコレステリン―オキシターゼを加え
た。
0.82mmol／の４―アミノフエナゾン、
14mmol／のフエノール、100mmol／の燐酸
ナトリウム−PH6.7、0.17mmol／のカルボワツ
クス6000及び5.7mg／のパーオキシターゼを含
有する試薬１mlに0.01mlのヒト血清を添付した。
その血清は142mg／dlの総コレステリンを有して
いた。この溶液にクニングハメラエレガンス
WS90025から造つた2.5単位のコレステリンエス
テラーゼとノカルヂア エリスロポリスから造つ
た0.1単位のコレステリン―オキシターゼを加え
た。
６分後に総コレステリンの測定を終了した。標
準液を対照として測定して143mg／dlなる値が得
られた。
準液を対照として測定して143mg／dlなる値が得
られた。
Claims (1)
- １ アクチノミセス属、ストレプトミセス属、カ
ンジダ属、クニングハメラ属、ムコル属、ベニシ
リウム属およびアスペルギルス属の何れか１つの
属に属する微生物由来のコレステリンエステラー
ゼを用いて結合型コレステリンからコレクテリン
を遊離せしめることを特徴とする、結合型コレス
テリンを齢化し、続いて遊離したコレスリンを酵
素的又は化学的な方法により測定する結合型もし
くは全コレステリンの定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP49035128A JPS6134800B2 (ja) | 1974-03-28 | 1974-03-28 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP49035128A JPS6134800B2 (ja) | 1974-03-28 | 1974-03-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5027593A JPS5027593A (ja) | 1975-03-20 |
| JPS6134800B2 true JPS6134800B2 (ja) | 1986-08-09 |
Family
ID=12433281
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP49035128A Expired JPS6134800B2 (ja) | 1974-03-28 | 1974-03-28 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6134800B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0372698A (ja) * | 1989-04-05 | 1991-03-27 | Sanyo Electric Co Ltd | 部品供給装置 |
| JPH0396097U (ja) * | 1990-01-22 | 1991-10-01 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AR195000A1 (es) * | 1972-05-17 | 1973-08-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Procedimiento para la determinacion de colesterol |
| SU1168103A3 (ru) * | 1973-03-28 | 1985-07-15 | Берингер Маннхайм Гмбх (Фирма) | Способ определени общего холестерина в сыворотке крови |
| JPS50150496A (ja) * | 1974-05-22 | 1975-12-02 | ||
| JPS5214490A (en) * | 1975-07-24 | 1977-02-03 | Ono Pharmaceut Co Ltd | Composite and process for total blood cholesterol determination |
| DE2649749A1 (de) * | 1976-10-29 | 1978-05-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagens zur bestimmung von gesamtcholesterin oder gebundenem cholesterin |
| CA1104041A (en) * | 1977-02-03 | 1981-06-30 | Charles T. Goodhue | Hydrolysis of protein-bound cholesterol esters |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS502594A (ja) * | 1973-03-01 | 1975-01-11 |
-
1974
- 1974-03-28 JP JP49035128A patent/JPS6134800B2/ja not_active Expired
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS502594A (ja) * | 1973-03-01 | 1975-01-11 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0372698A (ja) * | 1989-04-05 | 1991-03-27 | Sanyo Electric Co Ltd | 部品供給装置 |
| JPH0396097U (ja) * | 1990-01-22 | 1991-10-01 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5027593A (ja) | 1975-03-20 |
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