SU664536A3 - Реактив дл определени холестерина - Google Patents

Description

торы и поверхностно-активные вещества. Все эти добавки обычно примен ютс  в системах дл  обнаружени  нерекнси водорода соответственно холестерина. Преимущественно в упом нутых выше комбинапи х реагентов отдельные составные части содержатс  в следующих соот ношени х: 1.От 13 до 150 об. холестеран-окси дазы, а также от 2 «10 до 5- мерческой каталазы, от 0,О5 до 6,2 мл| ацетилацетрна и от 2 до 10 мл метилового спирта добавл ют в 100 мл буфера, содержащего ионы аммони  (рН 5-7). За тем добавл ют 0,02-О,3 мл поверхностно-активного вещества (предпочтительно гидроксиполвэтоксидодекана}. 2,От 3 до 40 об. холестегрин-оксидазы , а также от 2 10 до 1 «10 коммерческой пероксидазы, от 5О до 200 мг 2,2 .«манобенэтиааолннсул1 фокислоты, а также от 0,05 до 0,5 мл повер сностноактивного вещества (предпочтительно гидри оксиполиэтоксндекана) добавл ют в 100мл ;буфера (рН 6-8, 3,От 0,1 до 1 об, холестерин-оксидааы , от 1 до 5 мл 1 М раствора 2,4-ди- Нйтрофенилгидразина и, в некоторых случа Ях, от 0,005 до 0,1 мл поверхностно-ак- тивного вещества, 4.От 2 до 100 od холестерин-оксида- эы, а также от 0,1 до 2,0 мл поверхност но-активного вещества (преимущественно гйдроксипблиэтоксидодшсана) добавл ют в 50 мл буфера (рН 5-9) преимущественным образом 0,5 М натрийфосфатного бу|фера (рН 7,5), Холестерин-оксйдаэа npefjf ставл ет собой фермент, который катализирует реакцию: О хопестерин-оксидаза Холестерин + холестенон + Реакци  протекает количественно, благодар  чему возможно абсолютно специфи- Ч1вское н точное количественное определение холестерина. Реактив пригоден дл  определени  холестерина в таких водных средах, тракты продуктов питани  жидкости, содер жащиес  в теле, в особенности сыворотки, Благодар  большой специфичности реактива может быть произведено определение только свободного холестерина. Однако св занный холестерин, который как извест но находитс  в этерифицированной форме, равным образом может быть определен после предварительного химического или ферментативного омылена . Химическое 3в .4 омыление проводит, например, под деист- Ёйем спиртового раствора гидроокиси кали , а ферментативное омыление - эстера- ЗОЙ, преимущественно холестерин-остеразой , полученной из печени или поджелудочной железы. Пример 1, Определение по перекиси водорода. Гидрофосфат аммони  (10 г) pacTBOpHiют в 100 мл воды и посредством прибавпени  85%-«ой фосфорной кислоты устанавливают значение рН 7,0, Затем прибавл ют 10 ор, каталазы. Приготовленным раствором довод т смесь, содержащую 0,2 мл адетилацетона и 10 мл метиловото спирта, до 1ОО мл, .Затем 7,5 мл полученного раствора смешивают с 0,5 мл Сыворотки, соответствеЕио с 0,5 мл стандартного раствора холестершш, содержащего 200 мл % холестерина, Аликвотные с)личества растворов, содержащих сыворотку , а также стандаргн6г раство ра Хйпестерина смещивают в каждом случае с 5 об, холестерин-оксидазы и 0,02 мл 10%-ного раствора гидроксйполиэтоксидодекана в выдерживают смеси в течение 70 мин при , Затем фотометрически определ ют коли- «jecTBO образовавшегос  красител  при 405 нм. Со стандартным раствором .холестерина стро т калибровочную кривую. Содержание холестерина в пробе, содержащей сыЁоротку, определ ют при использований стандарта в качестве величиныдл  сравнени . Контрольное определение, проведенное по Лиеберману и Бурхарду, дает Ътклонение примерно 5%, Пример 2, Определение перек.иси водорода, К 3 мл калийфосфатного буфера с рН 7 (насыщен кислородом/, вГкотОром содержитс  100 мг % 2,21 минобензтиазолинсульфоксилоты , прибавл ют 0,05 мл 20%-ного раствора гидроксиполиэтоксидодекана и 0,02 мл коммерческого раствора пероксидазы , а также 0,02 мл перекиси водорода дл  удалени . Восстанавливающихс  веществ . За смесью наблюдают с помощью фотометра в области 405 нм или 436 нм. Как только реакци  подходит к завершению , прибавл ют 0,01 мл сыворотки (разбавленной водой в соотношении 1:15), Спуст  10 мин прибавл ют 0,15 об, холестерин-оксидазы и спуст  еще 10 мин определ ют разность экстинкций. Точно таким же способом, но при использовании стандартного раствора холестерина с содержанием 200 мг % стро т