JPH04200396A - 過酸化水素の酵素学的高感度測定法及びそのための試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は過酸化水素の酵素学的高感度測定法及びそのた
めの試薬に係り、主として体液を検体として種々の生化
学物質や酵素等を定量する臨床検査に利用される。

（従来の技術） 過酸化水素の酵素学的測定は、現在、臨床検査分野にお
いて日常的なものとなっている。体液、例えば血清や尿
を検体として生化学物質や酵素を定量する場合に酸化酵
素を用いて過酸化水素を発生させ、更にペルオキシダー
ゼやカタラーゼを用いて呈色反応に導く酵素的測定法が
開発使用されている。

過酸化水素の発生を利用して定量を行う生化学物質と使
用する主な酸化酵素との関係は下記の通りである。

ａ）アミラーゼ活性： α−グリコシダーゼ及びグルコースオキシダーゼ ｂ）グアナーゼ活性： キサンチンオキシダーゼ及びウリカーゼＣ）グルコース
　ニ ゲルコースオキシダーゼ ｄ）クレアチニン　： クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ及びサルコシンオキ
シダーゼ ｅ）コリンエステラーゼ活性： コリンオキシダーゼ ｆ）コレステロール： コレステロールオキンダーゼ ｇ）コレステロールエステル： コレステロールエステルヒドロラーゼ及びコレステロー
ルオキノダーゼ ｈ）中性脂肪： リパーゼ及びグリセロールオキシダーゼ１）　　）ラン
スアミナーゼ活性： ピルビン酸オキ／ダーゼ ｊ）遊離脂肪酸ニ アシルＣｏＡシンセターゼ及びアシルＣｏＡオキシダー
ゼ ｋ）乳酸： 乳酸オキシダーゼ ｌ）尿酸： ウリカーゼ ｍ）尿素： ウレアーゼ及びグルタミン酸オキシダーゼｎ）燐脂質： ホスホリパーゼＤ及びコリンオキサダーゼ０）ビリルビ
ン　： ビリルビンオキシダーゼ。

発生した過酸化水素を利用する呈色反応は下記の通りで
ある。

Ａ　ペルオキシダーゼ　ＰＯＤ　　　　いるＨ２０ａ　
　＋　　ＤＨ２−÷Ｄ　　＋　　２１ｉ２０（ＤＨａ　
：色原体） Ｂ　カタラーゼ　　いる 発生した過酸化水素により、例えばメタノールを酸化し
てホルムアルデヒドとなし、アセチルアセトンとアンモ
ニウム塩とを添加してハンプ（Ｈａｎｔｚ）反応により
縮合させて呈色に導く方法があり、この方法を反応式で
示せば下記の通りである。

Ｈ２Ｏ２＋　　　ＣＨｓＯＨ−−→−ＨＣＢＯ＋　　　
２１ｈＯＨＣＨＯ＋２ＣＨＩＣＯＣ１１２ＣＯＣＨ２＋
ＭＨｚ−一一−−−−−−う−上記の両方法の内でカタ
ラーゼを用いる方法は測定所要時間が長く、測定の自動
化が困難であるために、−船釣にはＰＯＤを用いる方法
が採用されている。

このＰＯＤを用いる呈色反応において最も汎用されてい
るのは、ＰＯＤの存在下に各種の水素供与体と　４−ア
ミンアンチピリン　（以下、ｒ４−ＡＡＪと略記する）
、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン　（
以下、ｒ　ＭＢＴＨＪと略記する）等のカップラーとを
縮合反応させ、酸化発色系に導く方法である。

この場合の水素供与体としてはフェノール、４−クロロ
フェノール、２，４−ジクロロフェノール及ヒそのスル
ホン化誘導体、２，４−ジブロムフェノール、２．６−
ジクロロフェノール、２，４．ｌ１ｉ−）リブロムフェ
ノール、３１５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンス
ルホン酸、３−ヒドロキ７−２．４．６−　）リョード
安息香酸、等のフェノール系物質；Ｎ、Ｎ−ジメチルア
ニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシエチル）−ｍ＝トルイジン、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ”−アセチルエチ
レンジアミン、Ｎ、Ｎ−ジメチル＝ｍ−ア二ノジン、ア
ルキルスルホン酸やヒドロキシアルキルスルホン酸によ
るアニリンのＮ−置換体等のアニリン系物質を用いるこ
とができる。

（従来技術の利点と課題） カップラーとして４−ＡＡを用いる方法は、ＭＢＴＨを
用いる方法よりも測定感度において低いが、呈色体の測
定波長が比較的短波長側にあり、適用し得るｐｉ（範囲
が広く、試薬の安定性も良好であるために汎用されてい
る。しかしながら、還元型ニコチンアミドヌクレオチド
等の還元性物質が反応系に共存すると、当該還元性物質
の還元作用を受は易く、発色が生じなかったり、呈色の
程度が抑制される点にこの方法の課題がある。

一方、カップラーとしてＭＢＴＨを用いる方法は測定感
度が高く、測定波長が高波長側にあり、呈色状態も安定
しており、還元性物質が反応系に共存してもその影響を
受は難いと云う利点ををしているために、高感度化に宵
効な方法とされているが、ＭＢＴＨ試薬自体が不安定で
あり、経時変化による検体ブランク値の上昇が太き（、
実用上において酸性側でしか利用できない点に課題があ
る。

（発明の目的） 従って、本発明の主たる目的は、試薬の不安定な点を除
けば種々の利点を有しているＭＢＴＨをカップラーとし
て用いる方法において、中性乃至弱アルカリ性のｐＨ領
域においても経時変化による検体ブランク値の上昇を抑
えることができ、このような測定ｐＨ領域でも　カップ
ラーとして４−ＡＡを用いるよりも高感度での過酸化水
素の測定を可能にする方法を提供することにある。

本発明の附随的な目的は、この測定法を実施するための
試薬、殊にＭＢＴＨ試薬を提供することにある。

（課題を解決し、目的を達成する手段及び作用）本発明
者等は、過酸化水素測定用の発色系でカップラーとして
ＭＢＴ）Ｉを用いる方法において、如何なる状況の場合
に、検体ブランク値の経時的な上昇が生じるのかについ
て並びにその不安定化を生じさせる要因が何であるかに
ついて鋭意検討した。

即ち、先ず１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐａｌ　７．０）中に
、ペルオキシダーゼ３．５０／ｍｌ、　０．５ｍＭ　Ｍ
ＢＴＨ，０，５ｍＭＡＤＰＳ　（Ｎ−エチル−Ｎ−スル
ホプロピル−ｍ−アニンジン）及び場合により　０．５
１ｎＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａを添加して３７℃の条件下に
おいて混合し、波長５４０ｎｏで吸光度を測定して初期
吸光度とし、その後の変化量（ブランク値の上昇）を調
べ、更に混合後の試薬を冷蔵保存して経口的な変化を同
様に調べた。結果は下記の表１に示される通りであった
。

この試験を通じて、検体ブランク値の上昇には、２種類
の現象が係わっていることが判明した。即ち、その一つ
は発色試薬混合後の経時的な吸光度の上昇であり、他の
一つは使用するＭＥＴ）Ｉ溶液が調製後時間が経過する
につれて初期吸光度を上昇させることである。尚、これ
らの現象は、従来から報告されているように、中性乃至
アルカリ性領域において顕著であり、酸性領域（ｐＨ５
以下）においては発現の程度が低かった。

この不安定化要因について種々検討を重ねた結果、前者
は主として反応液中に含まれる微量金属による酸化が原
因と考えられ、又後者はＭＢＴＩ（溶液中において生成
される内因性過酸化水素、即ちＭＢＴＨ中の溶存酸素が
ＭＢＴ■自体又はＭＢＴＨ溶液中の夾雑過酸化物等によ
り酵素ラジカルになされ、それが更に水分子と反応して
過酸化水素となり、これが原因でペルオキシダーゼや酸
化発色剤（フェノール類、トリンダー試薬等）との混合
時に、初期吸光度を上昇させるものと推定されるに至っ
た。尚、特開昭５８−８９９公報には「Ｈ２Ｏ２又はＨ
２Ｏ２供与系を検出するための安定化された試薬」が開
示されており、安定化剤としてアルカリフェロシアン化
物、キレート剤及びアルカリアジド類が膏効である旨記
載されているが、このような剤を添加したたけでは充分
なものとは云えず、従って測定精度高く且つ安定なもの
となすためには、更に上記の２種の不安定化要因を排除
乃至抑制することが肝要なのである。

これらの観点に立ち、キレート剤としてのエチレンジア
ミン四酢酸類を共存させて反応液中に含有される微量金
属をマスキングすると共に、更にＭＢＴＨ溶液中の溶存
酸素から生じる過酸化水素の消去法を確立することがで
きるならば、中性やアルカリ性領域でも検体ブランク値
の上昇を抑制し、高感度測定が可能となるとの仮定の下
に、本発明者等は更に検討を重ねた。その結果、反応時
にエチレンジアミン四酢酸類を共存させ且っＭＢ丁■溶
液にカタラーゼを加えることにより、検体ブランク値の
異常上昇、即ち発色系試薬混合後の経時的な吸光度上昇
と、試薬混合後の初期吸光度の上昇との両者を著しく抑
制し得ること並びに上記のエチレンジアミン四酢酸類及
びカタラーゼの添加及び反応系におけるこれらの共存が
発色系に何等悪影響を及ぼさないことを見い出して本発
明を完成するに至った。

従って、本発明による過酸化水素の酵素学的測定法は３
−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン　（ＭＢ
ＴＩＩＩ）をカップラーとし、酸化発色剤とペルオキシ
ダーゼとの組合せで発色させるものであって、酸化縮合
による呈色反応を中性乃至弱アルカリ領域で行う場合に
３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン　（Ｍ
ＢＴＨ）含有試薬としてカタラーゼを含有しているもの
を用い、反応時にエチレンジアミン四酢酸類を共存させ
、高感度測定を゛もたらすことを特徴としており、これ
により既述の主目的が達成される。

本発明の既述の附随的目的は、緩衝液と、３−メチル−
２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン　（ＭＢＴｌｌ）と
、カタラーゼとを含有していることを特徴とする、過酸
化水素の酵素学的高感度測定用の３−メチル−２−ベン
ゾチアゾリノンヒドラゾン　（ＭＢＴＨ）含有試薬によ
り達成される。

本発明方法を実施する場合に、酸化発色剤としでは既知
のフェノール類やトリンダー試薬を用いることかでき、
下記に例示するようにフェノールを用いればキノン染料
が生成し、トリンダー試薬を用いればインダミン染料が
生成する。

ＭＢＴＨ Ｈ３ フェノール　　　　　　キノン染料 トリンダー試薬　　　　　　　インダミン染料本発明方
法が適用可能な測定ｐＨ領域は弱酸性からｐＨ約１０程
度のアルカリ性領域迄であるが、ｐＨ５，５−９，５迄
の領域であるのが好ましい。

ＭＢＴ［Ｉ含有試薬中のカタラーゼ量としては該試薬１
ｍｌ当り少なくとも約１０単位である。カタラーゼは過
酸化水素分解酵素であり、このカタラーゼとしては精製
度が充分に高いものであれば動物、植物、微生物の起源
を問わずに本発明方法において用いることができる。

尚、エチレンジアミン四酢酸類としては、エチレンジア
ミン四酢酸、そのナトリウム塩、カリウム塩、アンモニ
ウム塩、リチウム塩等を用いることができ、１．２−７
クロヘキンレンジニトリロテトラ酢酸等を用いることも
できる。

（実施例） 次に、本発明の実施例として、ＭＢＴＨ試液にカタラー
ゼを添加して調製した本発明によるＭＢＴＨ含有試薬の
初期吸光度の経口的変化を測定し　（実施例１）及びグ
ルコース測定時の反応タイムコースを測定することによ
り　（実施例２）により、本発明を更に詳細に且つ具体
的に説明する。

夫丘五」 ■、試薬 （ａ）　ＭＢＴＨ含有試薬 ＭＢＴＨ２，２ｍｇと、カタラーゼ０−２００００単位
とを５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＥＩ　８．０．０．５ｍＭ
　ＥＤＴＡ４Ｎａを含有）　１０ｍ１に溶解することに
より調製したもの。

（ｂ）　ＡＤＰＳ試薬 ＡＤＰＳ　３．Ｏｍｇと、ベルオキンダーゼ７０単位と
を５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８，０，０，５ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ４Ｎａを含有）　１０ｍ１に溶解することにより調
製したもの。

２、方法 ＭＢＴＨ含宵試薬とＡＤＰＳ試薬とを等量採取して混合
し、３７°Ｃにおいて３０秒経過した後の吸光度（初期
吸光度）を測定波長５４０ｎｍて測定した。次いて、こ
の混合液を遮光下に４°Ｃで保存し、２．３及び６日後
に取り出し３７°Ｃにおいて３０秒経過した後の吸光度
（初期吸光度）を上記と同様に測定することにより経口
的な初期吸光度の変化を調べた。

３、結果及び考察 結果は下記の表２に示される通りであり、カタラーゼを
含有する本発明によるＭＢＴＨ含有試薬においては初期
吸光度の経口的な上昇が有意に抑制されることが判明し
た。この抑制効果は、カタラーゼ量を高める程増加する
が、ＭＢＴｌｉ含宵試薬１ｍ１当りカタラーゼを１０単
位以上含有させれば所期の抑制効果がもたらされ、カタ
ラーゼを１０単位含有させた場合における抑制の程度は
カタラーゼを含有しないＭＢＴＩＩ溶液と比較する場合
に６日経過後で約１／６であった。

災１１ １．試薬 （ａ）第１試薬（カタラーゼ含有ＭＢＴＨ試薬）ＭＢＴ
Ｈ１，Ｉｍｇと、カタラーゼ８５００単位とを５０ｍＭ
燐酸緩衝液（ｐｉｌ　７．０．０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ・
２Ｎａを含［）ＩＯｍｌに溶解することにより調製した
もの。

（ｂ）第１Ａ試薬（カタラーゼ不含ＭＢＴＨ試薬）ＭＢ
ＴＨ１，１ｍｇを５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０，０
，５ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａを含有）　ＩＯ＋ｎｌに溶
解することにより調製したもの。

（ｃ）第２試薬 グルコースオキシダーゼ３８００単位と、ベルオキシダ
−セフ００単位と、ＴＯＯＳ　２０ｍｇとを５０ｍＭ燐
酸緩衝液（ｐＨ７，０，０，５ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ
を含有）ＩＯｍｌに溶解することにより調製したもの。

ＴＯＯＳ　：　Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル−ｍ−トルイジン （ｄ）グルコース液 グルコース４０ｍｇを精製水１００ｍ１に溶解すること
により調製したもの。

２、方法 ３７°Ｃにおいてグルコース液又は精製水２０μｌと第
１試薬とを混合し、５分間放置した後に、第２試薬０．
２ｍｌを添加し、更に５分間放置し、次いで測定波長５
９０ｎｍで吸光度変化（反応タイムコース）を測定した
。

対照として、上記と同様に、但し第１試薬の代わりに第
１Ａ試薬を用いた場合に関して吸光度変化を調べた。

３、結果及び考察 結果は第１図に示される通りであり、カタラーゼ不含の
第１Ａ試薬を用いた場合には、検体（グルコース）ブラ
ンクに関して、第２試薬を添加した直後に急激な吸光度
上昇が認められた（本願明細書において既述の「初期吸
光度」とは、この上昇時点の吸光度を指称している）。

尚、この急激な吸光度上昇は、既述のように、反応溶液
中に生成した内因性過酸化水素に起因するものと推定さ
れる。

一方、カタラーゼを含有する第１試薬を用いる本発明方
法の場合には、検体ブランクに関する急激な吸光度上昇
現象は生じることがなく、良好な反応タイムコースを示
した。

このことから、試薬の不安定に起因する、検体ブランク
値の上昇に伴う定量精度の低下を、本発明方法によれば
を効に回避し得るものと推論される。

（発明の効果） ＭＢＴＨをカップラーとし、酸化発色剤とペルオキシダ
ーゼとの組合せで発色させる方法は感度が高（、異常検
体（ビリルビン、溶血、孔度検体）の場合にも影響を受
は難い長波長側で測定することができ、又測定系に場合
により還元性物質が共存しても影響を受は難い等の利点
ををしているが、ＭＢＴ）！自体が溶液状態で不安定で
あり、検体ブランク値の経時的な上昇もあり、実用上測
定領域が酸性以外の場合には使用不可能であり且つ保存
性を存していなかった。

本発明方法によれば、殊にＭＢＴ）Ｉ含有試薬として、
カタラーゼを含有するものを用いる結果、当該試薬の安
定性が顕著に改善されて保存性がもたらされると共に、
測定領域が中性乃至アルカリ性領域の場合において安定
な発色が可能となり、しかもカップラーとしてＭＢＴＨ
を用いる場合の上述の利点が何等損なわれない。

従って、本発明による測定法及び試薬は、検体として殊
に体液を用いる種々の生化学物質、酵素等の高感度臨床
検査に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はグルコースオキノダーゼと３−メチル−２−ベ
ンゾチアゾリノンヒドラゾンとを用いる過酸化水素発色
系を組み合わせて、グルコースを測定する際の反応タイ
ムコースを示すグラフであり、カタラーゼが測定系に共
存する場合と共存しない場合における差異を示すもので
ある。 時間（ｓｅｃ） Ａ：カダう−だ’ＯＵ／ｍｌ Ｂニア７タラーｔ’８５０Ｕ／ｍｌ Ｃ：　カタ−７−ｔ”ＯＬＪ／ｍｌ　ｎと、Ｆｔｆｉブ
ラ＞７Ｄ、カダフーｔ”８５０Ｕ／ｍｌのと６のアつン
フ手続補正書（自発） 平成３年１１月１８日

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン
   をカップラーとし、酸化発色剤とペルオキシダーゼとの
   組合せで発色させる過酸化水素の酵素学的測定法におい
   て、酸化縮合による呈色反応を中性乃至弱アルカリ性領
   域で行う場合に３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒ
   ドラゾン含有試薬としてカタラーゼを含有しているもの
   を用い、反応時にエチレンジアミン四酢酸類を共存させ
   ることを特徴とする、過酸化水素の酵素学的高感度測定
   法。
2. （２）呈色反応をｐＨ５．５−９．５の領域で行うこと
   を特徴とする、請求項（１）に記載の過酸化水素の酵素
   学的高感度測定法。
3. （３）３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン
   含有試薬が１ｍｌ当りカタラーゼを少なくとも約１０単
   位含有していることを特徴とする、請求項（１）又は（
   ２）に記載の過酸化水素の酵素学的高感度測定法。
4. （４）緩衝液と、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン
   ヒドラゾンと、カタラーゼとを含有していることを特徴
   とする、過酸化水素の酵素学的高感度測定用の３−メチ
   ル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン含有試薬。
5. （５）１ｍｌ当りカタラーゼを少なくとも約１０単位含
   有していることを特徴とする、請求項（５）に記載の過
   酸化水素の酵素学的高感度測定用の３−メチル−２−ベ
   ンゾチアゾリノンヒドラゾン含有試薬。