JPS6237960B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
（産業上の利用分野）
本発明は体液中の基質または酵素活性の定量方
法に関するものである。 （従来の技術） 近年、臨床検査において体液中の基質量または
酵素活性を定量する方法として、基質または酵素
反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ、
生成する過酸化水素を測定する方法が盛んに用い
られている。 これらの過酸化水素の測定方法として、ペルオ
キシダーゼの酵素作用により、(1)４―アミノアン
チピリン、３―メチル―２―ベンゾチアゾリノン
ヒドラジン等のカツプラーと(2)フエノール誘導
体、アニリン誘導体またはナフトール誘導体等の
色原体とを酸化縮合させて発色体とし、その光学
的吸光度を測定する方法が用いられている。この
方法は操作が簡単であるという特徴を有してい
る。 （発明の解決しようとする問題点） ところが、最近、この測定方法を用いたコレス
テロールエステル、トリグリセライド、アミラー
ゼ、GOT、GPT等の臨床診断において、体液中
の遊離コレステロール、遊離グリセロール、ブド
ウ糖、ピルビン酸等を誤差として計り込むことが
問題になつている。 （問題点を解決するための手段） 本発明者等は体液中の遊離コレステロール、遊
離グリセロール、ブドウ糖、ピルビン酸等の計り
込みを防止し、正確に目的とするコレステロール
エステル、トリグリセライド等の基質またはアミ
ラーゼ、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナ
ーゼ（GPT）、グルタミン酸オギザロ酢酸トラン
スアミナーゼ（GOT）等の酵素活性を定量する
ことを目的として、種々鋭意検討したところ、本
発明に到達した。 すなわち本発明は試料中の基質又は酵素の酵素
反応により生成した物質(A)に酸化酵素を作用さ
せ、生成する過酸化水素をペルオキシダーゼの存
在下、色原体およびカツプラーと反応させ、光学
的吸光度測定することにより、試料中の基質また
は酵素活性を定量する方法において、(i)酸化酵素
と(ii)ペルオキシダーゼと(iii)下記一般式()で表わ
されるフエノール誘導体を含む試液を第１試液と
し、(iv)カツプラーを含む試液を第２試液とし、試
料に第１試液を加えた後、第２試液を加え光学的
吸光度測定することを特徴とする基質又は酵素活
性の定量方法である。 一般式()： （式中、R1は炭素原子数が１〜５である低級アル
キル基、あるいは水酸基またはスルホン酸基を有
する炭素原子数が１〜５である低級アルキル基、
R2は水素、ハロゲンまたは炭素原子数が１〜
５である低級アルキル基、炭素原子数が１〜５
である低級アシル基、炭素原子数が１〜５であ
る低級アルキルエーテル基あるいは炭素原子数
が１〜５である低級アルコシキシカルボニル基を
示す。ｎ＝０〜４である。） 本発明では、上記第１試液を加えた後、第２試
液を加えることにより、体液中の遊離コレステロ
ール、遊離グリセロール、ブドウ糖、ピルビン酸
等の計り込みを防止し、簡便且つ正確に目的とす
る基質又は酵素活性を測定することが可能となつ
た。体液中の遊離コレステロール、遊離グリセロ
ール、ブドウ糖、ピルビン酸等は酸化酵素が作用
して過酸化水素を生成し、この過酸化水素はペル
オキシダーゼの存在下、フエノール誘導体が反応
（自己縮合反応）して可視部に吸収を示さない化
学物質に変換され、目的とする基質又は酵素活性
を測定する反応系に関与しないものと考えられ
る。 逆に第２試液を加えてから第１試液を加える
と、目的が達成されない。また４―アミノアンチ
ピリンを酸化酵素、ペルオキシダーゼとともに含
む試液を第１試液とし、フエノール誘導体を含む
試液を第２試液とし、第１試液を加えてから第２
試液を加えても目的は達成されない。例えばトリ
グリセライド測定において、グリセロキナーゼと
グリセロリン酸オキシダーゼを用いて生成した過
酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、４―アミ
ノアンチピリンと反応（自己縮合反応）させた
後、リパーゼとフエノール誘導体を加え発色体を
生成して、真のトリグリセライドのみを比色測定
しようと試みた。しかし、この方法では第１反応
である４―アミノアンチピリンと遊離グリセロー
ルとの反応（自己縮合反応）で可視部に吸収を有
する物質（測定波長に影響を与える物質）が生成
し、第２反応で生成した発色体の比色測定に正誤
差となり、問題が生じた。 また、真のトリグリセライドを測定する方法と
して、遊離グリセロール値を計り込んだ総トリグ
リセライド値と遊離グリセロール値を各々測定
し、その差を求める方法があるが、簡易性の点で
問題があつた。本発明は上記方法より簡易性の点
で優れる。 本発明方法は試料中の基質又は酵素の酵素反応
により生成した物質(A)に酸化酵素を作用させ、生
成する過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、
色原体およびカツプラーと反応させ、光学的吸光
度測定することにより、試料中の基質又は酵素活
性を定量する方法である。 定量する基質としては、体液中のコレステロー
ルエステル、トリグリセライド、クレアチニン、
クレアチニンなどがある。 定量する酵素としては、体液中のアミノトラン
スアミナーゼ、例えばグルタミン酸オギザロ酢酸
トランスアミナーゼ（GOT）、グルタミン酸ピル
ビン酸トランスアミナーゼ（GPT）、アミラーゼ
などがある。 酵素反応により生成した物質(A)としては、コレ
ステロールエステルにコレステロールエステラー
ゼを作用させて生成したコレステロール、トリグ
リセライドにリパーゼを作用させて生成したグリ
セロール、グリセロールにグリセロキナーゼを作
用させて生成したグリセロール―３―リン酸、α
―ケトグルタル酸とアラニンにグルタミン酸ピル
ビン酸トランスアミナーゼ（GPT）を作用させ
て生成したピルビン酸、デンプンまたはγ―サイ
クロデキストリンを基質として、アミラーゼ、グ
ルコアミラーゼを作用させ生成したブドウ糖など
がある。 上記基質又は上記酵素反応により生成した物質
(A)に作用させる酸化酵素としては、コレステロー
ルオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、グ
リセロリン酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダ
ーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、グリコースオキ
シダーゼなどがある。 本発明に用いる一般式()で表わされるフエノ
ール誘導体としては、たとえばｐ―クレゾール、
ｐ―エチルフエノール、４―ｎ―プロピルフエノ
ール、ｐ―イソプロピルフエノール、ｏ―クロロ
―ｐ―クレゾール、ｍ―クロロ―ｐ―クレゾー
ル、２，４―ジメチルフエノール、２，４―ジエ
チルフエノール、３，４―ジエチルフエノール、
２，４，６―トリメチルフエノール、ｍ―ヒドロ
キシメチル―ｐ―クレゾール、２―メトキシ―４
―メチルフエノール、２―アセチル―４―メチル
フエノール、２―メトキシカルボニル―４―メチ
ルフエノール、３―スルホプロピル―４―エチル
フエノールなど、ｐ―ヒドロキシメチルフエノー
ル、ｐ―ヒドロキシエチルフエノール、ｐ―スル
ホキシメチルフエノール、ｐ―スルホキシエチル
フエノール、２−メトキシ−４−スルホメチルフ
エノール３−クロロ−４−ヒドロキシメチルフエ
ノール、―メチル―４―ヒドロキシメチルフエノ
ール、２，４―ジヒドロキシメチルフエノール、
３，４―ジヒドロキシメチルフエノール、２―ア
セチル―４―ヒドロキシメチルフエノール、３―
メトキシ―４―ヒドロキシメチルフエノール、３
―メトキシカルボニル―４―ヒドロキシメチルフ
エノール、２―メチル―４―スルホメチルフエノ
ールなどがある。 本発明に用いるカツプラーとしては、４―アミ
ノアンチピリン、３―メチル―２―ベンゾチアゾ
リンヒドラジン等がある。 本発明に用いる試薬は(i)酸化酵素と(ii)ペルオキ
シダーゼと(iii)フエノール誘導体を含む試液を第１
試液とし、(iv)カツプラーを含む試液を第２試液と
する。 (iv)カツプラーを含む第２試液には、試料中の定
量しようとする基質を酸化酵素の基質となる物質
(A)に変換させる酵素又は試料中の定量しようとす
る酵素に作用して、酸化酵素の基質となる物質(A)
に変換する物質を含む。 試料中の定量しようとする基質に直接作用し、
酸化酵素の基質となる物質に変換させる酵素とし
ては、コレステロールエステラーゼ、リパーゼお
よびグリセロキナーゼ、クレアチニンデイミナー
ゼ、クレアチミンデイスミダーゼなどがある。 試料中の定量しようとする酵素に作用して、酸
化酵素の基質を含む物質(A)に変換する物質として
はα―ケトグルタル酸とアラニン、デンプン又は
γ―サイクロデキストリンなどがある。 第２試液にはアニリン誘導体が含まれていても
よい。アニリン誘導体としては、アニリン、Ｎ，
Ｎ―ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ―ジエチルアニリ
ン、Ｎ，Ｎ―ジエチル―ｍ―トルイジン、Ｎ，Ｎ
―ジメチルｍ―アニシジン、Ｎ―エチル―Ｎ―
（３―メチルフエニル）―N′―アセチルエチレジ
アミン、Ｎ―エチル―Ｎ―（β―ヒドロキシエチ
ル）―ｍ―トルイジン、Ｎ―エチル―Ｎ―（２―
ヒドロキシ―３―スルホプロピル）―ｍ―トルイ
ジン、Ｎ―エチル―Ｎ―スルホプロピル―ｍ―ト
ルイジン、Ｎ―エチル―Ｎ―スルホプロピル―
３，５―ジメトキシアニリン、Ｎ―エチル―Ｎ―
（２―ヒドロキシ―３―スルホプロピル）―３，
５―ジメトキシアニリン、Ｎ―エチル―スルホプ
ロピル―ｍ―アニシジン、Ｎ―エチル―Ｎ―（２
―ヒドロキシ―３―スルホプロピル）―ｍ―アニ
シジン等がある。 第１試液および第２試液には前記成分に加え
て、緩衝剤、および必要により界面活性剤、安定
化剤等を含む。緩衝剤としては通常のものが使用
され、第１試液および第２試液のPHを通常５〜10
に調製するものが好ましい。 フエノール誘導体の含有量は第１試液において
１×10-5〜１×10-2Mである。カツプラーの含有
量は第２試液において１×10-6〜１×10-2Mであ
る。 本発明に用いる試薬には、他の酵素、基質、各
種安定剤、妨害物質除去のための試薬、界面活性
剤等を含んでいてもよい。 次に基質又は酵素活性について具体的に説明す
る。本発明はこれらの具体的に説明されるものに
限定されない。 基質として例えばコレステロールエステルを測
定するには、第１試液として、コレステロールオ
キシダーゼ、ペルオキシダーゼとフエノール誘導
体と緩衝剤を含む試液を調製し、第２試液として
コレステロールエステラーゼと４―アミノアンチ
ピリンと緩衝剤を含む試液を調製する。試料に第
１試液を作用させ、遊離コレステロールから生成
した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、フ
エノール誘導体と反応（自己縮合）させた後、第
２試液を作用させ、コレステロールエステルから
生成したコレステロールのみから生成した過酸化
水素にペルオキシダーゼの存在下、色原体と４―
アミノアンチピリンを作用させて発色体を得、こ
れを比色定量する。 基質として例えばトリグリセライドを測定する
には、第１試液としてグリセロールオキシダー
ゼ、ペルオキシダーゼとフエノール誘導体と緩衝
剤を含む試液、又はグリセロールキナーゼ、グリ
セロリン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼとフ
エノール誘導体と緩衝剤を含む試液を調製し、第
２試液としてリポプロテインリパーゼと４―アミ
ノアンチピリンと緩衝剤を含む試液を調製する。
試料に第１試液を作用させて、遊離グリセロール
から生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存
在下、フエノール誘導体と反応（自己縮合）させ
た後、第２試液を作用させ、トリグリセライドか
ら生成したグリセロールのみから生成した過酸化
水素を比色定量する。 酵素として、例えばグルタミン酸ピルビン酸ト
ランスアミナーゼ（GPT）の活性を測定するに
は、第１試液としてピルビン酸オキシダーゼ、ペ
ルオキシダーゼとフエノール誘導体と緩衝剤を含
む試液を調製し、第２試液としてα―ケトグルタ
ル酸、DL―アニリンと４―アミノアンチピリン
と緩衝剤を含む試液を調製し、試料に第１試液を
作用させて遊離ピルビン酸から生成した過酸化水
素をペルオキシダーゼの存在下、色原体と反応
（自己縮合）させた後、第２試液を作用させ、
GPTの作用により生成したピルビン酸のみから
生成した過酸化水素を比色定量する。 本発明方法は上記基質、酵素活性の測定のほか
に、他の酸化酵素による過酸化水素の測定にも利
用し得る。 （発明の効果） 本発明方法は第１試液と第２試液との混合液を
用いる定量法に比べて、試料中に共存する測定誤
差を生ずる物質の計り込みを減少させ、真の基質
又は酵素活性を簡単に測定することが可能となつ
た。 本発明のフエノール誘導体はｐ―位に低級アル
キル基又は水酸基またはスルホン酸基を有する低
級アルキル基を有することにより、過酸化水素と
ペルオキシダーゼの存在下反応（自己縮合反応）
して可視部に吸収を示さない化学物質に変換さ
れ、目的とする試料中の基質又は酵素活性を測定
する反応系に関与しないものと考えられる。 （実施例） 次に本発明を実施例を用いて説明する。 実施例 １ サンプル中のトリグリセライドを下記試薬を用
い、下記方法により測定した。 １ サンプル：グリセリン（26mg／dl）溶液 グリセリン（52mg／dl）溶液 グリセリン（104mg／dl）溶液 血清ａ：水＝９：１ 血清ａ：グリセリン水溶液（1040
mg／dl）＝９：１ 血清ｂ：水＝９：１ 血清ａ：グリセリン水溶液（1040
mg／dl）＝９：１ ２ 試薬： フエノール誘導体が下記第１表に示される化
合物である試薬Ａ〜Ｃおよび試薬ａ〜ｅを調製
した。 第１試液 トリス緩衝液（PH7.0） グリセロキナーゼ 2.0単位／ml グリセロリン酸オキシダーゼ
6.0単位／ml ペルオキシダーゼ 10.0単位／ml フエノール誘導体 ５mg／dl 第２試液 トリス緩衝液（PH7.0） リポプロテインリパーゼ
600単位／ml ４―アミノアンチピリン 10mg／dl Ｎ―エチル―Ｎ（３―スルホプロピ
ル）ｍ―アニシジン 90mg／dl
法に関するものである。 （従来の技術） 近年、臨床検査において体液中の基質量または
酵素活性を定量する方法として、基質または酵素
反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ、
生成する過酸化水素を測定する方法が盛んに用い
られている。 これらの過酸化水素の測定方法として、ペルオ
キシダーゼの酵素作用により、(1)４―アミノアン
チピリン、３―メチル―２―ベンゾチアゾリノン
ヒドラジン等のカツプラーと(2)フエノール誘導
体、アニリン誘導体またはナフトール誘導体等の
色原体とを酸化縮合させて発色体とし、その光学
的吸光度を測定する方法が用いられている。この
方法は操作が簡単であるという特徴を有してい
る。 （発明の解決しようとする問題点） ところが、最近、この測定方法を用いたコレス
テロールエステル、トリグリセライド、アミラー
ゼ、GOT、GPT等の臨床診断において、体液中
の遊離コレステロール、遊離グリセロール、ブド
ウ糖、ピルビン酸等を誤差として計り込むことが
問題になつている。 （問題点を解決するための手段） 本発明者等は体液中の遊離コレステロール、遊
離グリセロール、ブドウ糖、ピルビン酸等の計り
込みを防止し、正確に目的とするコレステロール
エステル、トリグリセライド等の基質またはアミ
ラーゼ、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナ
ーゼ（GPT）、グルタミン酸オギザロ酢酸トラン
スアミナーゼ（GOT）等の酵素活性を定量する
ことを目的として、種々鋭意検討したところ、本
発明に到達した。 すなわち本発明は試料中の基質又は酵素の酵素
反応により生成した物質(A)に酸化酵素を作用さ
せ、生成する過酸化水素をペルオキシダーゼの存
在下、色原体およびカツプラーと反応させ、光学
的吸光度測定することにより、試料中の基質また
は酵素活性を定量する方法において、(i)酸化酵素
と(ii)ペルオキシダーゼと(iii)下記一般式()で表わ
されるフエノール誘導体を含む試液を第１試液と
し、(iv)カツプラーを含む試液を第２試液とし、試
料に第１試液を加えた後、第２試液を加え光学的
吸光度測定することを特徴とする基質又は酵素活
性の定量方法である。 一般式()： （式中、R1は炭素原子数が１〜５である低級アル
キル基、あるいは水酸基またはスルホン酸基を有
する炭素原子数が１〜５である低級アルキル基、
R2は水素、ハロゲンまたは炭素原子数が１〜
５である低級アルキル基、炭素原子数が１〜５
である低級アシル基、炭素原子数が１〜５であ
る低級アルキルエーテル基あるいは炭素原子数
が１〜５である低級アルコシキシカルボニル基を
示す。ｎ＝０〜４である。） 本発明では、上記第１試液を加えた後、第２試
液を加えることにより、体液中の遊離コレステロ
ール、遊離グリセロール、ブドウ糖、ピルビン酸
等の計り込みを防止し、簡便且つ正確に目的とす
る基質又は酵素活性を測定することが可能となつ
た。体液中の遊離コレステロール、遊離グリセロ
ール、ブドウ糖、ピルビン酸等は酸化酵素が作用
して過酸化水素を生成し、この過酸化水素はペル
オキシダーゼの存在下、フエノール誘導体が反応
（自己縮合反応）して可視部に吸収を示さない化
学物質に変換され、目的とする基質又は酵素活性
を測定する反応系に関与しないものと考えられ
る。 逆に第２試液を加えてから第１試液を加える
と、目的が達成されない。また４―アミノアンチ
ピリンを酸化酵素、ペルオキシダーゼとともに含
む試液を第１試液とし、フエノール誘導体を含む
試液を第２試液とし、第１試液を加えてから第２
試液を加えても目的は達成されない。例えばトリ
グリセライド測定において、グリセロキナーゼと
グリセロリン酸オキシダーゼを用いて生成した過
酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、４―アミ
ノアンチピリンと反応（自己縮合反応）させた
後、リパーゼとフエノール誘導体を加え発色体を
生成して、真のトリグリセライドのみを比色測定
しようと試みた。しかし、この方法では第１反応
である４―アミノアンチピリンと遊離グリセロー
ルとの反応（自己縮合反応）で可視部に吸収を有
する物質（測定波長に影響を与える物質）が生成
し、第２反応で生成した発色体の比色測定に正誤
差となり、問題が生じた。 また、真のトリグリセライドを測定する方法と
して、遊離グリセロール値を計り込んだ総トリグ
リセライド値と遊離グリセロール値を各々測定
し、その差を求める方法があるが、簡易性の点で
問題があつた。本発明は上記方法より簡易性の点
で優れる。 本発明方法は試料中の基質又は酵素の酵素反応
により生成した物質(A)に酸化酵素を作用させ、生
成する過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、
色原体およびカツプラーと反応させ、光学的吸光
度測定することにより、試料中の基質又は酵素活
性を定量する方法である。 定量する基質としては、体液中のコレステロー
ルエステル、トリグリセライド、クレアチニン、
クレアチニンなどがある。 定量する酵素としては、体液中のアミノトラン
スアミナーゼ、例えばグルタミン酸オギザロ酢酸
トランスアミナーゼ（GOT）、グルタミン酸ピル
ビン酸トランスアミナーゼ（GPT）、アミラーゼ
などがある。 酵素反応により生成した物質(A)としては、コレ
ステロールエステルにコレステロールエステラー
ゼを作用させて生成したコレステロール、トリグ
リセライドにリパーゼを作用させて生成したグリ
セロール、グリセロールにグリセロキナーゼを作
用させて生成したグリセロール―３―リン酸、α
―ケトグルタル酸とアラニンにグルタミン酸ピル
ビン酸トランスアミナーゼ（GPT）を作用させ
て生成したピルビン酸、デンプンまたはγ―サイ
クロデキストリンを基質として、アミラーゼ、グ
ルコアミラーゼを作用させ生成したブドウ糖など
がある。 上記基質又は上記酵素反応により生成した物質
(A)に作用させる酸化酵素としては、コレステロー
ルオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、グ
リセロリン酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダ
ーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、グリコースオキ
シダーゼなどがある。 本発明に用いる一般式()で表わされるフエノ
ール誘導体としては、たとえばｐ―クレゾール、
ｐ―エチルフエノール、４―ｎ―プロピルフエノ
ール、ｐ―イソプロピルフエノール、ｏ―クロロ
―ｐ―クレゾール、ｍ―クロロ―ｐ―クレゾー
ル、２，４―ジメチルフエノール、２，４―ジエ
チルフエノール、３，４―ジエチルフエノール、
２，４，６―トリメチルフエノール、ｍ―ヒドロ
キシメチル―ｐ―クレゾール、２―メトキシ―４
―メチルフエノール、２―アセチル―４―メチル
フエノール、２―メトキシカルボニル―４―メチ
ルフエノール、３―スルホプロピル―４―エチル
フエノールなど、ｐ―ヒドロキシメチルフエノー
ル、ｐ―ヒドロキシエチルフエノール、ｐ―スル
ホキシメチルフエノール、ｐ―スルホキシエチル
フエノール、２−メトキシ−４−スルホメチルフ
エノール３−クロロ−４−ヒドロキシメチルフエ
ノール、―メチル―４―ヒドロキシメチルフエノ
ール、２，４―ジヒドロキシメチルフエノール、
３，４―ジヒドロキシメチルフエノール、２―ア
セチル―４―ヒドロキシメチルフエノール、３―
メトキシ―４―ヒドロキシメチルフエノール、３
―メトキシカルボニル―４―ヒドロキシメチルフ
エノール、２―メチル―４―スルホメチルフエノ
ールなどがある。 本発明に用いるカツプラーとしては、４―アミ
ノアンチピリン、３―メチル―２―ベンゾチアゾ
リンヒドラジン等がある。 本発明に用いる試薬は(i)酸化酵素と(ii)ペルオキ
シダーゼと(iii)フエノール誘導体を含む試液を第１
試液とし、(iv)カツプラーを含む試液を第２試液と
する。 (iv)カツプラーを含む第２試液には、試料中の定
量しようとする基質を酸化酵素の基質となる物質
(A)に変換させる酵素又は試料中の定量しようとす
る酵素に作用して、酸化酵素の基質となる物質(A)
に変換する物質を含む。 試料中の定量しようとする基質に直接作用し、
酸化酵素の基質となる物質に変換させる酵素とし
ては、コレステロールエステラーゼ、リパーゼお
よびグリセロキナーゼ、クレアチニンデイミナー
ゼ、クレアチミンデイスミダーゼなどがある。 試料中の定量しようとする酵素に作用して、酸
化酵素の基質を含む物質(A)に変換する物質として
はα―ケトグルタル酸とアラニン、デンプン又は
γ―サイクロデキストリンなどがある。 第２試液にはアニリン誘導体が含まれていても
よい。アニリン誘導体としては、アニリン、Ｎ，
Ｎ―ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ―ジエチルアニリ
ン、Ｎ，Ｎ―ジエチル―ｍ―トルイジン、Ｎ，Ｎ
―ジメチルｍ―アニシジン、Ｎ―エチル―Ｎ―
（３―メチルフエニル）―N′―アセチルエチレジ
アミン、Ｎ―エチル―Ｎ―（β―ヒドロキシエチ
ル）―ｍ―トルイジン、Ｎ―エチル―Ｎ―（２―
ヒドロキシ―３―スルホプロピル）―ｍ―トルイ
ジン、Ｎ―エチル―Ｎ―スルホプロピル―ｍ―ト
ルイジン、Ｎ―エチル―Ｎ―スルホプロピル―
３，５―ジメトキシアニリン、Ｎ―エチル―Ｎ―
（２―ヒドロキシ―３―スルホプロピル）―３，
５―ジメトキシアニリン、Ｎ―エチル―スルホプ
ロピル―ｍ―アニシジン、Ｎ―エチル―Ｎ―（２
―ヒドロキシ―３―スルホプロピル）―ｍ―アニ
シジン等がある。 第１試液および第２試液には前記成分に加え
て、緩衝剤、および必要により界面活性剤、安定
化剤等を含む。緩衝剤としては通常のものが使用
され、第１試液および第２試液のPHを通常５〜10
に調製するものが好ましい。 フエノール誘導体の含有量は第１試液において
１×10-5〜１×10-2Mである。カツプラーの含有
量は第２試液において１×10-6〜１×10-2Mであ
る。 本発明に用いる試薬には、他の酵素、基質、各
種安定剤、妨害物質除去のための試薬、界面活性
剤等を含んでいてもよい。 次に基質又は酵素活性について具体的に説明す
る。本発明はこれらの具体的に説明されるものに
限定されない。 基質として例えばコレステロールエステルを測
定するには、第１試液として、コレステロールオ
キシダーゼ、ペルオキシダーゼとフエノール誘導
体と緩衝剤を含む試液を調製し、第２試液として
コレステロールエステラーゼと４―アミノアンチ
ピリンと緩衝剤を含む試液を調製する。試料に第
１試液を作用させ、遊離コレステロールから生成
した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、フ
エノール誘導体と反応（自己縮合）させた後、第
２試液を作用させ、コレステロールエステルから
生成したコレステロールのみから生成した過酸化
水素にペルオキシダーゼの存在下、色原体と４―
アミノアンチピリンを作用させて発色体を得、こ
れを比色定量する。 基質として例えばトリグリセライドを測定する
には、第１試液としてグリセロールオキシダー
ゼ、ペルオキシダーゼとフエノール誘導体と緩衝
剤を含む試液、又はグリセロールキナーゼ、グリ
セロリン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼとフ
エノール誘導体と緩衝剤を含む試液を調製し、第
２試液としてリポプロテインリパーゼと４―アミ
ノアンチピリンと緩衝剤を含む試液を調製する。
試料に第１試液を作用させて、遊離グリセロール
から生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存
在下、フエノール誘導体と反応（自己縮合）させ
た後、第２試液を作用させ、トリグリセライドか
ら生成したグリセロールのみから生成した過酸化
水素を比色定量する。 酵素として、例えばグルタミン酸ピルビン酸ト
ランスアミナーゼ（GPT）の活性を測定するに
は、第１試液としてピルビン酸オキシダーゼ、ペ
ルオキシダーゼとフエノール誘導体と緩衝剤を含
む試液を調製し、第２試液としてα―ケトグルタ
ル酸、DL―アニリンと４―アミノアンチピリン
と緩衝剤を含む試液を調製し、試料に第１試液を
作用させて遊離ピルビン酸から生成した過酸化水
素をペルオキシダーゼの存在下、色原体と反応
（自己縮合）させた後、第２試液を作用させ、
GPTの作用により生成したピルビン酸のみから
生成した過酸化水素を比色定量する。 本発明方法は上記基質、酵素活性の測定のほか
に、他の酸化酵素による過酸化水素の測定にも利
用し得る。 （発明の効果） 本発明方法は第１試液と第２試液との混合液を
用いる定量法に比べて、試料中に共存する測定誤
差を生ずる物質の計り込みを減少させ、真の基質
又は酵素活性を簡単に測定することが可能となつ
た。 本発明のフエノール誘導体はｐ―位に低級アル
キル基又は水酸基またはスルホン酸基を有する低
級アルキル基を有することにより、過酸化水素と
ペルオキシダーゼの存在下反応（自己縮合反応）
して可視部に吸収を示さない化学物質に変換さ
れ、目的とする試料中の基質又は酵素活性を測定
する反応系に関与しないものと考えられる。 （実施例） 次に本発明を実施例を用いて説明する。 実施例 １ サンプル中のトリグリセライドを下記試薬を用
い、下記方法により測定した。 １ サンプル：グリセリン（26mg／dl）溶液 グリセリン（52mg／dl）溶液 グリセリン（104mg／dl）溶液 血清ａ：水＝９：１ 血清ａ：グリセリン水溶液（1040
mg／dl）＝９：１ 血清ｂ：水＝９：１ 血清ａ：グリセリン水溶液（1040
mg／dl）＝９：１ ２ 試薬： フエノール誘導体が下記第１表に示される化
合物である試薬Ａ〜Ｃおよび試薬ａ〜ｅを調製
した。 第１試液 トリス緩衝液（PH7.0） グリセロキナーゼ 2.0単位／ml グリセロリン酸オキシダーゼ
6.0単位／ml ペルオキシダーゼ 10.0単位／ml フエノール誘導体 ５mg／dl 第２試液 トリス緩衝液（PH7.0） リポプロテインリパーゼ
600単位／ml ４―アミノアンチピリン 10mg／dl Ｎ―エチル―Ｎ（３―スルホプロピ
ル）ｍ―アニシジン 90mg／dl
【表】
３測定法
各サンプル20μに第１試液２mlを加え、37
℃にて５分間反応させた後、第２試液を１ml加
えて37℃にわ10分間反応させ、４―アミノアン
チピリンとＮ―エチル―Ｎ―（３―スルホプロ
ピル）―ｍ―アニシジンとの発色体を波長
540nmで測定した。その結果を第２表に示す。
℃にて５分間反応させた後、第２試液を１ml加
えて37℃にわ10分間反応させ、４―アミノアン
チピリンとＮ―エチル―Ｎ―（３―スルホプロ
ピル）―ｍ―アニシジンとの発色体を波長
540nmで測定した。その結果を第２表に示す。
【表】
第２表において、蒸留水はサンプル（グリセ
リン溶液）、、の対照例であり、サンプ
ル（血清ａと水）はサンプル（血清ａとグリ
セリン）の対照例であり、サンプル（血清ｂ
と水）はサンプル（血清ｂとグリセリン）
の対照例である。 試薬Ａで用いたｐ―クレゾールは、他の試薬
で用いたｍ―ブロムフエノール、ｐ―クロルフ
エノール、フエノール、２，４―ジクロロフエ
ノールと比較してグリセリン消去能力において
優れている。 実施例 ２ サンプル中のトリグリセライドを下記試薬を用
い、下記方法により測定した。 １ サンプル：グリセリン（26mg／dl）溶液 グリセリン（52mg／dl）溶液 グリセリン（104mg／dl）溶液 血清ａ：水＝９：１ 血清ａ：グリセリン水溶液（1040
mg／dl）９：１ 血清ｂ：水＝９：１ 血清ｂ：グリセリン水溶液（1040
mg／dl）＝９：１ ２ 試薬： フエノール誘導体が下記第３表に示される化
合物である試薬Ａ〜Ｃおよび試薬ａ〜ｅを調製
した。 第１試液 トリス緩衝液（PH７・０） グリセロキナーゼ 2.0単位／ml グリセロリン酸オキシダーゼ
6.0単位／ml ペルオキシダーゼ 10.0単位／ml フエノール誘導体 ５mg／dl 第２試液 トリス緩衝液（PH7.0） リポプロテインリパーゼ
600単位／ml ４―アミノアンチピリン 10mg／dl Ｎ，Ｎ―ジエチル―ｍ―トルイジン
90mg／dl
リン溶液）、、の対照例であり、サンプ
ル（血清ａと水）はサンプル（血清ａとグリ
セリン）の対照例であり、サンプル（血清ｂ
と水）はサンプル（血清ｂとグリセリン）
の対照例である。 試薬Ａで用いたｐ―クレゾールは、他の試薬
で用いたｍ―ブロムフエノール、ｐ―クロルフ
エノール、フエノール、２，４―ジクロロフエ
ノールと比較してグリセリン消去能力において
優れている。 実施例 ２ サンプル中のトリグリセライドを下記試薬を用
い、下記方法により測定した。 １ サンプル：グリセリン（26mg／dl）溶液 グリセリン（52mg／dl）溶液 グリセリン（104mg／dl）溶液 血清ａ：水＝９：１ 血清ａ：グリセリン水溶液（1040
mg／dl）９：１ 血清ｂ：水＝９：１ 血清ｂ：グリセリン水溶液（1040
mg／dl）＝９：１ ２ 試薬： フエノール誘導体が下記第３表に示される化
合物である試薬Ａ〜Ｃおよび試薬ａ〜ｅを調製
した。 第１試液 トリス緩衝液（PH７・０） グリセロキナーゼ 2.0単位／ml グリセロリン酸オキシダーゼ
6.0単位／ml ペルオキシダーゼ 10.0単位／ml フエノール誘導体 ５mg／dl 第２試液 トリス緩衝液（PH7.0） リポプロテインリパーゼ
600単位／ml ４―アミノアンチピリン 10mg／dl Ｎ，Ｎ―ジエチル―ｍ―トルイジン
90mg／dl
【表】
【表】
３ 測定法
各サンプル20μに第１試液２mlを加え、37
℃にて５分間反応させた後、第２試液を１ml加
えて37℃にて10分間反応させ、４―アミノアン
チピリンとＮ，Ｎ―ジエチル―ｍ―トルイジン
との発色体を波長540nmで測定した。その結果
を第４表に示す。
℃にて５分間反応させた後、第２試液を１ml加
えて37℃にて10分間反応させ、４―アミノアン
チピリンとＮ，Ｎ―ジエチル―ｍ―トルイジン
との発色体を波長540nmで測定した。その結果
を第４表に示す。
【表】
試薬Ａ、Ｂ、Ｃで用いたｐ―エチルフエノー
ル、ｐ―スルホキシメチルフエノール、ｐ―ヒ
ドロキシメチルフエノールは、他の試薬で用い
たｏ―クロロフエノール、３，５―ジメトキシ
フエノール、ｏ―イソプロピルフエノール、
２，６―ジメトキシフエノールと比較してグリ
セリン消去能力において優れている。 実施例 ３ サンプル中のグルタミン酸ピルビン酸トランス
アミナーゼ（GPT）を下記試薬を用い、下記方
法により測定した。 １ サンプル：ピルビン酸（25mg／dl）溶液 ピルビン酸（50mg／dl）溶液 ピルビン酸（100mg／dl）溶液 血清ａ＝水９：１ 血清ａ：ピルビン酸（1000mg／
dl）＝９：１ 血清ｂ：水＝９：１ 血清ｂ：ピルビン酸（1000mg／
dl）＝９：１ ２ 試薬 フエノール誘導体が下記第５表に示される化
合物である試薬Ａ、Ｂおよび試薬ａ〜ｅを調製
した。 第１試液 リン酸緩衝液（PH7.0） ピルビン酸オキシダーゼ６単位／ml ペルオキシダーゼ 10.0単位／ml チアミンピロリン酸 0.045％ フラビアデニンジヌクレオチド
0.002％ フエノール誘導体 ５mg／dl 酢酸マグネシウム 0.007M 第２試液 リン酸緩衝液（PH7.0） α―ケトグルタル酸 0.035M DL―アニニン 0.7M ４―アミノアンチピリン ２mg／dl Ｎ―エチル―Ｎ―（３―スルホプロ
ピル）―ｍ―アニシジン 20mg／dl 反応停止液 リン酸緩衝液（PH9.0） エチレンジアミン四酢酸２―ナト
リウム 0.05M クエン酸３―ナトリウム 0.1M
ル、ｐ―スルホキシメチルフエノール、ｐ―ヒ
ドロキシメチルフエノールは、他の試薬で用い
たｏ―クロロフエノール、３，５―ジメトキシ
フエノール、ｏ―イソプロピルフエノール、
２，６―ジメトキシフエノールと比較してグリ
セリン消去能力において優れている。 実施例 ３ サンプル中のグルタミン酸ピルビン酸トランス
アミナーゼ（GPT）を下記試薬を用い、下記方
法により測定した。 １ サンプル：ピルビン酸（25mg／dl）溶液 ピルビン酸（50mg／dl）溶液 ピルビン酸（100mg／dl）溶液 血清ａ＝水９：１ 血清ａ：ピルビン酸（1000mg／
dl）＝９：１ 血清ｂ：水＝９：１ 血清ｂ：ピルビン酸（1000mg／
dl）＝９：１ ２ 試薬 フエノール誘導体が下記第５表に示される化
合物である試薬Ａ、Ｂおよび試薬ａ〜ｅを調製
した。 第１試液 リン酸緩衝液（PH7.0） ピルビン酸オキシダーゼ６単位／ml ペルオキシダーゼ 10.0単位／ml チアミンピロリン酸 0.045％ フラビアデニンジヌクレオチド
0.002％ フエノール誘導体 ５mg／dl 酢酸マグネシウム 0.007M 第２試液 リン酸緩衝液（PH7.0） α―ケトグルタル酸 0.035M DL―アニニン 0.7M ４―アミノアンチピリン ２mg／dl Ｎ―エチル―Ｎ―（３―スルホプロ
ピル）―ｍ―アニシジン 20mg／dl 反応停止液 リン酸緩衝液（PH9.0） エチレンジアミン四酢酸２―ナト
リウム 0.05M クエン酸３―ナトリウム 0.1M
【表】
【表】
３ 測定法
各サンプル20μに第１試液２mlを加え37℃
にて５分間反応させた後、第２試液を１ml加え
て37℃にて10分反応させ、４―アミノアンチピ
リンとＮ―エチル―Ｎ―（３―スルホプロピ
ル）―ｍ―アニシジンとの発色体を波長540nm
で測定した。その結果を第６表に示す。
にて５分間反応させた後、第２試液を１ml加え
て37℃にて10分反応させ、４―アミノアンチピ
リンとＮ―エチル―Ｎ―（３―スルホプロピ
ル）―ｍ―アニシジンとの発色体を波長540nm
で測定した。その結果を第６表に示す。
【表】
試薬Ａ、Ｂ、Ｃで用いたｐ―クレゾール、ｐ
―エチルフエノールは他の試薬で用いたフエノ
ール、ｍ―クロルフエノール、ｐ―ブロムフエ
ノール、２，４―ジブロフエノールと比較して
ピルビン酸消去能力において優れている。 実施例 ４ サンプル中のコレステロールエステルを下記試
薬を用い、下記方法により測定した。 サンプル：コレステロール（50mg／dl）溶液 コレステロール（100mg／dl）溶液
コレステロール（500mg／dl）溶液
血清ａ：水＝９：１ 血清ａ：コレステロール溶液（5000
mg／dl）＝７：１ 血清ｂ：水＝９：１ 血清ｂ：コレステロール水溶液
（5000mg／dl）＝９：１ 試薬： フエノール誘導体が下記第７表に示される化合
物である試薬Ａ、Ｂおよび試薬ａ〜ｄを調製し
た。 第１試液 リン酸緩衝液（PH5.35） コレステロールオキシダーゼ
0.8単位／ml ペルオキシダーゼ 10単位／ml フエノール誘導体 ５mg／dl 第２試液 リン酸緩衝液（PH5.35） コレステロールエステラーゼ
0.4単位／ml ４―アミノアンチピリン ２mg／dl Ｎ，Ｎ―ジメチル―ｍ―アニシジン
20mg／dl
―エチルフエノールは他の試薬で用いたフエノ
ール、ｍ―クロルフエノール、ｐ―ブロムフエ
ノール、２，４―ジブロフエノールと比較して
ピルビン酸消去能力において優れている。 実施例 ４ サンプル中のコレステロールエステルを下記試
薬を用い、下記方法により測定した。 サンプル：コレステロール（50mg／dl）溶液 コレステロール（100mg／dl）溶液
コレステロール（500mg／dl）溶液
血清ａ：水＝９：１ 血清ａ：コレステロール溶液（5000
mg／dl）＝７：１ 血清ｂ：水＝９：１ 血清ｂ：コレステロール水溶液
（5000mg／dl）＝９：１ 試薬： フエノール誘導体が下記第７表に示される化合
物である試薬Ａ、Ｂおよび試薬ａ〜ｄを調製し
た。 第１試液 リン酸緩衝液（PH5.35） コレステロールオキシダーゼ
0.8単位／ml ペルオキシダーゼ 10単位／ml フエノール誘導体 ５mg／dl 第２試液 リン酸緩衝液（PH5.35） コレステロールエステラーゼ
0.4単位／ml ４―アミノアンチピリン ２mg／dl Ｎ，Ｎ―ジメチル―ｍ―アニシジン
20mg／dl
【表】
【表】
３ 測定法
各サンプル20μに第１試液２mlを加え、37
℃にて５分間反応させた後、第２試液を１ml加
えて37℃にて10分間反応させ、４―アミノアン
チピリンとＮ，Ｎ―ジエチル―ｍ―トルイジン
との発色体を波長535nmで測定した。その結果
を第８表に示す。
℃にて５分間反応させた後、第２試液を１ml加
えて37℃にて10分間反応させ、４―アミノアン
チピリンとＮ，Ｎ―ジエチル―ｍ―トルイジン
との発色体を波長535nmで測定した。その結果
を第８表に示す。
【表】
試薬Ａ、Ｂ、Ｃで用いたｐ―クレゾール、ｐ
―エチルフエノールは、他の試薬で用いた。ｏ
―ブロムフエノール、３，４―ジメトキシフエ
ノール、ｏ―イソプロピルフエノールと比較し
てコレステロール消去能力において優れてい
る。 実施例 ５ サンプル中のトリグリセライドを下記試薬を用
い、下記方法により測定した。 １ サンプル：グリセリン（26mg／dl）溶液 グリセリン（52mg／dl）溶液 グリセリン（104mg／dl）溶液 血清ａ：水＝９：１ 血清ａ：グリセリン水溶液（1040
mg／dl）＝９：１ 血清ｂ：水＝９：１ 血清ｂ：グリセリン水溶液（1040
mg／dl）＝９：１ ２ 試薬： フエノール誘導体またはアニリン誘導体が下
記第９表に示される化合物である試薬Ａ、Ｂお
よび試薬ａ〜ｅを調製した。 第１試液 トリス緩衝液（PH7.0） グリセロキナーゼ 2.0単位／ml グリセロリン酸オキシダーゼ
6.0単位／ml ペルオキシダーゼ 10.0単位／ml フエノール誘導体またはアニリン誘
導体 ５mg／dl 第２試液 トリス緩衝液（PH7.0） リポプロテインリパーゼ
600単位／ml ４―アミノアンチピリン 10mg／dl Ｎ，Ｎ―ジエチル―ｍ―トルイジン
90mg／dl
―エチルフエノールは、他の試薬で用いた。ｏ
―ブロムフエノール、３，４―ジメトキシフエ
ノール、ｏ―イソプロピルフエノールと比較し
てコレステロール消去能力において優れてい
る。 実施例 ５ サンプル中のトリグリセライドを下記試薬を用
い、下記方法により測定した。 １ サンプル：グリセリン（26mg／dl）溶液 グリセリン（52mg／dl）溶液 グリセリン（104mg／dl）溶液 血清ａ：水＝９：１ 血清ａ：グリセリン水溶液（1040
mg／dl）＝９：１ 血清ｂ：水＝９：１ 血清ｂ：グリセリン水溶液（1040
mg／dl）＝９：１ ２ 試薬： フエノール誘導体またはアニリン誘導体が下
記第９表に示される化合物である試薬Ａ、Ｂお
よび試薬ａ〜ｅを調製した。 第１試液 トリス緩衝液（PH7.0） グリセロキナーゼ 2.0単位／ml グリセロリン酸オキシダーゼ
6.0単位／ml ペルオキシダーゼ 10.0単位／ml フエノール誘導体またはアニリン誘
導体 ５mg／dl 第２試液 トリス緩衝液（PH7.0） リポプロテインリパーゼ
600単位／ml ４―アミノアンチピリン 10mg／dl Ｎ，Ｎ―ジエチル―ｍ―トルイジン
90mg／dl
【表】
３ 測定法
各サンプル20μに第１試液２mlを加え、37
℃にて５分間反応させた後、第２試液を１ml加
えて37℃にて10分間反応させ、４―アミノアン
チピリンとＮ，Ｎ―ジエチル―ｍ―トルイジン
との発色体を波長540nmで測定した。その結果
を第10表に示す。
℃にて５分間反応させた後、第２試液を１ml加
えて37℃にて10分間反応させ、４―アミノアン
チピリンとＮ，Ｎ―ジエチル―ｍ―トルイジン
との発色体を波長540nmで測定した。その結果
を第10表に示す。
【表】
試薬Ａ、Ｂで用いたｐ―クレゾール、ｐ―エ
チルフエノールは、他の試薬で用いたｐ―オキ
シ安息香酸メチル、Ｎ―エチル―Ｎ―（３―ス
ルホプロピル）―ｍ―アニシジン、Ｎ，Ｎ―ジ
メチルアニシジン、Ｎ，Ｎ―ジエチルアニリン
と比較してグリセリン消去能力において優れて
いる。 実施例 ６ サンプル中のトリグリセライドを下記試薬を用
い、下記方法により測定した。 １ サンプル：グリセリン（26mg／dl）溶液 グリセリン（52mg／dl）溶液 グリセリン（104mg／dl）溶液 血清ａ：水＝９：１ 血清ａ：グリセリン水溶液（1040
mg／dl）＝９：１ 血清ｂ：水＝９：１ 血清ｂ：グリセリン水溶液（1040
mg／dl）＝９：１ ２ 試薬： フエノール誘導体が下記第11表に示される化
合物である試薬Ａ〜Ｃおよび試薬ａ〜ｅを調製
した。 第１試液 トリス緩衝液（PH7.0） グリセロキナーゼ 2.0単位／ml グリセロリン酸オキシダーゼ
6.0単位／ml ペルオキシダーゼ 10.0単位／ml フエノール誘導体 ５mg／dl 第２試液 トリス緩衝液（PH7.0） リポプロテインリパーゼ
600単位／ml ４―アミノアンチピリン 10mg／dl Ｎ―エチル―Ｎ―（３―スルホプロ
ピル）―ｍ―トルイジン 90mg／dl
チルフエノールは、他の試薬で用いたｐ―オキ
シ安息香酸メチル、Ｎ―エチル―Ｎ―（３―ス
ルホプロピル）―ｍ―アニシジン、Ｎ，Ｎ―ジ
メチルアニシジン、Ｎ，Ｎ―ジエチルアニリン
と比較してグリセリン消去能力において優れて
いる。 実施例 ６ サンプル中のトリグリセライドを下記試薬を用
い、下記方法により測定した。 １ サンプル：グリセリン（26mg／dl）溶液 グリセリン（52mg／dl）溶液 グリセリン（104mg／dl）溶液 血清ａ：水＝９：１ 血清ａ：グリセリン水溶液（1040
mg／dl）＝９：１ 血清ｂ：水＝９：１ 血清ｂ：グリセリン水溶液（1040
mg／dl）＝９：１ ２ 試薬： フエノール誘導体が下記第11表に示される化
合物である試薬Ａ〜Ｃおよび試薬ａ〜ｅを調製
した。 第１試液 トリス緩衝液（PH7.0） グリセロキナーゼ 2.0単位／ml グリセロリン酸オキシダーゼ
6.0単位／ml ペルオキシダーゼ 10.0単位／ml フエノール誘導体 ５mg／dl 第２試液 トリス緩衝液（PH7.0） リポプロテインリパーゼ
600単位／ml ４―アミノアンチピリン 10mg／dl Ｎ―エチル―Ｎ―（３―スルホプロ
ピル）―ｍ―トルイジン 90mg／dl
【表】
３ 測定法
各サンプル20μに第１試液２mlを加え、37
℃にて５分間反応させた後、第２試液を１ml加
えて37℃にて10分間反応させ、４―アミノアン
チピリンとＮ―エチル―Ｎ―（３―スルホプロ
ピル）―ｍ―トルイジンとの発色体を波長
550nmで測定した。その結果を第12表に示す。
℃にて５分間反応させた後、第２試液を１ml加
えて37℃にて10分間反応させ、４―アミノアン
チピリンとＮ―エチル―Ｎ―（３―スルホプロ
ピル）―ｍ―トルイジンとの発色体を波長
550nmで測定した。その結果を第12表に示す。
【表】
試薬Ａ、Ｂ、Ｃで用いたｏ―クロロ―ｐ―メ
チルフエノール、２，４―ジエチルフエノー
ル、２―アセチル―４―メチルフエノールは他
の試薬で用いたｏ―クレゾール、ｍ―クレゾー
ル、ｐ―プロモフエノール、２，４―ジブロフ
エノールと比較してグリセロール消去能力にお
いて優れている。 実施例 ７ サンプル中のクレアチニンを下記試薬を用い、
下記方法により測定した。 １ サンプル：クレアチン（５mg／dl）溶液 クレアチン（10mg／dl）溶液 クレアチン（20mg／dl）溶液 血清ａ：水＝９：１ 血清ａ：クレアチン水溶液（200
mg／dl）＝９：１ 血清ｂ：水＝９：１ 血清ｂ：クレアチン水溶液（200
mg／dl）＝９：１ ２ 試薬： フエノール誘導体が下記第13表に示される化
合物である試薬Ａ〜Ｃおよび試薬ａ〜ｄを調製
した。 第１試液 トリス緩衝液（PH8.0） 0.1M クレアチンアミジノヒドロラーゼ
20U／ml ザルコシンオキシダーゼ 5U／ml ペルオキシダーゼ 10U／ml フエノール誘導体 ５mg／dl 第２試液 トリス緩衝液（PH8.0） 0.1M クレアチニンアミドヒトロラーゼ
10U／ml ４―アミノアンチピリン 10mg／dl Ｎ―エチル―Ｎ―（２―ヒドロキシ
―３―スルホプロピル）―ｍ―アニ
シジン 90mg／dl
チルフエノール、２，４―ジエチルフエノー
ル、２―アセチル―４―メチルフエノールは他
の試薬で用いたｏ―クレゾール、ｍ―クレゾー
ル、ｐ―プロモフエノール、２，４―ジブロフ
エノールと比較してグリセロール消去能力にお
いて優れている。 実施例 ７ サンプル中のクレアチニンを下記試薬を用い、
下記方法により測定した。 １ サンプル：クレアチン（５mg／dl）溶液 クレアチン（10mg／dl）溶液 クレアチン（20mg／dl）溶液 血清ａ：水＝９：１ 血清ａ：クレアチン水溶液（200
mg／dl）＝９：１ 血清ｂ：水＝９：１ 血清ｂ：クレアチン水溶液（200
mg／dl）＝９：１ ２ 試薬： フエノール誘導体が下記第13表に示される化
合物である試薬Ａ〜Ｃおよび試薬ａ〜ｄを調製
した。 第１試液 トリス緩衝液（PH8.0） 0.1M クレアチンアミジノヒドロラーゼ
20U／ml ザルコシンオキシダーゼ 5U／ml ペルオキシダーゼ 10U／ml フエノール誘導体 ５mg／dl 第２試液 トリス緩衝液（PH8.0） 0.1M クレアチニンアミドヒトロラーゼ
10U／ml ４―アミノアンチピリン 10mg／dl Ｎ―エチル―Ｎ―（２―ヒドロキシ
―３―スルホプロピル）―ｍ―アニ
シジン 90mg／dl
【表】
３ 測定法
各サンプル100μに第１試液2.25mlを加
え、37℃にて５分間反応させた後、第２試液
0.75ml加えて37℃にて10分間反応させ、４―ア
ミノアンチピリンとＮ―エチル―Ｎ―（２―ヒ
ドロキシ―３―スルホプロピル）―ｍ―トルイ
ジンとの発色体を波長550nmで測定した。その
結果を第14表に示す。
え、37℃にて５分間反応させた後、第２試液
0.75ml加えて37℃にて10分間反応させ、４―ア
ミノアンチピリンとＮ―エチル―Ｎ―（２―ヒ
ドロキシ―３―スルホプロピル）―ｍ―トルイ
ジンとの発色体を波長550nmで測定した。その
結果を第14表に示す。
【表】
試薬Ａ、Ｂ、Ｃで用いた２―メトキシ―４―
スルホキシメチルフエノール、２−メトキシカ
ルボニル−４−メチルフエノール、２，４―ジ
ヒドロキシメチルフエノールは他の試薬で用い
た２―エチルフエノール、３―エチルフエノー
ル、ｍ―クロロフエノールと比較してクレアチ
ン消去能力において優れている。 実施例 ８ サンプル中のトリグリセライドを下記試薬を用
い、下記方法により測定した。 １ サンプル：グリセリン（26mg／dl）溶液 グリセリン（52mg／dl）溶液 グリセリン（104mg／dl）溶液 血清ａ：水＝９：１ 血清ａ：グリセリン水溶液（1040
mg／dl）＝９：１ 血清ｂ：水＝９：１ 血清ｂ：グリセリン水溶液（1040
mg／dl）＝９：１ ２ 試薬： フエノール誘導体が下記第15表に示される化
合物である試薬Ａ〜Ｄおよび試薬ａ〜ｃを調製
した。 第１試液 トリス緩衝液（PH7.0） グリセロキナーゼ 2.0単位／ml グリセロリン酸オキシダーゼ
6.0単位／ml ペルオキシダーゼ 10.0単位／ml フエノール誘導体 ５mg／dl 第２試液 トリス緩衝液（PH7.0） リポプロテインリパーゼ
600単位／ml ４―アミノアンチピリン 10mg／dl Ｎ―エチル―Ｎ―（３―スルホプロ
ピル）―ｍ―トルイジン 90mg／dl
スルホキシメチルフエノール、２−メトキシカ
ルボニル−４−メチルフエノール、２，４―ジ
ヒドロキシメチルフエノールは他の試薬で用い
た２―エチルフエノール、３―エチルフエノー
ル、ｍ―クロロフエノールと比較してクレアチ
ン消去能力において優れている。 実施例 ８ サンプル中のトリグリセライドを下記試薬を用
い、下記方法により測定した。 １ サンプル：グリセリン（26mg／dl）溶液 グリセリン（52mg／dl）溶液 グリセリン（104mg／dl）溶液 血清ａ：水＝９：１ 血清ａ：グリセリン水溶液（1040
mg／dl）＝９：１ 血清ｂ：水＝９：１ 血清ｂ：グリセリン水溶液（1040
mg／dl）＝９：１ ２ 試薬： フエノール誘導体が下記第15表に示される化
合物である試薬Ａ〜Ｄおよび試薬ａ〜ｃを調製
した。 第１試液 トリス緩衝液（PH7.0） グリセロキナーゼ 2.0単位／ml グリセロリン酸オキシダーゼ
6.0単位／ml ペルオキシダーゼ 10.0単位／ml フエノール誘導体 ５mg／dl 第２試液 トリス緩衝液（PH7.0） リポプロテインリパーゼ
600単位／ml ４―アミノアンチピリン 10mg／dl Ｎ―エチル―Ｎ―（３―スルホプロ
ピル）―ｍ―トルイジン 90mg／dl
【表】
【表】
各サンプル20μに第１試液２mlを加え、37
℃にて５分間反応させた後、第２試液を１ml加
えて37℃にて10分間反応させ、４―アミノアン
チピリンとＮ―エチル―Ｎ―（３―スルホプロ
ピル）―ｍ―トルイジンとの発色体を波長
550nmで測定した。この結果を第16表に示す。
℃にて５分間反応させた後、第２試液を１ml加
えて37℃にて10分間反応させ、４―アミノアン
チピリンとＮ―エチル―Ｎ―（３―スルホプロ
ピル）―ｍ―トルイジンとの発色体を波長
550nmで測定した。この結果を第16表に示す。
【表】
試薬Ａ、Ｂ、Ｃで用いた２―メトキシ―４―
メチルフエノール、ｍ―ヒドロキシメチル―ｐ
―クレゾール、３―クロロ―４―ヒドロキシメ
チルフエノール、２―メチル―４―ヒドロキシ
メチルフエノールは他の試薬で用いたフエノー
ル、４―クロロフエノールと比較してグリセロ
ール消去能力において優れている。 実施例 ９ サンプル中のクレアチニンを下記試薬を用い、
下記方法により測定した。 １ サンプル：クレアチン（５mg／dl）溶液 クレアチン（10mg／dl）溶液 クレアチン（20mg／dl）溶液 血清ａ：水＝９：１ 血清ａ：クレアチン水溶液（200
mg／dl）＝９：１ 血清ｂ：水＝９：１ 血清ｂ：クレアチン水溶液（200
mg／dl）＝９：１ ２ 試薬： フエノール誘導体が下記第17表に示される化
合物である試薬Ａ〜Ｃおよび試薬ａ〜ｃを調製
した。 第１試液 トリス緩衝液（PH8.0） 0.1M クレアチンアミジノヒドロラーゼ
20U／ml ザルコシンオキシダーゼ 5U／ml ペルオキシダーゼ 10U／ml フエノール誘導体 ５mg／dl 第２試液 トリス緩衝液（PH8.0） 0.1M クレアチニンアミドヒドロラーゼ
10U／ml ４―アミノアンチピリン 10mg／dl Ｎ―エチル―Ｎ―（２―ヒドロキシ
―３―スルホプロピル）―ｍ―アニ
シジン 90mg／dl
メチルフエノール、ｍ―ヒドロキシメチル―ｐ
―クレゾール、３―クロロ―４―ヒドロキシメ
チルフエノール、２―メチル―４―ヒドロキシ
メチルフエノールは他の試薬で用いたフエノー
ル、４―クロロフエノールと比較してグリセロ
ール消去能力において優れている。 実施例 ９ サンプル中のクレアチニンを下記試薬を用い、
下記方法により測定した。 １ サンプル：クレアチン（５mg／dl）溶液 クレアチン（10mg／dl）溶液 クレアチン（20mg／dl）溶液 血清ａ：水＝９：１ 血清ａ：クレアチン水溶液（200
mg／dl）＝９：１ 血清ｂ：水＝９：１ 血清ｂ：クレアチン水溶液（200
mg／dl）＝９：１ ２ 試薬： フエノール誘導体が下記第17表に示される化
合物である試薬Ａ〜Ｃおよび試薬ａ〜ｃを調製
した。 第１試液 トリス緩衝液（PH8.0） 0.1M クレアチンアミジノヒドロラーゼ
20U／ml ザルコシンオキシダーゼ 5U／ml ペルオキシダーゼ 10U／ml フエノール誘導体 ５mg／dl 第２試液 トリス緩衝液（PH8.0） 0.1M クレアチニンアミドヒドロラーゼ
10U／ml ４―アミノアンチピリン 10mg／dl Ｎ―エチル―Ｎ―（２―ヒドロキシ
―３―スルホプロピル）―ｍ―アニ
シジン 90mg／dl
【表】
３ 測定法
各サンプル100μに第１試液2.25mlを加
え、37℃にて５分間反応させた後、第２試液
0.75ml加えて37℃にて10分間反応させ、４―ア
ミノアンチピリンとＮ―エチル―Ｎ―（２−ヒ
ドロキシ−３―スルホプロピル）―ｍ―トルイ
ジンとの発色体を波長550nmで測定した。その
結果を第18表に示す。
え、37℃にて５分間反応させた後、第２試液
0.75ml加えて37℃にて10分間反応させ、４―ア
ミノアンチピリンとＮ―エチル―Ｎ―（２−ヒ
ドロキシ−３―スルホプロピル）―ｍ―トルイ
ジンとの発色体を波長550nmで測定した。その
結果を第18表に示す。
【表】
試薬Ａ、Ｂ、Ｃで用いた２―アセチル―４―
ヒドロキシメチルフエノール、２―メトキシ―
４―ヒドロキシエチルフエノール、２―メチル
―４―スルホメチルフエノールは他の試薬で用
いた３―メチル−４−ブロモフエノール、３−
メトキシフエノール、２―メトキシフエノール
と比較してクレアチン消去能力において優れて
いる。
ヒドロキシメチルフエノール、２―メトキシ―
４―ヒドロキシエチルフエノール、２―メチル
―４―スルホメチルフエノールは他の試薬で用
いた３―メチル−４−ブロモフエノール、３−
メトキシフエノール、２―メトキシフエノール
と比較してクレアチン消去能力において優れて
いる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 試料中の基質又は酵素の酵素反応により生成
した物質(A)に酸化酵素を作成させ、生成する過酸
化水素をペルオキシダーゼの存在下、色原体およ
びカツプラーと反応させ、光学的吸光度測定する
ことにより、試料中の基質または酵素活性を定量
する方法において、(i)酸化酵素と(ii)ペルオキシダ
ーゼと(iii)下記一般式()で表わされるフエノール
誘導体を含む試液を第１試液とし、(iv)カツプラー
を含む試液を第２試液とし、試料に第１試液を加
えた後、第２試液を加え吸光度測定することを特
徴とする基質又は酵素活性の定量方法。 一般式()： （式中、R1は炭素原子数が１〜５である低級アル
キル基あるいは水酸基またはスルホン酸基を有す
る炭素原子数１〜５である低級アルキル基を示
す。R2は水素、ハロゲンまたは炭素原子数が
１〜５である低級アルキル基、炭素原子数が１
〜５である低級アシル基、炭素原子数が１〜５
である低級アルキルエーテル基あるいは炭素原
子数が１〜５である低級アルコキシカルボニル基
を示す。ｎ＝０又は１である。）
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5928582A JPS58175496A (ja) | 1982-04-08 | 1982-04-08 | 基質または酵素活性の定量方法 |
| US06/823,836 US4778757A (en) | 1982-04-08 | 1986-01-30 | Method for the determination of substrates or enzyme activities |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5928582A JPS58175496A (ja) | 1982-04-08 | 1982-04-08 | 基質または酵素活性の定量方法 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11387083A Division JPS5911197A (ja) | 1982-04-08 | 1983-06-23 | 基質または酵素活性の定量方法 |
| JP11386983A Division JPS5911196A (ja) | 1982-04-08 | 1983-06-23 | 基質または酵素活性の定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58175496A JPS58175496A (ja) | 1983-10-14 |
| JPS6237960B2 true JPS6237960B2 (ja) | 1987-08-14 |
Family
ID=13108964
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5928582A Granted JPS58175496A (ja) | 1982-04-08 | 1982-04-08 | 基質または酵素活性の定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58175496A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01171024U (ja) * | 1988-05-20 | 1989-12-04 | ||
| JPH0324U (ja) * | 1989-05-19 | 1991-01-07 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59183698A (ja) * | 1983-04-02 | 1984-10-18 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 基質又は酵素活性の定量方法 |
| JP6437430B2 (ja) * | 2012-03-23 | 2018-12-12 | サーモディクス アイヴィディ インコーポレイテッド | スルホン酸を含むインビトロの診断テスト用組成物および方法 |
-
1982
- 1982-04-08 JP JP5928582A patent/JPS58175496A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01171024U (ja) * | 1988-05-20 | 1989-12-04 | ||
| JPH0324U (ja) * | 1989-05-19 | 1991-01-07 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58175496A (ja) | 1983-10-14 |
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