JPH0434400B2

JPH0434400B2 -

Info

Publication number: JPH0434400B2
Application number: JP1623785A
Authority: JP
Inventors: Kyomi Tamai; Juzo Hayashi; Minoru Ando
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1985-01-29
Filing date: 1985-01-29
Publication date: 1992-06-05
Also published as: JPS61173799A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明は体液中の基質又は酵素活性の定量方法
に関するものである。体液中の基質又は酵素活性を酵素法を用いて測
定することは臨床診断の場における有用な情報を
与えるものとして臨床的意義が高い。（従来の技術）近年、酵素を用いる基質又は酵素活性の定量、
特に酸化酵素を用い生じた過酸化水素を測定する
方法が盛んに用いられている。ところが最近これらの測定方法を用いた体液中
の基質又は酵素活性の定量において反応系に関与
する体液中の内因性物質が、目的とする基質又は
酵素活性の測定に正の誤差を与えることが問題と
なつてきている。例えばトリグリセライドを測定
する場合の遊離グリセロール、クレアチニンを測
定する場合のクレアチン、ザルコシン、エステル
型コレステロールを測定する場合の遊離コレステ
ロール、アミラーゼ活性を測定する場合のグルコ
ース、GOT、GPT活性を測定する場合のピルビ
ン酸、シアル酸を測定する場合のピルビン酸、グ
アナーゼ活性を測定する場合の尿酸等々がそれで
ある。従来、それらの問題点の対策として実施されて
きた方法は、１つは内因性の物質を検体ブランク
として差引く方法がある。この方法は誤差を防ぐ
ことはできるが、検体ブランク用の試薬が別に必
要になり、更にその為の測定操作が加わり、煩雑
な方法で自動分析機等への適用性が低く実用的で
ない。第２の方法は内因性の物質に直接又は他の
酵素との共存下、酸化酵素を作用させ、生じた過
酸化水素にペルオキシダーゼ存在下、それ自身ペ
ルオキシダーゼ存在下自己縮合して可視部に吸収
をほとんど示さない化合物を作用させて、過酸化
水素を消費してから目的とする基質又は酵素活性
を測定する方法がある。例えば特公昭57−29159
号公報に示される４−アミノアンチピリンやフエ
ノールをその消去剤（過酸化水素を自己縮合して
可視部に吸収をほとんど示さない化合物）とする
方法があるが、実際にはペルオキシダーゼ、過酸
化水素存在下、自己縮合した４−アミノアンチピ
リンの縮合物は可視部に吸収を少し有する物質
（測定波長で影響を与える物質）であり、目的と
する基質又は酵素活性の比色測定に正の誤差を与
える。特に微量の体液中物質を測定する場合に
は、わずかの可視部の吸収でも測定値には大きな
正誤差を与えることになる欠点がある。又、この方法は可視部の比色定量法としては正
誤差を低減させることが可能であるが、紫外部の
定量としては自己縮合した化合物自身の吸収が紫
外部に存在する為に有効な方法とはならない。（発明の解決しようとする問題点）本発明の目的は簡便で正確性に優れ、自動分析
機への適用性の良い体液中の基質及び酵素活性を
測定する方法を提供することである。（問題点を解決するための手段）従来、ペルオキシダーゼを用いて過酸化水素を
定量する系において、カタラーゼを使用すること
は過酸化水素の分解につながり、測定に負誤差を
与えるということで、通常、共存使用することは
考えられなかつた。その為にペルオキシダーゼ系
でカタラーゼの影響が考えられるような場合はカ
タラーゼの阻害剤であるアジ化ナトリウム等を使
用することの方が一般的であつた。ところが本発
明者らは鋭意検討した結果、意外にもペルオキシ
ダーゼの系でカタラーゼを、共存するペルオキシ
ダーゼの１〜10倍（活性値）で使用することによ
り、上記目的を達成することが出来ることを見出
した。つまり、第１試薬に酸化酵素及びカタラー
ゼを含有させた試薬を用い、第２試薬に検出剤を
含有させた試薬を用い、試料にまず第１試薬を作
用させた後、続いて第２試薬を作用させて生じた
吸光度の変化を測定することにより、試料中の基
質又は酵素活性を正確かつ簡単に測定でき、しか
も自動分析機への適用性に優れた本発明に到達す
ることができた。すなわち本発明は基質又は酵素反応により生成
した物質に酸化酵素を作用させ、生成する過酸化
水素をペルオキシダーゼ系で測定することによ
り、試料中の基質又は酵素活性を定量する方法に
おいて、（）酸化酵素および（）カタラーゼ
を含む試薬を第１試薬とし、（）検出剤を含む
試薬を第２試薬とし、さらに（）ペルオキシダ
ーゼが第１試薬および／又は第２試薬に含有され
ていて、（）カタラーゼが（）ペルオキシダ
ーゼの１〜10倍（活性値）であつて、試料に第１
試薬を加えた後、カタラーゼ阻害剤を添加するこ
となく、第２試薬を加え、生じた吸光度を測定す
ることを特徴とする基質又は酵素活性の定量方法
である。本発明において定量する基質及び酵素として
は、試料中に、その基質及び酵素を測定する反応
系に関与する内因性物質が同時に含まれる試料で
あれば、何でも適用が可能である。例えばトリグ
リセライド、クレアチニン、クレアチン、エステ
ル型コレステロール、シアル酸、アミラーゼ、
GOT、GPT、グアナーゼ等がある。基質及び酵素活性の測定の妨害となる内因性物
質としては、例えばトリグリセライドの場合の遊
離グリセロール、クレアチニンの場合のクレアチ
ン、ザルコシン、クレアチンの場合のザルコシ
ン、エステル型コレステロールの場合の遊離コレ
ステロール、シアル酸の場合のピルビン酸、アミ
ラーゼの場合のグルコース、GOT、GPTの場合
のピルビン酸、グアナーゼの場合の尿酸等があ
る。本発明における（）酸化酵素としては、例え
ばグリセロールオキシダーゼ、グリセロリン酸オ
キシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、コレステ
ロールオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、ウリカーゼ等があり、
過酸化水素を発生する酸化酵素であれば、いかな
る起源のものでもよい。本発明において使用する（）カタラーゼとし
てはいかなる起源のものでもよい。例えば肝、赤
血球、腎等に含まれる動物臓器由来のものや、ミ
クロコツカス属等に含まれる微生物由来のもの等
がある。本発明における（）検出剤としてはペルオキ
シダーゼ存在下、過酸化水素によつて分光学的に
吸収の変化を生じさせるものであればいかなるも
のでも良い。例えば４−アミノアンチピリン
（4AA）とアニリン誘導体、４−アミノアンチピ
リンとフエノール誘導体、３−メチル−２−ベン
ゾチアゾリノンヒドラゾン（MBTH）とアニリ
ン誘導体又は４−アミノアンチピリン単独、アニ
リン誘導体単独、フエノール誘導体単独等が考え
られる。アニリン誘導体としてはＮ，Ｎ−ジエチル−ｍ
−トルイジン（DET）、ジエチルアニリン
（DEA）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピ
ル）−ｍ−アニシジン（ADPS）などがある。フエノール誘導体としては、ｐ−クロロフエノ
ール、２−スルホキシ−４−クロロフエノールな
どがある。検出剤が４−アミノアンチピリンまたは３−メ
チル−２−ベンゾチアゾルノンヒドラゾン等の色
原体とアニリン誘導体又はフエノール誘導体との
二種類の化合物から構成されている場合、その内
の１種、好ましくはアニリン誘導体又はフエノー
ル誘導体は必ず第２試薬に含まれなければならな
いが、他の１種は第１試薬又は第２試薬のどちら
に含まれていてもよい。本発明において、第１試薬及び第２試薬には前
記成分に加えてペルオキシダーゼ、緩衝剤及び必
要により酸化酵素、ペルオキシダーゼ以外の酵
素、基質、界面活性剤、安定化剤、各種妨害物質
除去剤等を含んでよい。ペルオキシダーゼは第１
試薬、第２試薬どちらに含まれても良いが好まし
くは第１試薬の方が良い。緩衝剤としては特に制限はなく、その反応系に
適当なpHを保つことができるものならば、いか
なる種類のものでも良いが、通常５〜10に調製す
るものが好ましい。カタラーゼの濃度としては、共存するペルオキ
シダーゼの濃度に支配され、ペルオキシダーゼ濃
度の１〜10倍（活性値）である。10倍（活性値）
を越えると検出系の感度の低下につながるので適
当でない。またカタラーゼの濃度がペルオキシダーゼの濃
度の１倍（活性値）未満であると、試料中の共存
する測定誤差を生じる物質の計り込みを行う。カタラーゼの活性値は、次の方法に従つて測定
する。１試験管内に過酸化水素溶液0.25mlを入れ、25
℃で約５分間平衡化する。２酵素溶液0.25mlを加え、混合する。３ 25℃で５分間インキユベートした後、チタニ
ウム試薬2.5mlを加えて反応を停止させた後、
水を対照として410nmの光学密度（OD_test）を
測定する。４同時に過酸化水素溶液を25℃で５分間インキ
ユベートした後、チタニウム溶液2.5mlと混合
し、次いで酵素溶液を添加してブランクを調製
し、水を対照として410nmの光学密度を
（OD_blaok）を測定する。５次式に従つて、活性値を測定する。活性値（単位／ml）＝（OD_test−OD_blaok）×2.4×１／0.7×df ここで、dfとは酵素溶液の希釈率の逆数であ
る。ペルオキシダーゼ活性値は、次の方法に従つて
測定する。１試験管内に1/250Ｍ過酸化水素溶液1ml、1/1
０００Mo−アミノフエノール・塩酸溶液1mlおよ
び1/5Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）2mlを入れ、25
℃で５分間平衡化させた。２酵素溶液0.5mlを加え、３分間反応させる。３ 1N−塩酸0.5mlで反応を停止させた後、水を
対照として480nmの光学密度を（OD_test）を測
定する。４同時に過酸化水素溶液を25℃で５分間インキ
ユベートした後、チタニウム溶液2.5mlと混合
し、次いで酵素溶液を添加してブランクを調製
し、水を対照として480nmの光学密度を
（OD_blaok）を測定する。５次式に従つて、活性値を測定する。活性値（単位／ml）＝（OD_test−OD_blaok）×0.48×df ここで、dfとは酵素溶液の希釈率の逆数であ
る。次に具体的な基質又は酵素活性の定量方法およ
び定量試薬について説明する。トリグリセライドの定量試料に下記第１試薬を加えた後、下記第２試薬
を加え、生じた吸光度を測定する。第１試薬グリセロールキナーゼＬ−α−グリセロールリン酸オキシダーゼペルオキシダーゼカタラーゼ ATP 第２試薬リポプロテインリバーゼ検出剤｛4AA（４−アミノアンチピリン） DET（Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン）上記定量方法は下記反応に従う。トリグリセライドリポプロチインリパーセ ――――――――――――――→ グリセロール＋脂肪酸グリセロール＋ATPグリセロールキナーゼ ―――――――――――――→ グリセロール−３−リン酸＋ADP グリセロール−３−リン酸＋O₂Ｌ−ａ−グリセロー
ル ――――――――――――――→ リン酸オキシターゼジヒドロキシアセトン＋H₂O₂ 2H₂O₂＋4AA＋DETペルオキシダーゼ ――――――――――――→ キノン色素＋4H₂Ｏクレアチニンの定量試料に下記第１試薬を加えた後、下記第２試薬
を加え、生じた吸光度を測定する。第１試薬クレアチンアミジノヒドロラーゼザルコシンオキシダーゼペルオキシダーゼカタラーゼ第２試薬クレアチニンアミドヒドロラーゼ検出剤｛4AA DEA（ジエチルアニリン）クレアチンの定量試料に下記第１試薬を加えた後、下記第２試薬
を加え、生じた吸光度を測定する。第１試薬ザルコシンオキシダーゼペルオキシダーゼカタラーゼ第２試薬クレアチンアミドヒドロラーゼ検出剤｛4AA DEA 上記定量法は下記反応に従う。クレアチニン＋H₂Ｏクレアチニンアミドビドロラー
ゼ ――――――――――――――――――→ クレアチン＋尿素クレアチン＋₂Ｏクレアチンアミシノヒドロラーゼ ――――――――――――――――――→ ザルコシン＋尿素ザルコシン＋H₂Ｏ＋O₂ザルコシンオキシダーゼ ――――――――――――――→ ホルムアルデヒド＋グリシン＋H₂O₂ 2H₂O₂4AA＋DEAペルオキシダーゼ ―――――――――――→ キノン色素＋4H₂Ｏエステル型コレステロールの定量試料に下記第１試薬を加えた後、下記第２試薬
を加え、生じた吸光度を測定する。第１試薬コレステロールオキシダーゼペルオキシダーゼカタラーゼ第２試薬コレステロールエステラーゼ検出剤｛4AA DEA 上記定量方法は下記反応に従う。エステル型コレステロール＋H₂Ｏコレステロールエ
ステラーゼ ――――――――――――――――→ 遊離コレステロール＋脂肪酸遊離コレステロール＋O₂コレステロールオキシダー
ゼ ――――――――――――――――→ コレステノン＋H₂O₂ 2H₂O₂＋4AA＋DEAペルオキシダーゼ ―――――――――――→ キノン色素＋4H₂Ｏアミラーゼの定量試料に下記第１試薬を加えた後、下記第２試薬
を加え、生じた吸光度を測定する。第１試薬グルコースオキシダーゼカタラーゼペルオキシダーゼ β−グルコシダーゼ第２試薬デンプン（基質）検出剤｛4AA DEA 上記定量方法は下記反応に従う。デンプンα−アミラーゼ ――――――――――→ マルトースマルトースβ−グルコシダーゼ ――――――――――――→ ２グルコースグルコース＋O₂グルコースオキシダーゼ ――――――――――――――→ グルコン酸＋H₂O₂ 2H₂O₂＋4AA＋DEAペルオキシダーゼ ―――――――――――→ キノン色素＋4H₂Ｏ基質としてはデンプンの他に修飾デンプン、オ
リゴグルコピラノサイド等を用いることができ
る。またβ−グルコシダーゼに代えてα−グルコ
シダーゼを用いてもよい。 GPTの定量試料に下記第１試薬を加えた後、下記第２試薬
を加え、生じた吸光度を測定する。第１試薬ピルビン酸オキシダーゼペルオキシダーゼカタラーゼリン酸 DL−アラニン（基質）第２試薬 α−ケトグルタル酸（基質）検出剤｛4AA DEA 上記定量方法は下記反応に従う。 DL−アラニン＋α−ケトグルタル酸GPT ――――――→ ピルビン酸＋Ｌ−グルタミン酸ピルビン酸＋O₂＋リン酸ピルビン酸オキシダーゼ ――――――――――――――→ アセチルリン酸＋CO₂＋H₂O₂ 2H₂O₂＋4AA＋DEAペルオキシダーゼ ―――――――――――→ キノン色素＋4H₂Ｏ GOTの定量試料に下記第１試薬を加えた後、下記第２試薬
を加え、生じた吸光度を測定する。第１試薬ピルビン酸オキシダーゼリン酸ペルオキシダーゼカタラーゼアスパラギン酸（基質）オキザロ酢酸デカルボキシラーゼ第２試薬 α−ケトグルタル酸（基質）検出剤｛4AA DEA 上記定量方法は下記反応に従う。Ｌ−アスパラギン酸＋α−ケトグルタル酸GOT ――――――→ オキザロ酢酸＋Ｌ−グルタミン酸オキザロ酢酸オキザロ酢酸デカルボキシダーゼ ――――――――――――――――――→ ピルビン酸＋CO₂ ピルビン酸＋O₂＋リン酸ピルビン酸オキシダーゼ ――――――――――――――→ アセチルリン酸＋CO₂＋H₂O₂ 2H₂O₂＋4AA＋DEAペルオキシダーゼ ―――――――――――→ キノン色素＋4H₂Ｏシアル酸の定量試料に下記第１試薬に加えた後、下記第２試薬
を加え、生じた吸光度を測定する。第１試薬ピルビン酸オキシダーゼカタラーゼペルオキシダーゼ第２試薬ノイラミンダーゼＮ−アセチルノイラミン酸オキシダーゼ検出剤｛4AA ADPS 上記定量方法は下記反応に従う。シアル酸ノイラミンダーゼ ―――――――――――→ Ｎ−アセチルノイラミン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸Ｎ−アセチルノイラミン
酸 ―――――――――――――――→ オキシダーゼＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン＋ピルビン酸ピルビン酸ピルビン酸オキシダーゼ ――――――――――――――→ アセチルリン酸＋CO₂＋H₂O₂ H₂O₂＋4AA＋ADPSペルオキシダーゼ ―――――――――――→ キノン色素グアナーゼの定量試料に下記第１試薬に加えた後、下記第２試薬
を加え、生じた吸光度を測定する。第１試薬キサンチンオキシダーゼウリカーゼペルオキシダーゼカタラーゼ第２試薬グアニン（基質）検出剤｛MBTH ADPS 上記定量方法は下記反応に従う。グアニングアナーゼ ――――――――→ キサンチン＋NH₃ キサンチンキサンチンオキシダーゼ ――――――――――――――→ 尿酸＋H₂O₂ 尿酸ウリカーゼ ――――――――→ アラントイン＋H₂O₂ 2H₂O₂＋MBTH＋ADPSペルオキシダーゼ ―――――――――――→ キノン色素（作用）本発明の定量方法は試料中に共存する測定誤差
を生じる物質（内因性物質）の計り込みをなくし
て、真の基質又は酵素活性を簡便に正確度高く測
定することを可能とし、更に自動分析機への適用
性の良いものを提供することが可能となつた。（実施例）以下、本発明を実施例により詳細に説明する。実施例１サンプル中のトリグリセライドを下記試薬を用
い、下記方法により測定した。１サンプルグリセリン（104mg／dl）溶液血清：水＝９：１血清：グリセリン（1040mg／dl）溶液＝９：１２試薬Ａ：第１試薬トリス緩衝液（pH7.0）グリセロキナーゼ 2.0単位／ml グリセロリン酸オキシダーゼ 6.0単位／ml ペルオキシダーゼ 10.0単位／ml カタラーゼ 50.0単位／ml 第２試薬トリス緩衝液（pH7.0）リポプロテインリパーゼ 600単位／ml ４−アミノアンチピリン 10mg／dl Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル） −ｍ−アニシジン 90mg／dl Ｂ：Ａの第１試薬よりカタラーゼを抜いたもの。
他はＡと同じ。Ｃ：Ａの第１試薬よりカタラーゼを抜いて第２試
薬の４−アミノアンチピリンを第１試薬に移し
たもの。他はＡと同じ。Ｄ：の第１試薬よりカタラーゼを抜いたかわりに
フエノールを５mg／dl添加したもの。３測定法各サンプル20μに第１試薬２mlを加え、37
℃、５分間反応させた後、第２試薬１mlを加えて
37℃にて10分間反応させ、波長540nmで測定し
た。その結果を第１表に示す。

【表】試薬Ａでは蒸留水とサンプル〔グリセリン
（104mg／dl）溶液〕の吸光度が略等しく、サンプ
ル（血清：水＝９：１）およびサンプル〔血
清：グリセロリン（104mg／dl）溶液＝９：１）
の吸光度が略等しいことから、グリセリンの測り
込みがないことが明らかである。実施例２サンプル中のトリグリセライドを下記試薬を用
い、下記方法により測定した。１サンプル実施例１で使用したサンプル，，２試薬実施例１で使用した試薬Ａ組成のものでカタラ
ーゼ濃度を第２表の濃度のものを使用した。

【表】３測定法実施例１と同じ方法で測定した結果を第３表に
示す。

【表】第３表からカタラーゼがペルオキシダーゼより
10倍より多く含まれる（試薬Ｇ）とグリセリンの
影響が生じないが、感度の低下がみられる（吸光
度の低下）ことがわかる。10倍以内（試薬Ａ，
Ｅ，Ｆ）では感度の低下もみられない。実施例３サンプル中のクレアチニンを下記試薬を用い、
下記方法により測定した。１サンプルクレアチン（10mg／dl）溶液クレアチニン（10mg／dl）溶液：水＝１：１クレアチニン（10mg／dl）溶液＝クレアチン
（10mg／dl）溶液＝１：１２試薬Ａ：第一試薬リン酸緩衝液（pH7.5）クレアチンアミジニヒドラーゼ 20U／ml ザルコシンオキシダーゼ 5U／ml ペルオキシダーゼ 10U／ml カタラーゼ 50U／ml ４−アミノアンチピリン 10mg／dl Ｂ：第二試薬リン酸緩衝液（pH7.5）クレアチニンアミドヒドロラーゼ 50U／ml Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）− ｍ−トルイジン 50mg／dl ３測定法各サンプル150μに第１試薬2.0mlを加え37℃
で10分間反応させた後、第２試薬を2.0mlを加え
て37℃で15分間反応させ、波長550nmで測定し
た。その結果を第４表に示す。

【表】第４表よりサンプルの吸光度と蒸留水をサン
プルとした試薬ブランクが略等しく又はサンプル
及びクレアチニンにクレアチンが混合されたサ
ンプルの吸光度がほぼ等しいことからクレアチ
ニンを測定する場合クレアチンの測り込みがない
ことが明らかである。比較例１実施例３の第一試薬をサンプルと反応させ、ク
レアチンを消費し、生じた過酸化水素をカタラー
ゼで分解させ、次いでアジ化ナトリウムを添加
し、実施例３の第二試薬を添加して、実施例３と
同様にしてクレアチニンの測定を行つた。その結果を第５表に示す。

【表】第５表からアジ化ナトリウムの添加により、
，のサンプルの吸光度が減少しており、発色
色素の退色が生じていることが明らかである。

Claims

【特許請求の範囲】

１基質又は酵素反応により生成した物質に酸化
酵素を作用させ、生成する過酸化水素をペルオキ
シダーゼ系で測定することにより、試料中の基質
又は酵素活性を定量する方法において、（）酸
化酵素および（）カタラーゼを含む試薬を第１
試薬とし、（）検出剤を含む試薬を第２試薬と
し、さらに（）ペルオキシダーゼが第１試薬お
よび／又は第２試薬に含有されていて、（）カ
タラーゼが（）ペルオキシダーゼの１〜10倍
（活性値）であつて、試料に第１試薬を加えた後、
カタラーゼ阻害剤を添加することなく、第２試薬
を加え、生じた吸光度を測定することを特徴とす
る基質又は酵素活性の定量方法。