JP2562882B2 - 生体成分測定用試薬の安定化法 - Google Patents
生体成分測定用試薬の安定化法Info
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- JP2562882B2 JP2562882B2 JP61285957A JP28595786A JP2562882B2 JP 2562882 B2 JP2562882 B2 JP 2562882B2 JP 61285957 A JP61285957 A JP 61285957A JP 28595786 A JP28595786 A JP 28595786A JP 2562882 B2 JP2562882 B2 JP 2562882B2
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- reagents
- oxidase
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、酸化酵素の反応を利用した２試薬系の生体
成分測定用試薬の盲検値（ブランク）の低下・安定化を
はかるものであり、主として臨床診断薬の品質の向上に
役立てるものである。
成分測定用試薬の盲検値（ブランク）の低下・安定化を
はかるものであり、主として臨床診断薬の品質の向上に
役立てるものである。
［従来の技術］ 現在まで、生体成分を測定する試薬、例えば血清中の
遊離脂肪酸、トリグリセライド、コレステロール、尿
酸、グルコース等を測定する様々な試薬が開発されてい
る。特に近年は、酵素法が開発され、より短時間により
正確にこれらの物質の測定ができるようになった。酵素
法では主に測定しようとする生体成分そのものに作用す
る、あるいはその生体成分から酵素により二次的に生成
した物質に作用する酸化酵素が用いられる。即ち、酸化
酵素の作用で生成する過酸化水素を、フェノール系化合
物あるいはアニリン系化合物の適当な水素供与体と４−
アミノアンチピリンあるいはメチルベンズチアゾロンヒ
ドラゾン等の適当な酸化性色素カップラーとでパーオキ
シダーゼの存在下発色させ（酸化性色素カップリング反
応）、その吸光度を測定することにより目的の生体成分
の測定を行なう。
遊離脂肪酸、トリグリセライド、コレステロール、尿
酸、グルコース等を測定する様々な試薬が開発されてい
る。特に近年は、酵素法が開発され、より短時間により
正確にこれらの物質の測定ができるようになった。酵素
法では主に測定しようとする生体成分そのものに作用す
る、あるいはその生体成分から酵素により二次的に生成
した物質に作用する酸化酵素が用いられる。即ち、酸化
酵素の作用で生成する過酸化水素を、フェノール系化合
物あるいはアニリン系化合物の適当な水素供与体と４−
アミノアンチピリンあるいはメチルベンズチアゾロンヒ
ドラゾン等の適当な酸化性色素カップラーとでパーオキ
シダーゼの存在下発色させ（酸化性色素カップリング反
応）、その吸光度を測定することにより目的の生体成分
の測定を行なう。
こうした酵素法は、１ステップ法あるいは２ステップ
法で行なわれており、前者は測定用試薬成分が全部一緒
になった１試薬系であり、後者は試薬成分を２つにわけ
た２試薬系を使う。両方法を比較すると、試薬の安定性
あるいは測定する試料中に含まれる還元物質の影響を受
けにくい等の点で一般的に２ステップ法の方が有利であ
る。
法で行なわれており、前者は測定用試薬成分が全部一緒
になった１試薬系であり、後者は試薬成分を２つにわけ
た２試薬系を使う。両方法を比較すると、試薬の安定性
あるいは測定する試料中に含まれる還元物質の影響を受
けにくい等の点で一般的に２ステップ法の方が有利であ
る。
［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら、２ステップ法による生体成分測定試薬
でも１ステップ法と程度の差こそあれ、その保存中に試
薬ブランクの上昇があり、これが大きな問題になる。１
ステップ法は１試薬中に発色系の試薬、即ちパーオキシ
ダーゼ、４−アミノアンチピリン又はメチルベンズチア
ゾロンヒドラゾン等の酸化性色素カップラー、及びフェ
ノール系化合物又はアニリン系化合物等の水素供与体が
共存しているため、その試薬の保存中にこれらの色素が
容易に酸化を受けて発色し試薬ブランクが上昇する傾向
が強い。一方、２ステップ法では２試薬系であるため、
発色系の試薬を酸化性色素カップラーと水素供与体の二
つに分離できるので原理的には試薬ブランクの上昇はな
いはずである。ところが、実際は１ステップ法よりは軽
度であるが徐々に試薬ブランクが上昇する。
でも１ステップ法と程度の差こそあれ、その保存中に試
薬ブランクの上昇があり、これが大きな問題になる。１
ステップ法は１試薬中に発色系の試薬、即ちパーオキシ
ダーゼ、４−アミノアンチピリン又はメチルベンズチア
ゾロンヒドラゾン等の酸化性色素カップラー、及びフェ
ノール系化合物又はアニリン系化合物等の水素供与体が
共存しているため、その試薬の保存中にこれらの色素が
容易に酸化を受けて発色し試薬ブランクが上昇する傾向
が強い。一方、２ステップ法では２試薬系であるため、
発色系の試薬を酸化性色素カップラーと水素供与体の二
つに分離できるので原理的には試薬ブランクの上昇はな
いはずである。ところが、実際は１ステップ法よりは軽
度であるが徐々に試薬ブランクが上昇する。
このような２試薬系で試薬ブランクが上昇する問題に
ついて、本発明者らは詳細な検討を重ねた結果、パーオ
キシダーゼを含有していない方の試薬（第１試薬又は第
２試薬）に原因があることをつきとめた。
ついて、本発明者らは詳細な検討を重ねた結果、パーオ
キシダーゼを含有していない方の試薬（第１試薬又は第
２試薬）に原因があることをつきとめた。
本発明の課題は、上記パーオキシダーゼを含有してい
ない方の試薬の組成を改善し、測定試薬のブランク上昇
を抑える安定な方法を提供することである。
ない方の試薬の組成を改善し、測定試薬のブランク上昇
を抑える安定な方法を提供することである。
［問題点を解決するための手段］ 本発明は、酸化酵素の作用により生成した過酸化水素
をパーオキシダーゼの存在下、酸化性色素カップリング
反応で比色定量することにより目的の生体成分を測定す
る２試薬系の測定用試薬において、パーオキシダーゼを
含有していない方の試薬に特にパーオキシダーゼを添加
し、かつ発色系試薬の水素供与体と酸化性色素カップラ
ーを第１試薬と第２試薬に別々になるように処方するこ
とを特徴とする生体成分測定用試薬の安定化法である。
をパーオキシダーゼの存在下、酸化性色素カップリング
反応で比色定量することにより目的の生体成分を測定す
る２試薬系の測定用試薬において、パーオキシダーゼを
含有していない方の試薬に特にパーオキシダーゼを添加
し、かつ発色系試薬の水素供与体と酸化性色素カップラ
ーを第１試薬と第２試薬に別々になるように処方するこ
とを特徴とする生体成分測定用試薬の安定化法である。
本発明を実施するには、２試薬系測定用試薬のうち発
色系試薬の水素供与体と酸化性色素カップラーを第１試
薬と第２試薬に別々になるように処方し、パーオキシダ
ーゼを含有していない方の試薬に、安定化剤として特に
パーオキシダーゼを添加する。パーオキシダーゼは、結
果的に第１試薬と第２試薬の両方に処方することにな
る。
色系試薬の水素供与体と酸化性色素カップラーを第１試
薬と第２試薬に別々になるように処方し、パーオキシダ
ーゼを含有していない方の試薬に、安定化剤として特に
パーオキシダーゼを添加する。パーオキシダーゼは、結
果的に第１試薬と第２試薬の両方に処方することにな
る。
これに用いるパーオキシダーゼはどのような起源のも
のでもよく、試薬中に0.001U/ml以上の濃度で添加する
と著明な効果がみられる。
のでもよく、試薬中に0.001U/ml以上の濃度で添加する
と著明な効果がみられる。
本発明において過酸化水素を生成させる酸化酵素試薬
とは、目的の生体成分測定に対応し、アシルコエンザイ
ムＡオキシダーゼ、グリセリン−３−リン酸オキシダー
ゼ、グルコスオキシダーゼ、コレステロールオキシダー
ゼ、ウリカーゼ等をさし示す。
とは、目的の生体成分測定に対応し、アシルコエンザイ
ムＡオキシダーゼ、グリセリン−３−リン酸オキシダー
ゼ、グルコスオキシダーゼ、コレステロールオキシダー
ゼ、ウリカーゼ等をさし示す。
発色系試薬の水素供与体としては、フェノール系化合
物又はアニリン系化合物の公知のものを用い、酸化性色
素カップラーとしては、４−アミンアンチピリン又はメ
チルベンズチアゾロンヒドラゾンを用いることができ
る。
物又はアニリン系化合物の公知のものを用い、酸化性色
素カップラーとしては、４−アミンアンチピリン又はメ
チルベンズチアゾロンヒドラゾンを用いることができ
る。
本発明は、実質的にどんな緩衝剤を含む生体成分測定
用試薬においても有効である。一般的にはpH4〜９の範
囲であり、リン酸、トリス、PIPES、HEPES、トリシン、
グリシン等の公知の緩衝剤が用いられる。
用試薬においても有効である。一般的にはpH4〜９の範
囲であり、リン酸、トリス、PIPES、HEPES、トリシン、
グリシン等の公知の緩衝剤が用いられる。
［作用効果］ 各種生体成分を測定する２試薬系の測定用試薬におい
て、パーオキシダーゼを含有していない方の試薬に特に
パーオキシダーゼを添加し、かつ発色系試薬の水素供与
体と酸化性色素カップラーを第１試薬と第２試薬に別々
になるように処方することにより、試薬ブランクの経時
的な上昇を防止することが可能になった。
て、パーオキシダーゼを含有していない方の試薬に特に
パーオキシダーゼを添加し、かつ発色系試薬の水素供与
体と酸化性色素カップラーを第１試薬と第２試薬に別々
になるように処方することにより、試薬ブランクの経時
的な上昇を防止することが可能になった。
以下、実施例により本発明を詳細に示す。
実施例１ 遊離脂肪酸測定用試薬の安定化法 （１）試薬の調製 試薬１ 50mMリン酸二水素カリウム一水酸化カリウム緩衝液
（pH7.0）にアシルコエンザイムＡシンセターゼ0.4U/m
l、コエンザイムA0.3mM、ATP1.5mM、４−アミノアンチ
ピリン2mM、塩化マグネシウム1mMを含有する溶液を調製
し、これに安定化剤としてパーオキシダーゼを、0.001U
/ml、0.01U/ml、0.1U/mlあるいは1U/mlとなるように加
える。これを第１試薬として、遮光容器中、２〜８℃で
７日間保存する。
（pH7.0）にアシルコエンザイムＡシンセターゼ0.4U/m
l、コエンザイムA0.3mM、ATP1.5mM、４−アミノアンチ
ピリン2mM、塩化マグネシウム1mMを含有する溶液を調製
し、これに安定化剤としてパーオキシダーゼを、0.001U
/ml、0.01U/ml、0.1U/mlあるいは1U/mlとなるように加
える。これを第１試薬として、遮光容器中、２〜８℃で
７日間保存する。
試薬２ 10mMリン酸二水素カリウム一水酸化カリウム緩衝液
（pH7.0）にアシルコエンザイムＡオキシダーゼ5U/ml、
FAD3μＭ、Ｎ−エチルマレイミド1mM、パーオキシダー
ゼ4U/ml、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）−ｍ−トルイジン3mMを含有する溶液を
調製する。これを第２試薬として遮光容器中、２〜８℃
で７日間保存する。
（pH7.0）にアシルコエンザイムＡオキシダーゼ5U/ml、
FAD3μＭ、Ｎ−エチルマレイミド1mM、パーオキシダー
ゼ4U/ml、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）−ｍ−トルイジン3mMを含有する溶液を
調製する。これを第２試薬として遮光容器中、２〜８℃
で７日間保存する。
（２）測定操作 精製水0.05mlに試薬１を1.0ml加えて、37℃で５分間
放置し、次いで試薬２を2.0ml加えて37℃で５分間反応
後、吸光度を555nmで測定する。（水を対照） 比較例１ 実施例１の試薬１におけるパーオキシダーゼのみ除い
て、他は全く同一の試薬１、２を調製し、操作法につい
ても実施例１と同様とする。
放置し、次いで試薬２を2.0ml加えて37℃で５分間反応
後、吸光度を555nmで測定する。（水を対照） 比較例１ 実施例１の試薬１におけるパーオキシダーゼのみ除い
て、他は全く同一の試薬１、２を調製し、操作法につい
ても実施例１と同様とする。
（３）結果 第１表に示した通り、パーオキシダーゼを含んでいな
い第１試薬にパーオキシダーゼを添加することにより、
試薬ブランクの上昇が著しく抑えられた。
い第１試薬にパーオキシダーゼを添加することにより、
試薬ブランクの上昇が著しく抑えられた。
実施例２ トリグリセライド測定用試薬の安定化法 （１）試薬の調製 試薬１ 20mMPIPES一水酸化ナトリウム緩衝液（pH7.0）にグリ
セロール−３−リン酸オキシダーゼ6U/ml、グリセロキ
ナーゼ0.5U/ml、ATP1.5mM、塩化マグネシウム20mM、パ
ーオキシダーゼ3U/ml、Ｎ−（２−カルボキシエチル）
−Ｎ−エチル−ｍ−トルイジン2mMを含有する溶液を調
製する。これを第１試薬として、遮光容器中、２〜８℃
で30日間保存する。
セロール−３−リン酸オキシダーゼ6U/ml、グリセロキ
ナーゼ0.5U/ml、ATP1.5mM、塩化マグネシウム20mM、パ
ーオキシダーゼ3U/ml、Ｎ−（２−カルボキシエチル）
−Ｎ−エチル−ｍ−トルイジン2mMを含有する溶液を調
製する。これを第１試薬として、遮光容器中、２〜８℃
で30日間保存する。
試薬２ 20mMPIPES一水酸化ナトリウム緩衝液（pH7.0）にリポ
プロテインリパーゼ500U/ml、４−アミノアンチピリン
1.5mMを含有する溶液を調製し、これに安定化剤として
パーオキシダーゼを0.1U/mlとなるように加える。これ
を第２試薬として遮光容器中、２〜８℃で30日間保存す
る。
プロテインリパーゼ500U/ml、４−アミノアンチピリン
1.5mMを含有する溶液を調製し、これに安定化剤として
パーオキシダーゼを0.1U/mlとなるように加える。これ
を第２試薬として遮光容器中、２〜８℃で30日間保存す
る。
（２）測定操作 精製水0.02mlに試薬１を1.5ml加えて、37℃で５分間
放置し、次いで試薬２を1.5ml加えて37℃で５分間反応
後、吸光度を550nmで測定する。（水を対照） 比較例２ 実施例２の試薬２におけるパーオキシダーゼのみ除い
て、他は全く同一の試薬１、２を調製し、操作法につい
ても実施例２と同様とする。
放置し、次いで試薬２を1.5ml加えて37℃で５分間反応
後、吸光度を550nmで測定する。（水を対照） 比較例２ 実施例２の試薬２におけるパーオキシダーゼのみ除い
て、他は全く同一の試薬１、２を調製し、操作法につい
ても実施例２と同様とする。
（３）結果 第２表に示した通り、パーオキシダーゼを含んでいな
い第２試薬にパーオキシダーゼを添加することにより、
試薬ブランクの安定性が著しく向上した。
い第２試薬にパーオキシダーゼを添加することにより、
試薬ブランクの安定性が著しく向上した。
Claims (1)
- 【請求項１】酸化酵素の作用により生成した過酸化水素
をパーオキシダーゼの存在下、酸化性色素カップリング
反応で比色定量することにより目的の生体成分を測定す
る２試薬系の測定用試薬において、パーオキシダーゼを
含有していない方の試薬に特にパーオキシダーゼを添加
し、かつ発色系試薬の水素供与体と酸化性色素カップラ
ーを第１試薬と第２試薬に別々になるように処方するこ
とを特徴とする生体成分測定用試薬の安定化法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61285957A JP2562882B2 (ja) | 1986-12-02 | 1986-12-02 | 生体成分測定用試薬の安定化法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61285957A JP2562882B2 (ja) | 1986-12-02 | 1986-12-02 | 生体成分測定用試薬の安定化法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30047895A Division JP2663257B2 (ja) | 1995-10-26 | 1995-10-26 | 生体成分測定用試薬の安定化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63246665A JPS63246665A (ja) | 1988-10-13 |
| JP2562882B2 true JP2562882B2 (ja) | 1996-12-11 |
Family
ID=17698143
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61285957A Expired - Lifetime JP2562882B2 (ja) | 1986-12-02 | 1986-12-02 | 生体成分測定用試薬の安定化法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2562882B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5718059B2 (ja) * | 2009-02-06 | 2015-05-13 | 積水メディカル株式会社 | ブランク試料 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2612725C3 (de) * | 1976-03-25 | 1979-05-03 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin |
| CA1100023A (en) * | 1976-08-19 | 1981-04-28 | Charles T. Goodhue | Process and composition for the quantification of glycerol and triglycerides |
| JPS5438196A (en) * | 1977-09-01 | 1979-03-22 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Quantitative determination of neautral fat in serum and composition therefor |
| DE2907628C2 (de) * | 1979-02-27 | 1981-02-05 | C.A. Greiner Und Soehne Gmbh & Co Kg, 7440 Nuertingen | Proberöhrchen für die Untersuchung von Proben im klinischen Bereich, insbesondere von Urinproben |
| JPS5818080A (ja) * | 1981-07-23 | 1983-02-02 | 松下冷機株式会社 | 冷蔵庫 |
| JPS61173799A (ja) * | 1985-01-29 | 1986-08-05 | Toyobo Co Ltd | 基質又は酵素活性の定量方法 |
-
1986
- 1986-12-02 JP JP61285957A patent/JP2562882B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63246665A (ja) | 1988-10-13 |
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