JP2711721B2 - グルコースを含有する試料中の１，５―アンヒドログルシトールの定量法 - Google Patents
グルコースを含有する試料中の１，５―アンヒドログルシトールの定量法Info
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- JP2711721B2 JP2711721B2 JP15822289A JP15822289A JP2711721B2 JP 2711721 B2 JP2711721 B2 JP 2711721B2 JP 15822289 A JP15822289 A JP 15822289A JP 15822289 A JP15822289 A JP 15822289A JP 2711721 B2 JP2711721 B2 JP 2711721B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は糖尿病の診断マーカーとして有用な１、５−
アンヒドログルシトール（以下AGという）の定量法に関
する。
アンヒドログルシトール（以下AGという）の定量法に関
する。
（従来の技術） AGはヒト体液中に含まれ糖尿病の診断マーカーとして
有用であるが、その存在量は少なくアセチル化等の前処
理をしてガスクロマトグラフィーにより定量するか、試
料をイオン交換樹脂等で処理して多量に存在するグルコ
ースを除去してからAGを酵素的方法で定量していた。
有用であるが、その存在量は少なくアセチル化等の前処
理をしてガスクロマトグラフィーにより定量するか、試
料をイオン交換樹脂等で処理して多量に存在するグルコ
ースを除去してからAGを酵素的方法で定量していた。
（発明が解決すべき課題） しかし従来の技術では前処理が繁雑で時間がかかり、
また機器の保守、管理のため分析試料数に制限があるた
め、より簡便にグルコースを除去できかつAGを定量でき
る方法が要望されていた。
また機器の保守、管理のため分析試料数に制限があるた
め、より簡便にグルコースを除去できかつAGを定量でき
る方法が要望されていた。
（課題を解決するための手段） 本発明者らは研究の結果、試料中のグルコースをグル
コキナーゼ、ヘキソキナーゼの様なグルコース６位リン
酸化酵素とアデノシン３リン酸（以下ATPという）でグ
ルコース６リン酸（以下G6Pという）とし、これを更にG
6P脱水素酵素とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
リン酸（酸化型以下NADPという）で酸化するとグルコー
スを完全に消去しうること、そして生じたNADPの還元型
（以下NADPHという）はAGの酵素的定量に際し影響する
のでこの消去液にNADPHを補酵素とする酸化還元酵素並
びに該酸化還元酵素の基質を加えて反応させてるか、NA
DPH脱水素酵素でNADPHを酸化した後であれば試料中のAG
をAG酸化酵素を用いて測定できることを見出だした。即
ち本発明はグルコース及びAGを含有する試料へグルコー
ス６位リン酸化酵素（以下G6P化酵素という）、ATP、G6
P脱水酵素、NADP及び（１）NADPHを補酵素とする酸化還
元酵素並びに該酸化還元酵素の基質又は（２）NADPH脱
水素酵素を添加、反応してグルコース及び生成するNADP
Hを消去して後、該試料中のAGをAG酸化酵素を用いて定
量することを特徴とするグルコース及びAGを含有する試
料中のAGの定量法に関する。
コキナーゼ、ヘキソキナーゼの様なグルコース６位リン
酸化酵素とアデノシン３リン酸（以下ATPという）でグ
ルコース６リン酸（以下G6Pという）とし、これを更にG
6P脱水素酵素とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
リン酸（酸化型以下NADPという）で酸化するとグルコー
スを完全に消去しうること、そして生じたNADPの還元型
（以下NADPHという）はAGの酵素的定量に際し影響する
のでこの消去液にNADPHを補酵素とする酸化還元酵素並
びに該酸化還元酵素の基質を加えて反応させてるか、NA
DPH脱水素酵素でNADPHを酸化した後であれば試料中のAG
をAG酸化酵素を用いて測定できることを見出だした。即
ち本発明はグルコース及びAGを含有する試料へグルコー
ス６位リン酸化酵素（以下G6P化酵素という）、ATP、G6
P脱水酵素、NADP及び（１）NADPHを補酵素とする酸化還
元酵素並びに該酸化還元酵素の基質又は（２）NADPH脱
水素酵素を添加、反応してグルコース及び生成するNADP
Hを消去して後、該試料中のAGをAG酸化酵素を用いて定
量することを特徴とするグルコース及びAGを含有する試
料中のAGの定量法に関する。
本発明で用いられる試料としては、AG及びグルコース
を含むことが予測されるものなら特に制限は無く、例え
ば血液、尿、髄液などの体液や、植物、動物組織などの
抽出物およびそれらの除蛋白物などがあげられる。
を含むことが予測されるものなら特に制限は無く、例え
ば血液、尿、髄液などの体液や、植物、動物組織などの
抽出物およびそれらの除蛋白物などがあげられる。
本発明で用いられるG6P化酵素としては、グルコキナ
ーゼ、ヘキソキナーゼなどがあげられる。これらの酵素
及び本発明で用いられるG6P脱水素酵素はIUPAC-IUBの命
名法で、それぞれ［2.7.1.1］，［2.7.1.2］，［1.1.1.
49］と分類しうるものであれば、特に制限は無く市販の
ものを使用しうる。それらの使用量は試料中のグルコー
ス量により異なるが、概ね試料0.1mlあたり０。１〜10
単位である。
ーゼ、ヘキソキナーゼなどがあげられる。これらの酵素
及び本発明で用いられるG6P脱水素酵素はIUPAC-IUBの命
名法で、それぞれ［2.7.1.1］，［2.7.1.2］，［1.1.1.
49］と分類しうるものであれば、特に制限は無く市販の
ものを使用しうる。それらの使用量は試料中のグルコー
ス量により異なるが、概ね試料0.1mlあたり０。１〜10
単位である。
グルコースのリン酸化に必要なATP量は試料中のグル
コース量により異なるが、通常１〜10mMで良い。
コース量により異なるが、通常１〜10mMで良い。
G6P脱水素酵素による反応に必要なNADP量は試料中の
グルコース量により異なるが通常１〜10mMで良い。
グルコース量により異なるが通常１〜10mMで良い。
本発明で用いられるNADPHを酸化する酵素はNADPHを補
酵素とする酸化還元酵素及びNADPHに直接作用する脱水
素酵素であり、代表的なものとしてはそれぞれグルタミ
ン酸脱水素酵素［1.4.1.3］，［1.4.1.4］及びNADPH脱
水素酵素［1.6.99.1］，［1.6.99.2］があげられる。そ
れらの使用量は試料0.1mlあたり通常0.1〜10単位であ
る。NADPHを補酵素とする酸化還元酵素を用いる反応に
は被還元基質が必要であり、例えばグルタミン酸脱水素
酵素の場合は２−ケトグルタル酸と塩化アンモニューム
の様なアンモニューム塩が試料0.1ml辺りそれぞれ１〜5
0mM及び１〜100mM程度の濃度で用いられる。
酵素とする酸化還元酵素及びNADPHに直接作用する脱水
素酵素であり、代表的なものとしてはそれぞれグルタミ
ン酸脱水素酵素［1.4.1.3］，［1.4.1.4］及びNADPH脱
水素酵素［1.6.99.1］，［1.6.99.2］があげられる。そ
れらの使用量は試料0.1mlあたり通常0.1〜10単位であ
る。NADPHを補酵素とする酸化還元酵素を用いる反応に
は被還元基質が必要であり、例えばグルタミン酸脱水素
酵素の場合は２−ケトグルタル酸と塩化アンモニューム
の様なアンモニューム塩が試料0.1ml辺りそれぞれ１〜5
0mM及び１〜100mM程度の濃度で用いられる。
G6P化反応及びG6P脱水素反応の際には反応を促進する
ため、塩化カリューム及び酢酸マグネシュームの様なカ
リューム、マグネシュームの無機、有機塩類を添加する
ことが望ましくそれぞれ通常１〜50mMの濃度で用いられ
る。
ため、塩化カリューム及び酢酸マグネシュームの様なカ
リューム、マグネシュームの無機、有機塩類を添加する
ことが望ましくそれぞれ通常１〜50mMの濃度で用いられ
る。
G6P化反応、G6P脱水素反応及びNADPH消去反応は通常
１〜50mM、pH6〜10のバッファー中で20〜50C、望ましく
は25〜37Cで５〜10分程度行われる。使用できるバッフ
ァーとしては、リン酸バッファー、トリス塩酸バッファ
ー等がある。
１〜50mM、pH6〜10のバッファー中で20〜50C、望ましく
は25〜37Cで５〜10分程度行われる。使用できるバッフ
ァーとしては、リン酸バッファー、トリス塩酸バッファ
ー等がある。
上記各試薬の試料への添加順序は特に制限は無いが通
常、酵素以外の必要成分を試料へ加え次いで酵素混合液
を添加して反応を開始する。
常、酵素以外の必要成分を試料へ加え次いで酵素混合液
を添加して反応を開始する。
この様にして前処理した試料中のAGを酵素を用いて測
定するにはピラノースオキシダーゼ［1.1.3.10］あるい
はAG酸化酵素を用いる公知の方法、例えばピラノースオ
キシダーゼを作用させて生ずる過酸化水素を指標とした
定量法に関する特開昭63-185397号公報記載の方法や特
開昭62-79780号公報記載の方法で行うことができる。
定するにはピラノースオキシダーゼ［1.1.3.10］あるい
はAG酸化酵素を用いる公知の方法、例えばピラノースオ
キシダーゼを作用させて生ずる過酸化水素を指標とした
定量法に関する特開昭63-185397号公報記載の方法や特
開昭62-79780号公報記載の方法で行うことができる。
（効果） 実施例１ AGを蒸溜水または200mg/mlの濃度のグルコース水溶液
で溶解して各種濃度のAG標準液を調整した。これらの試
料を下に示す様に本発明の方法で処理後、AGをピラノー
スオキシダーゼ（以下PROD）で酸化し、生じた過酸化水
素をパーオキシダーゼ（以下HRP）、４−アミノアンチ
ピリン（以下４−AA）及びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイヂン（以
下TOOS）を用いて発色して吸光度を測定した。グルコー
ス水溶液で調整したAG標準液を直接PRODで酸化し発色し
た場合及び下記の酵素液Ｂからグルタミン酸脱水素酵素
を除去したもので処理した場合をそれぞれ参考例１及び
２として吸光度を測定した。
で溶解して各種濃度のAG標準液を調整した。これらの試
料を下に示す様に本発明の方法で処理後、AGをピラノー
スオキシダーゼ（以下PROD）で酸化し、生じた過酸化水
素をパーオキシダーゼ（以下HRP）、４−アミノアンチ
ピリン（以下４−AA）及びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイヂン（以
下TOOS）を用いて発色して吸光度を測定した。グルコー
ス水溶液で調整したAG標準液を直接PRODで酸化し発色し
た場合及び下記の酵素液Ｂからグルタミン酸脱水素酵素
を除去したもので処理した場合をそれぞれ参考例１及び
２として吸光度を測定した。
〈方法〉 下記の組成の試薬液Ａ及び酵素液Ｂ、Ｃを調整した。
2.5mlの試薬液ＡへAG標準液0.1mlと酵素液B0.1mlを加
え、37Cで30分反応後、酵素液Ｃを0.3ml加え更に60分反
応して555nmの吸光度を測定した。参考例１の場合は酵
素液Ｂからグルコース６リン酸脱水素酵素、参考例２の
場合は酵素液Ｂからグルタミン酸脱水素酵素をそれぞれ
除いた酵素液を用いた。
2.5mlの試薬液ＡへAG標準液0.1mlと酵素液B0.1mlを加
え、37Cで30分反応後、酵素液Ｃを0.3ml加え更に60分反
応して555nmの吸光度を測定した。参考例１の場合は酵
素液Ｂからグルコース６リン酸脱水素酵素、参考例２の
場合は酵素液Ｂからグルタミン酸脱水素酵素をそれぞれ
除いた酵素液を用いた。
試薬液Ａ トリス−塩酸バッファー;10mM,pH9 ATP ;1mM NADP ;1mM 塩化マグネシューム ;20mM ２−ケトグルタル酸 ;10mM 塩化アンモニューム ;20mM 酵素液Ｂ リン酸バッファー ;10mM,pH7 グルコキナーゼ ;50u/ml G6P脱水素酵素 ;35u/ml グルタミン酸脱水素酵素;60u/ml 酵素液Ｃ リン酸バッファー ;200mM,pH5.6 PROD ;25u/ml HRP ;6u/ml ４−AA ;5mM TOOS ;5mM 表の様にグルコースが共存しても本発明の方法によれ
ば、AG濃度と発色度との間には良い直線関係がみられ
た。一方、参考例１で直接PRODを用いて発色した場合は
過大な値となりAGの定量はできないことは明らかであ
る。また参考例２の様にNADPHを消去しない場合は発色
が阻害されAGの測定は不可能である。
ば、AG濃度と発色度との間には良い直線関係がみられ
た。一方、参考例１で直接PRODを用いて発色した場合は
過大な値となりAGの定量はできないことは明らかであ
る。また参考例２の様にNADPHを消去しない場合は発色
が阻害されAGの測定は不可能である。
グルコキナーゼの代わりにヘキソキナーゼを用いて上
と同様の実験を行ったがAGの測定は可能であった。
と同様の実験を行ったがAGの測定は可能であった。
実施例１ ヒト血清中のAGを測定するため、５種類の血清をアミ
コン社製MPS−セントリフリーで除蛋白した。除蛋白試
料及び蒸溜水で溶解したAG標準液を実験例１の方法に準
じて反応、発色しAG標準液による検量線から血清中のAG
濃度を算出した。同時に除蛋白試料を従来の方法である
ガスクロマトグラフィー法（Diabetes 36;709〜715,198
7）でAG及びグルコース含量を測定した。
コン社製MPS−セントリフリーで除蛋白した。除蛋白試
料及び蒸溜水で溶解したAG標準液を実験例１の方法に準
じて反応、発色しAG標準液による検量線から血清中のAG
濃度を算出した。同時に除蛋白試料を従来の方法である
ガスクロマトグラフィー法（Diabetes 36;709〜715,198
7）でAG及びグルコース含量を測定した。
表の如く本発明の方法による結果は、従来の方法であ
るガスクロマトグラフィーによる結果とほぼ近似し、良
い相関を示しグルコースを含む血清中のAGを測定でき
た。
るガスクロマトグラフィーによる結果とほぼ近似し、良
い相関を示しグルコースを含む血清中のAGを測定でき
た。
Claims (1)
- 【請求項１】グルコース及び１、５−アンヒドログルシ
トールを含有する試料へグルコース６位リン酸化酵素、
アデノシン３リン酸、グルコース６リン酸脱水素酵素、
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化
型）及び（１）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
リン酸（還元型）を補酵素とする酸化還元酵素並びに該
酸化還元酵素の基質又は（２）ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドリン酸脱水素酵素を添加、反応してグル
コース及び生成するニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸（還元型）を消去して後、該試料中の１、５
−アンヒドログルシトールを１、５−アンヒドログルシ
トール酸化酵素を用いて定量することを特徴とするグル
コース及び１、５−アンヒドログルシトールを含有する
試料中の１、５−アンヒドログルシトールの定量法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15822289A JP2711721B2 (ja) | 1989-06-22 | 1989-06-22 | グルコースを含有する試料中の１，５―アンヒドログルシトールの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15822289A JP2711721B2 (ja) | 1989-06-22 | 1989-06-22 | グルコースを含有する試料中の１，５―アンヒドログルシトールの定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0327299A JPH0327299A (ja) | 1991-02-05 |
| JP2711721B2 true JP2711721B2 (ja) | 1998-02-10 |
Family
ID=15666954
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15822289A Expired - Fee Related JP2711721B2 (ja) | 1989-06-22 | 1989-06-22 | グルコースを含有する試料中の１，５―アンヒドログルシトールの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2711721B2 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5871949A (en) * | 1996-12-04 | 1999-02-16 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol and reagent for quantitative assay |
| JP4140929B2 (ja) * | 1997-01-17 | 2008-08-27 | 旭化成ファーマ株式会社 | １，５ａｇまたはａｄｐの測定法 |
| CA2291912A1 (en) | 1998-12-11 | 2000-06-11 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method and reagent for quantitative determination of 1,5-anhydroglucitol |
| CN101238374B (zh) | 2005-06-13 | 2012-08-29 | 日本化药株式会社 | 使用全血的血液成分测定方法及测定试剂盒 |
| EP2039765B1 (en) | 2006-06-22 | 2011-10-05 | Ikeda Food Research Co. Ltd. | Method for determination of 1,5-anhydroglucitol, and reagent composition for determination of 1,5-anhydroglucitol |
| ES2382397T3 (es) | 2006-12-14 | 2012-06-07 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | Procedimiento para medir 1,5-anhidroglucitol en sangre completa |
| CN108034694B (zh) * | 2017-12-18 | 2019-01-04 | 广州市进德生物科技有限公司 | 一种1,5-脱水山梨醇的检测试剂盒及其检测方法 |
-
1989
- 1989-06-22 JP JP15822289A patent/JP2711721B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0327299A (ja) | 1991-02-05 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |