JPH0147152B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はグリセロール−３−リン酸オキシダー
ゼの安定化剤に関するものである。

近年、疾病の診断、治療経過の判定のための検
査手技として臨床化学検査の発展は目をみはるも
のがある。特に自動化学分析装置の進歩、普及は
その検査の迅速性と正確性をもたらし、病院検査
の重要な地位を占めるようになつた。

この自動化学分析装置の普及はまた新しいタイ
プの測定試薬の出現を必要とした。すなわち、37
℃付近の緩和な温度で短時間で反応が完結するも
のでなければ装置適用は難しい。この結果、酵素
を用いる酵素的測定法が発展をとげることとなつ
た。現在、ほとんどの血液成分は酵素的測定法に
よつて定量できる。

さらなる要求は、かかる酵素的測定法におい
て、酵素を含有する試液が長期間安定に使用でき
ることである。

例えば、中性脂肪（トリグリセライド）の測定
は脂質代謝異常、糖尿病などの疾患の診断、治療
経過の判定に重要な指標となる試験項目である。

中性脂肪はグリセロールが高級脂肪酸とエステ
ル結合したものであり、酵素を用いる従来の測定
方法では、例えば次の反応によるものがある。

トリグリセライド＋H₂Oリポプロテインリ
パーゼ ――――――――――――→ グリセロール＋脂肪酸 グリセロール＋ATPグリセロールキナーゼ ――――――――――→ グリセロール−３−リン酸＋ADP ADP＋ホスホエノールピルビン酸ピルベー
トキナーゼ ――――――――――→ ピルビン酸＋ATP ピルビン酸＋NADH乳酸脱水素酵素 ――――――――→ 乳酸＋NAD すなわち、NADHが特有の吸収を示す340nm
における吸光度の減少を測ることにより、試料中
のトリグリセライド含量を求める。この方法にお
いては340nmという紫外部域の吸光度を測るため
紫外部分光光度計を必要とし、またこの波長では
試料たとえば血清では検体盲検が大きく影響す
る。

このような従来の測定法に対し、最近、可視域
の波長で測定を可能にする比色定量法が出現し
た。グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを用
いる方法で、次の反応式で示される。

トリグリセライド＋H₂Oリポプロテインリ
パーゼ ―――――――――――→ グリセロール＋脂肪酸 グリセロール＋ATPグリセロールキナーゼ ―――――――――――→ グリセロール−３−リン酸＋ADP グリセロール−３−リン酸＋O₂グリセロー
ル−３−リン酸オキシダーゼ ―――――――――――――――――――――→ ジヒドロキシアセトンリン酸＋H₂O₂ H₂O₂＋H₂A（還元型）ペルオキシダーゼ ―――――――――→ Ａ（酸化型）＋H₂O 上記反応式で可視域に呈色を示す指示薬を用い
れば可視域比色定量法となり、従来法の欠点を排
除したトリグリセライド定量法が可能となつた。

グリセロール−３−リン酸オキシダーゼは、ア
エロコツカス属菌あるいはストレプトコカス属菌
等より得られる。しかるに、これら菌株より得ら
れたグリセロール−３−リン酸オキシダーゼは特
に水溶液としたとき、安定性がよくないという問
題があることが判つた。

自動化学分析装置に適用可能な試液の最も重要
な性質は試液として安定であることである。

グリセロール−３−リン酸オキシダーゼのこの
重大な欠点の改善方法について本出願人らは鋭意
研究を行ない、酸性アミノ酸（アミノジカルボン
酸）が該酵素に特異的に安定化効果を有すること
を見出だし、本発明を完成した。

酵素の本体はタンパク質であり、そのタンパク
質の空間的構造により、独特の酵素作用を示す
が、その高次構造は種々の要因によつて変化を受
け、失活を示す。したがつて何らかの方法で安定
化させる必要がある。

酵素の安定化方法は種々ある。その１は基質、
補酵素の添加法である。酵素タンパク中には、局
所的に、エネルギー的に不安定なひずみのある部
位があり、このような部位が酵素活性部位になつ
ていることが多く、ここに基質、補酵素が結合す
るとエネルギー的に安定し、酵素の安定化をもた
らすといわれる。

その２はSH保護試薬の添加である。活性部位
にSH基を有するときは、SH保護試薬たとえばメ
ルカプトエタノール、ジチオスレイトールなどは
有効である。

この他非特異的な安定化剤もしばしば用いられ
る。たとえばアルブミンのような不活性なタンパ
ク質、グリセロール、乳糖が有効な場合もある。

グリセロール−３−リン酸オキシダーゼについ
ても従来知られていた前記の安定化方法を適用し
検討したが、いずれも安定化効果を認め得なかつ
た。しかるに、酸性アミノ酸（アミノジカルボン
酸）を添加したとき、グリセロール−３−リン酸
オキシダーゼの安定性が著しく改善されることを
見出だした。これは従来の安定化方法からすれば
全く驚くべきことである。

即ち、本発明は、酸性アミノ酸からなるグリセ
ロール−３−リン酸オキシダーゼの安定化剤であ
る。

さらに好都合なことは該酸性アミノ酸は添加す
る測定系に何らの妨害作用を示さないことであ
る。従つて任意の量で添加することができる。

本発明に係る安定化剤はグリセロール−３−リ
ン酸オキシダーゼを安定化するものであるので、
例えばグリセロール−３−リン酸オキシダーゼを
用いる有用な測定系の全てに用い得る。

例えば、本発明に係る安定剤を用いて安定なグ
リセロール−３−リン酸測定用試薬を得る１例に
ついて述べると、グリセロール−３−リン酸オキ
シダーゼ、ペルオキシダーゼならびに指示薬から
なる自体公知のグリセロール−３−リン酸の定量
用試液に、グリセロール−３−リン酸オキシダー
ゼの安定化剤として酸性アミノ酸を好ましくはア
ルカリ金属塩として添加すれば安定なグリセロー
ル−３−リン酸定量用組成物を得ることができ
る。

本発明に係る安定化剤は、又、グリセロール−
３−リン酸オキシダーゼを使用する臨床診断用試
薬に用いることができる。

血清などの生体試料中のトリグリセライドの含
量を測定するには、リポプロテインリパーゼ、グ
リセロールキナーゼ、ATP、グリセロール−３
−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび
指示薬を適当な緩衝液たとえばトリス緩衝液に溶
解して調製した測定試液を用いる。

該反応では、グリセロール−３−リン酸オキシ
ダーゼの作用によつてグリセロール−３−リン酸
より過酸化水素（H₂O₂）を生じる。

被酸化呈色指示薬を共存させればペルオキシダ
ーゼの存在下で過酸化水素によつて該指示薬は呈
色を示す。

被酸化呈色指示薬としては、Ｏ−あるいはＰ−
フエニレンジアミン、ジアニシジンのような単独
指示薬、４−アミノアンチピリンとフエノール、
ハロフエノール、あるいはアニリン誘導体を組合
せた組合せ指示薬などが使用できる。

緩衝液の種類としては、目的のPHを維持できる
ものであればいずれでもよく、トリス緩衝液、リ
ン酸塩緩衝液あるいはグツド緩衝液などが用いら
れ、特に限定されるものではない。

反応に適したPHは中性付近であるが、最も好ま
しいPHは7.5である。

反応式から明らかなように、トリグリセライ
ド、グリセロール、ATP、グリセロール−３−
リン酸いずれの物質をも測定することが可能であ
る。しかしながらこの反応式の最も重要な反応段
階はグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ反応
である。

グリセロール−３−リン酸オキシダーゼは前述
のように、アエロコツカス属菌たとえばアエロコ
ツカス・ピリダンス、あるいはストレプトコカス
属菌たとえばストレプトコカス・フエカリスなど
の培養、抽出によつて得られるが、いずれも水性
媒体中にあるとき特に安定性が良くなく、通常の
方法では調製後数時間しか使用に耐えない。

しかるに本発明に係る酸性アミノ酸（アミノジ
カルボン酸）を添加すれば、例えば５℃で保管す
れば１週間は使用できる。（図面参照。） 酸性アミノ酸の代表的なものはグルタミン酸、
アスパラギン酸であるが、これらグルタミン酸又
はアスパラギン酸の使用が最も好ましい。α−ア
ミノアジピン酸その他の酸性アミノ酸を用いるこ
とができる。

酸性アミノ酸の添加濃度は１〜５％の範囲で使
用される。多すぎると呈色安定性を阻害する。約
３％が最も好ましい濃度である。

酸性アミノ酸は遊離型で用いることができる。
ナトリウム塩などのアルカリ金属塩として用いる
場合は溶解が容易であり、通常ナトリウム塩を用
いる。

次に実施例を示す。

実施例 １ グリセロール−３−リン酸の定量 試 薬 0.05Mトリス緩衝液（PH7.5）に下記成分を混
合溶解してグリセロール−３−リン酸測定用試液
を調製する。

グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
5u／ml ペルオキシダーゼ 2.5u／ml Ｐ−クロルフエノール 0.07％ ４−アミノアンチピリン 0.15mg／ml グルタミン酸ナトリウム 3.0％ 測定操作 試料0.02mlをグリセロール−３−リン酸測定用
試液3.0mlに加え、よく混合ののち37℃で10分間
加温呈色させる。別に蒸留水0.02mlを用い、同様
に操作して加温呈色させた試薬盲検を対照にして
505nmにおける吸光度を測定する。

グリセロール−３−リン酸の一定量を溶解して
調製した標準液を試料と同様に操作して得られる
吸光度から、比例計算により試料のグリセロール
−３−リン酸の含量を求める。

実施例 ２ 生体試料中のトリグリセライドの定量 試 薬 0.05Mトリス緩衝液（PH7.5）に下記成分を混
合溶解してトリグリセライド測定用試液を調製す
る。

リポプロテインリパーゼ 40u／ml グリセロールキナーゼ 2.5u／ml グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
5u／ml ペルオキシダーゼ 2.5u／ml 酢酸マグネシウム 5mM Ｐ−クロルフエノール 0.07％ ４−アミノアンチピリン 0.15mg／ml ATP １mg／ml グルタミン酸ナトリウム ３％ 測定操作 生体試料（例えば血清）0.02mlをトリグリセラ
イド測定用試液3.0mlに加え、よく混合ののち、
37℃、10分間加温呈色させる。別に蒸留水0.02ml
を用いて同様に操作して加温呈色させた試薬盲検
を対照にして505mmにおける吸光度を測定する。

グリセロールの一定量を溶解させて調製した標
準液を試料と同様に操作して得られる吸光度か
ら、比例計算により一旦試料のグリセロール含量
を求めたのち、トリグリセライドに換算し、トリ
グリセライド含量を算出する。

【図面の簡単な説明】

図面１は、グリセロール−３−リン酸オキシダ
ーゼ（GPO）活性の残存率を表わす。５℃保存。
条件；0.05トリス緩衝液PH7.5，0.07％ｐ−クロル
フエノールを含む。図面２は、アスパラギン酸ナ
トリウム（３％）添加の場合のグリセロール−３
−リン酸オキシダーゼ（GPO）活性の活性残存
率を表わす。５℃保存。条件；0.05Mトリス緩衝
液PH7.5，0.07％ｐ−クロルフエノールを含む。
なお、比較のため、グルタミン酸ナトリウム（３
％）添加の場合及び無添加の場合のGPO活性の
活性残存率が併せて示されている。図面３は、各
濃度（５％、３％、１％、無添加。）のグルタミ
ン酸ナトリウムを溶解した0.05Mトリス緩衝液PH
7.5にグリセロール−３−リン酸オキシダーゼを
溶かしたときの活性残存率を表わす。保存温度20
℃。図面４は、各濃度（３％、１％、無添加。）
のアスパラギン酸ナトリウムを溶解した0.05Mト
リス緩衝液PH7.5にグリセロール−３−リン酸オ
キシダーゼを溶かしたときの活性残存率を表わ
す。保存温度20℃。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酸性アミノ酸からなるグリセロール−３−リ
   ン酸オキシダーゼの安定化剤。 ２ 酸性アミノ酸が一般式 （式中、ｎは１乃至５の整数を表わす。）で示
   されるアミノジカルボン酸である特許請求の範囲
   第１項に記載の安定化剤。 ３ アミノジカルボン酸がグルタミン酸である特
   許請求の範囲第２項に記載の安定化剤。 ４ アミノジカルボン酸がアスパラギン酸である
   特許請求の範囲第２項に記載の安定化剤。 ５ 水性媒体中に存在するグリセロール−３−リ
   ン酸オキシダーゼを安定化する特許請求の範囲第
   １項から第４項のいずれかに記載の安定化剤。 ６ 水性媒体が緩衝液である特許請求の範囲第５
   項に記載の安定化剤。 ７ ペルオキシダーゼと共存するグリセロール−
   ３−リン酸オキシダーゼを安定化する特許請求の
   範囲第５項又は第６項に記載の安定化剤。 ８ ペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼの存
   在下に過酸化水素によつて酸化されて呈色する被
   酸化呈色指示薬と共存するグリセロール−３−リ
   ン酸オキシダーゼを安定化する特許請求の範囲第
   ５項又は第６項に記載の安定化剤。 ９ グリセロールキナーゼ及びアデノシン−３−
   リン酸と共存するグリセロール−３−リン酸オキ
   シダーゼを安定化する特許請求の範囲第８項に記
   載の安定化剤。 １０ グリセロールキナーゼ及びアデノシン−３
   −リン酸及びリパーゼと共存するグリセロール−
   ３−リン酸オキシダーゼを安定化する特許請求の
   範囲第８項に記載の安定化剤。 １１ リパーゼがリポプロテインリパーゼである
   特許請求の範囲第１０項に記載の安定化剤。