JPH0153040B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は微量の酸化性物質を定量するために用
いられる被酸化性呈色試薬の安定化方法に関す
る。更に詳記すれば、生体成分の定量において、
測定する目的成分に特異的に作用して、目的成分
に対応する量の酸化性物質である過酸化水素を生
成せしめ、その過酸化水素を酵素（ペルオキシダ
ーゼ）の存在下で被酸化性呈色試薬と反応させ
て、その酸化呈色を比色測定することにより目的
成分の含有量を求める生体成分の定量方法におい
て使用される被酸化性呈色試薬の安定化方法に関
する。 生体成分の定量において、目的とする生体成分
に特異的に作用する酵素を用いて過酸化水素を生
成させたり、あるいは酵素作用により他の化合物
に変換させた後、更に別の酵素を用いて過酸化水
素を生成させ、その過酸化水素を酵素（ペルオキ
シダーゼ）の存在下で被酸化性呈色試薬と反応さ
せて、その酸化呈色を比色測定することにより目
的成分の含有量を求める生体成分の定量方法は、
いわゆる「酵素法」として、その特異性、巡速
性、試薬の安全性等の点から、生体成分のコレス
テロール、トリグリセライド、リン脂質、ブドー
糖、尿酸、遊離脂肪酸コリンエステラーゼ、トラ
ンスアミナーゼ等の定量方法として広く実施され
ている。 「酵素法」において使用される各種酵素の反応
至適PHの範囲が一般にPH６〜８であるため「酵素
法」で用いられる被酸化性呈色試薬はこのPH範囲
で酸化呈色するものが用いられなければならな
い。一方生体成分の定量において測定時の検体量
の微量化や、又尿酸のように存在量の少い成分を
精度よく測定する必要から高感度の被酸化性呈色
試薬を用いなければならない。 従来用いられる被酸化性呈色試薬の色原体とし
てはフエノール類化合物又はアニリン類化合物が
使用されているがフエノール類化合物はPH5.5以
上で比較的安定であるが感度が低い、毒性が強い
等の問題がある。アニリン類化合物は感度は高い
が溶存酸素や空気中の酸素により酸化され易く、
さらにPH6.5以上では不安定でありその結果とし
て試薬盲検値が上昇するため測定感度、測定精度
に問題がある。 本発明者らはこれらの問題点に鑑み、被酸化性
呈色試薬としてアニリン類化合物が溶存酸素や空
気中の酸素で酸化されることなくPH6.5以上でも
安定であり試薬盲検値の変動がなく、且つ「酵素
法」による生体成分の定量方法における各種酵素
に対しても支障なく使用できる被酸化性呈色試薬
としてのアニリン類化合物の安定化方法を開発す
べく、鋭意研究の途上、硫黄化合物が酸化され易
い性質を有することに着目し、研究を重ねた結
果、水溶性のチオエーテル類化合物及び／又は水
溶性のジチオエーテル類化合物が優れた効果を有
していることを見出し、本発明を完成するに到つ
た。 すなわち、本発明は、測定する目的成分に特異
的に作用する酵素を用いて過酸化水素を生成さ
せ、あるいは酵素作用により生成した化合物に更
に別の酵素を作用させて過酸化水素を生成させ、
その過酸化水素をペルオキシーダの存在下で被酸
化性呈色試薬と反応させて、その酸化呈色を比色
定量することにより、目的とする生体成分を定量
する方法に於て用いられるアニリン類被酸化性呈
色試薬の安定化方法であつて、該アニリン類被酸
化性呈色試薬を含む水溶液に水溶性のチオエーテ
ル類化合物又は／及び水溶性のジチオエーテル類
化合物を添加することを特徴とするアニリン類被
酸化性呈色試薬の安定化方法である。 本発明で使用される水溶性のチオエーテル類化
合物としては、例えばβ−チオジグリコール、チ
オジグリコール酸、メチオニン、ジエンコル酸、
シスタチオニン、ランチオニン等が挙げられる。
水溶性のジチオエーテル類化合物としては例えば
シスチン、ジチオジグリコール酸、6.6′−ジチオ
ジニコチン酸、3.3′−ジチオジプロピオン酸、
2.2′−ジチオジピリジン、4.4′−ジチオジピリジ
ン、酸化型グルタチオン、ジチオグリセロール等
が挙げられる。 本発明におけるアニリン類被酸化性呈色試薬と
しての色原体としては例えばＮ，Ｎ−ジメチルア
ニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン等のＮ，Ｎ−
ジアルキルアニリン・３−メチル−Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアニリン、３−メチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルア
ニリン等の３−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジアルキルア
ニリン・３−アルコキシ−Ｎ，Ｎ−ジアルキルア
ニリン・Ｎ−メチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチ
ル）アニリンＮ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシ
エチル）アニリン等のＮ−アルキル−Ｎ−ヒドロ
キシアルキルアニリン・３−メチル−Ｎ−メチル
−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリン、３−
メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチ
ル）アニリン等の３−アルキル−Ｎ−アルキル−
Ｎ−ヒドロキシアルキルアニリン・３−アルコキ
シ−Ｎ−アルキル−Ｎ−ヒドロキシアルキルアニ
リン・Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシアルキル）アニ
リン・３−アルキル−Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシ
アルキル）アニリン・３−メチル−Ｎ−メチル−
Ｎ−（β−メタンスルホンアミドエチル）アニリ
ン、３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−メタン
スルホンアミドエチル）アニリン等の３−アルキ
ル−Ｎ−アルキル−Ｎ−アルカンスルホンアミド
アルキルアニリン等のＮ−置換アニリン化合物及
びその核置換化合物などのＮ−置換アニリン化合
物が使用されるが好ましくはこれらの化合物は４
−アミノアンチピリン又は３−メチル−２−ベン
ゾチアゾリノンヒドラゾンとの組合せで使用され
る。 本発明の水溶性のチオエーテル類化合物、水溶
性のジチオエーテル類化合物の添加量について述
べると、チオエーテル類化合物、ジチオエーテル
類化合物の各々の化合物によつて効果の程度に違
いがあるので、各々の化合物によつて添加量が違
つてくるのは当然であるが、色原体としてのアニ
リン類化合物は通常0.01〜１％（ｗ／ｗ）の水溶
液として使用され、チオエーテル類化合物、ジチ
オエーテル類化合物はこの溶液に対して0.0001〜
10％（ｗ／ｗ）の濃度で使用される。 さらに本発明の被酸化性呈色試薬の安定化方法
は、被酸化性呈色試薬としての色原体のほかに界
面活性剤、緩衝液、酵素その他の通常の「酵素
法」で使用される薬剤等が存在していても本発明
は支障なく実施できる。 本発明の方法で、得られる安定化された被酸化
性呈色試薬は溶存酸素や空気中の酸素で酸化され
ることなく、PH６以上でも安定であるため色原体
の使用量がすくなくて済みさらに優れた測定感
度、測定精度を与えるものであつて、本発明によ
ると生体成分の定量、つまり生体成分を定量する
ことにより病変の予後の診断に役立たせる技術分
野である臨床検査技術の測定感度、測定精度の向
上を図ることができ、本発明は斯界に貢献すると
ころ極めて大なる発明である。以下に実施例を述
べ本発明を具体的に説明する。 実施例 １ （血清総コレステロールの測定） 発色試液 ３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチ
ルルアニリン0.15ｇ、トリトン×100 0.15ｇ、β
−チオジグリコール３ｇ（0.0246mol）、コレス
テロールオキシダーゼ14単位、コレステロールエ
ステルヒドロラーゼ14単位、ペルオキシダーゼ75
単位、４−アミノアンチピリン15mgを秤取し、
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解して全量を
100mlとしこれを発色試液(1)とする。３−メチル
−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアニリン
0.1ｇ、トリトン×100 0.15ｇ、コレステロール
オキダーゼ14単位、コレステロールエステルヒド
ロラーゼ14単位、ペルオキシダーゼ75単位、４−
アミノアンチピリン15mgを秤取し0.1Mリン酸緩
衝液（PH6.0）に溶解して全量を100mlとしこれを
発色試液(2)とする。 測定方法 血清10μに発色試液(1)あるいは発色試液(2)を
3.0ml加え37℃恒温槽中で５分間反応させた後、
蒸留水を対照として545nｍの吸光度を測定する。
試薬盲検として血清の代りに蒸留水を用いて同様
に操作して545nｍの吸光度を測定する。血清中
の総コレステロール量は、検体吸光度から試薬盲
検の吸光度を差引いた値を、コレステロール標準
液を用いて同様に操作して作成した検量線と対比
させて求めることができる。 測定結果 発色試液(1)と(2)を室温（25〜28℃）に保存した
場合の試薬盲検値の測定結果を表−１に示す。

【表】 表中の数値は前記の測定方法により求めた試薬
盲検の吸光度（セル層厚１cm）を示す。発色試液
はいずれも褐色ガラス瓶に保存した。この結果か
ら明かなように本発明に係る方法で安定化された
発色試液(1)は試薬盲検値の上昇は僅かであり、実
用上問題にならないが、安定化していない発色試
液(2)は、１日後で調製直後の約3.4倍、２日で約
5.3倍の盲検値を示すため、測定の都度、試薬盲
検を併行して行う必要がある。 表−２に人血清を試料とした測定値を示す。

【表】 表−２から明らかなように発色試液(1)と(2)によ
る測定値に有意差は認められない。 図−１に発色試液(1)および(2)を用いた場合の呈
色反応のタイムコースを示す。図−１から明かな
ように発色試液(1)は、コレステロールエステラー
ゼ、コレステロールオキシダーゼの作用至適PHで
あるPH7.0であるため、呈色反応は約３分で完了
するが、発色試液(2)ではPH6.0のため、酵素作用
が阻害を受け呈色反応に５分を要する。 実施例 ２ （血清総コレステロール測定用） 発色試液 ３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチ
ルアニリン0.15ｇ、トルトンx100 0.07ｇ、β−
チオジグリコール５ｇ（0.0409mol）、コレステ
ロールオキシダーゼ７単位、コレステロールエス
テラーゼ７単位、ペルオキシダーゼ40単位、４−
アミノアンチピリン８mgを秤取し、0.05Mリン酸
緩衝液（PH7.0）に溶解して全量を100mlとする。 前処理液 ヨウ素酸カリウム0.2ｇを蒸留水90mlに溶解後、
1N−塩酸でPH4.0に調整し更に蒸留水を加えて全
量100mlとする。 測定方法 オリンパス(株)製ACA6000型自動分析装置 測定結果 実施例２の発色試液の組成において３−メチル
−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアニリンの
代りにｐ−クロルフエノールを用いβ−チオジグ
リコールを含まない組成の発色試液を用いて同一
方法で測定を行つた（従来法）場合の測定値の比
較表を表−３に示し、図−２に両法の相関図を示
す。但しｐ−クロルフエノールの場合は測定波長
を520nｍ及び600nｍの二波長測光によつた。

【表】

【表】

【表】

【表】 実施例 ３ （血清トリグリセライド測定） 発色試液 ３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチ
ルアニリン0.1ｇ、トリトンＸ−100 0.05ｇ、β
−チオジグリコール３ｇ（0.0246mol）、塩化マ
グネシウム0.5ｍmol、リポプロテインリパーゼ
4000単位、グリセロキナーゼ220単位、グリセロ
−３−リン酸オキシダーゼ200単位、ペルオキシ
ダーゼ200単位、４−アミノアンチピリン10mg、
牛血清アルブミン100mg、アデノシン−5′−三リ
ン酸二ナトリウム塩120mgを0.05Mトリス緩衝液
（PH7.0）に溶解して全量を100mlとしこれを発色
試液(1)とする。β−チオジグリコールを除いた発
色試液(1)の組成の試液を調製し、これを発色試液
(2)とする。 測定方法 血清20μに発色試液(1)あるいは発色試液(2)を
3.0ml加え37℃恒温槽中で15分間反応させた後蒸
留水を対照として545nｍの吸光度を測定する。
試薬盲検として血清の代りに蒸留水を用いて同様
に操作して545nｍの吸光度を測定する。血清中
のトリグリセライド量は検体吸光度から試薬盲検
の吸光度を差引いた値を、トリグリセライド標準
液を用いて同様に操作して作成した検量線と対比
させて求めることができる。 測定結果 発色試液(1)と(2)を室温（25〜28℃）に保存した
場合の試薬盲検値の測定結果を表−４に示す。

【表】 表中の数値は前記の測定方法により求めた試薬
盲検の吸光度（セル層厚１cm）を示す。発色試液
はいずれも褐色ガラス瓶に保存した。従来の方法
で調製した試薬は、盲検値の経時的変化が大きい
ため調製後数時間以内しか使用できないが、本発
明に係る方法で調製した試薬は３日間以上使用で
きる。 表−５に人血清を試料とした測定値を示す。

【表】 単位はmg／dlである
第２表から明らかなように発色試液(1)と(2)によ
る測定値に有意差は認められない。 実施例 ４ （血清トリグリセライド測定） 発色試液 実施例３の発色試液(1)のβ−チオジグリコール
の代りにチオジグリコール酸５ｇ（0.0333mol）
と水酸化ナトリウム1.5ｇを用いる。これを発色
試液(1)とする。発色試液(2)は実施例３に同じ。 測定方法 実施例３に同じ。 測定結果 発色試液(1)と(2)を室温（25〜28℃）に保存した
場合の試薬盲検値の測定結果を表−６に示す。

【表】 実施例 ５ （血清尿酸測定） 発色試液 ３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチ
ルアニリン0.05ｇ、Ｌ−シスチン0.01ｇ
（0.00004mol）、ウリカーゼ400国際単位、ペルオ
キシダーゼ600単位、４−アミノジフエニルアミ
ン塩酸塩７mg（0.032mol）を0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.0）に溶解して全量を100mlとしこれを発色
試液(1)とする。発色試液(1)におけるＬ−シスチン
の代りにβ−チオジグリコール５mlを用いて同様
に調製した溶液を発色試液(2)とする。発色試液(1)
におけるＬ−シスチンを加えずに同様に調製した
溶液を発色試液(3)とする。 測定方法 血清50μに発色試液3.0mlを加え37℃恒温槽中
で10分間反応させた後蒸留水を対照として720n
ｍの吸光度を測定する。試薬盲検として血清の代
りに蒸留水を用いて同様に操作して720nｍの吸
光度を測定する。血清中の尿酸量は検体吸光度か
ら試薬盲検値の吸光度を差引いた値を尿酸標準液
を用いて同様に操作して作成した検量線と対比さ
せて求めることができる。 測定結果 発色試液(1)、(2)及び(3)を夫々室温（25〜28℃）
に保存した場合の試薬盲検値の測定結果を表−７
に示す。

【表】 表中の数値は前記の測定方法により求めた試薬
盲検の吸光度（セル層厚１cm）を示す。発色試薬
はいずれも褐色ガラス瓶に保存した。 表−８に人血清を試料とした測定値を示す。

【表】 単位はmg／dlである

【図面の簡単な説明】

図−１は実施例１に記載した発色試液(1)、発色
試液(2)の呈色反応のタイムコースを示す。図−２
は実施例２に記載した発色試液が３−メチル−Ｎ
−エチル−Ｎ−ヒドロキシアニリンを用いてβ−
チオジグリコールを含むものと、ｐ−クロルフエ
ノールを用いてβ−チオジグリコールを含まない
ものとの両法の測定結果の相関図を示す。 ｘ：本発明の方法、ｙ：ｐ−クロルフエノール
を用いた方法。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 測定する目的成分に特異的に作用する酵素を
   用いて過酸化水素を生成させ、あるいは酵素作用
   により生成した化合物に更に別の酵素を作用させ
   て過酸化水素を生成させ、その過酸化水素をペル
   オキシーダの存在下で被酸化性呈色試薬と反応さ
   せて、その酸化呈色を比色定量することにより、
   目的とする生体成分を定量する方法に於て用いら
   れるアニリン類被酸化性呈色試薬の安定化方法で
   あつて、該アニリン類被酸化性呈色試薬を含む水
   溶液に水溶性のチオエーテル類化合物又は／及び
   水溶性のジチオエーテル類化合物を添加すること
   を特徴とするアニリン類被酸化性呈色試薬の安定
   化方法。