JPH042240B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は体液中の基質または酵素活性の定量方
法に関するものである。更に詳しくは体液中に存
在する誤差を与える物質の影響を排除せしめ、正
確な測定値を得る方法に関するものである。 最近、臨床検査の分野において、体液中の成分
を測定する方法として、基質または酵素反応によ
つて形成する物質の酸化酵素を作用させ、生じる
過酸化水素を測定する方法が広く用いられるよう
になつた。 過酸化水素の測定方法としては、ペルオキシダ
ーゼ共存下で４−アミノアンチピリンと、フエノ
ール誘導体、１−ナフトール誘導体あるいはアニ
リン誘導体を加え、酸化縮合させて色素体とし、
その呈色の強さを比色測定する方法が主として用
いられている。 最近になつて、例えば、トリグリセライドの測
定において、体液中に存在する遊離グリセリン、
あるいはグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナ
ーゼ（GPT）、グルタミン酸オギザロ酢酸トラン
スアミナーゼ（GOT）等の酵素活性値の測定に
おいては、ピルビン酸が測定値に誤差を起こして
いることが問題となつている。 本発明は、測定せんとする物質以外の、誤差と
なる物質を消去し、該目的物質を正確に定量する
方法を提供するものである。 即ち、本発明は、基質、又は酵素反応により生
成した物質に酸化酵素を作用させ、生成する過酸
化水素を測定することにより、試料中の基質又は
酵素活性を定量する方法において、一般式（） 〔式中R₁、R₂は同一又は異つてよく、水素、ヒ
ドロキシル基、カルボキシル基及びスルホン酸基
を示す。〕で表わされる２−ナフトール誘導体、
酸化酵素及びペルオキシダーゼを含む試液を第１
試液とし、４−アミノアンチピリンと、フエノー
ル誘導体、１−ナフトール誘導体あるいはアニリ
ン誘導体を含む試液を第２試液とし、試料に第１
試液を加えた後、第２試液を加えることを特徴と
する基質又は酵素活性の定量方法である。 第１試液に含まれる酸化酵素によつて作用をう
ける基質があれば該基質は酸化分解をうけ過酸化
水素を生成する。過酸化水素はペルオキシダーゼ
の作用によつて一般式（）の化合物を酸化する
が、該化合物（）は可視部に吸収されない化学
物質に変換される。 体液中に含まれ、定量に誤差を与える物質、例
えばトリグリセライドの定量における既存のグリ
セリン、の消去方法として、酸化酵素を用いて、
誤差を生じる物質を過酸化水素に導き、この過酸
化水素とペルオキシダーゼの働きにより可視域に
吸収を示さない酸化体へ移行する化合物を用いる
過酸化水素消去法については、特開昭57−83287
及び特開昭57−163497に記載がみられる。上記公
開特許公報の記載の内容は、フエノール誘導体、
ナフトール誘導体あるいはアニリン誘導体と４−
アミノアンチピン等のカツプラーを組み合わせて
用いる発色系において、そのフエノール誘導体、
ナフトール誘導体あるいはアニリン誘導体を第１
反応でカツプラーと分離して用い、可視部に吸収
を有しない化合物に導くことで過酸化水素を消去
せんとするものである。このような方法は発色系
の１成分を消去物質に用いるということで簡便な
反面、消去反応において発色剤が消費されるため
の発色反応における呈色条件を均一とし難いこ
と、またその対策として多量に当物質を用いれば
試薬盲検の上昇を示す等の欠点があり、精度の高
い測定値が望み得ない。 本発明者らは、発色系には全く関与せず、誤差
を生じる物質に由来する過酸化水素の消去のみを
行う物質を鋭意探索し、本発明を完成した。 即ち、本発明は、一般式（）で示される化合
物を第１試液に含有させる場合は、発色系には全
く関与せず、誤差を生ずる物質に由来する過酸化
水素の消去のみに有効であるとの本発明者らの独
自の知見に基づき完成されたものである。 即ち、本発明では、基質、又は酵素反応により
生成した物質に酸化酵素を作用させ、生成する過
酸化水素を測定して、その基質又は酸素活性を定
量する方法において、第１試液に一般式（）で
表わされる２−ナフトール誘導体、酸化酵素及び
ペルオキシダーセを含有させるのが重要な特徴で
ある。即ち、一般式（）で表わされる２−ナフ
トール誘導体は、誤差を生じさせる物質である基
質及びその酸化酵素により生成する過酸化水素と
ペルオキシダーゼの作用により可視部に吸収を有
しない化合物に変換される。 次いで、４−アミノアンチピリンと、フエノー
ル誘導体、１−ナフトール誘導体あるいはアニリ
ン誘導体を含む試薬であつて、且つ基質を測定す
る場合は、この基質から、誤差を生じさせる物質
と同じ物質を生成させるのに必要な酵素を含み、
酵素活性を測定する場合には、この測定しようと
する酵素の基質となる物質を含む第２の試液を加
える。 一般式（）で表わされる２−ナフトール誘導
体はペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素を消
去するが、４−アミノアンチピリンとフエノール
誘導体、１−ナフトール誘導体あるいはアニリン
誘導体からなる発色系には全く影響しない。 即ち、本発明によると、測定を目的とする物質
を比色定量する糸は常に均一条件を維持できる
上、そのような任意の組み合せ発色剤を選択する
ことができる。 本発明の化合物（）の前記の如き性質は、該
化合物（）がペルオキシダーゼの共存下で過酸
化水素により酸化されうる酸化還元電位を有する
が、その酸化還元電位は、一般的に４−アミノア
ンチピリンのカプラーとして使用されるフエノー
ル誘導体、１−ナフトール誘導体あるいはアニリ
ン誘導体の酸化還元電位よりも高い為、フエノー
ル誘導体、１−ナフトール誘導体あるいはアニリ
ン誘導体が優先して４−アミノアンチピリンと酸
化縮合を行う結果であると考えられる。 本発明は、そのような好都合な酸化還元電位を
有する特定の化合物として一般式（）で示され
る２−ナフトール誘導体が存在することを開示す
るものでもあり、この点に於ても、斯界に貢献す
る所、大である。 本発明で用いられる化合物（）としては、２
−ナフトール、７−ヒドロキシ−２−ナフトー
ル、２−ナフトール−７−スルホン酸、２−ナフ
トール−３、６−ジスルホン酸、２−ナフトール
−３−カルボン酸などがある。 本発明の化合物（）は４−アミノアンチピリ
ンとフエノール誘導体、１−ナフトール誘導体あ
るいはアニリン誘導体とからなる発色系と組み合
せて用いられる。 フエノール誘導体としてはフエノール、Ｐ−ク
ロロフエノール、２，４−ジクロロフエノール、
Ｐ−ブロモフエノール、ｏ−クロロフエノール、
ｍ−クロロフエノールなどが使用できる。 アニリン誘導体としては、アニリン、Ｎ，Ｎ−
ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、
Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、３−メチル
−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ア
ニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、3.5−ジメ
チル−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）アニリン、3.5−ジメトキシ−
Ｎ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロ
ピル）アニリンなどが使用できる。 １−ナフトール誘導体としては１−ナフトー
ル、１−ナフトール−２−スルホン酸、１−ナフ
トール−２−カルボン酸、１−ナフトール−８−
スルホン酸、１−ナフトール−３−スルホン酸、
１−ナフトール−５−スルホン酸などが使用でき
る。 本発明に用いられる試薬は、一般式（）で表
わされる２−ナフトール誘導体、酸化酵素及びペ
ルオキシダーゼを含む試液からなる第１試液と４
−アミノアンチピリンとフエノール誘導体、ナフ
トール誘導体あるいはアニリン誘導体を含む試液
からなる第２試液よりなる。第１試液ならびに第
２試液には前記成分の他、緩衝剤、界面活性剤、
安定化剤等を目的に応じて添加する。緩衝剤は通
常のものが使用でき、PHは、通常５〜９の範囲で
用いられる。 本発明の化合物（）は第１試液において、通
常、0.01〜10ｍＭの範囲で使用されるが、0.1〜
0.5ｍＭで用いるのが好ましい。 本発明の化合物（）と過酸化水素の反応によ
つて過酸化水素が分解される時間を次の方法で測
定した。 PH７のグツド緩衝液３mlにペルオキシダーゼ10
単位、及び本発明の化合物（）を加え、これに
過酸化水素を反応試液中0.1ｍＭとなるように添
加し、37℃で一定時間反応させる。過酸化水素が
消去されるに要する時間を、一定時間経過後に４
−アミノアンチピリン0.3mgとフエノール３mgを
加えて、過酸化水素による呈色の有無を調べるこ
とにより求めたが（表１）、極めて消去の迅速な
ことが確認された。

【表】 また、４−アミアンチピリンとフエノール誘導
体、１−ナフトール誘導体あるいはアニリン誘導
体との酸化縮合の際に本発明の化合物（）の共
存が、呈色に殆んど影響を与えないことを確認
し、データを表２に示した。 即ち、過酸化水素の10ｍＭ溶液20μを表２に
示した各呈色試薬の組合せ及びペルオキシダーゼ
を含有する50ｍＭトリス一塩酸緩衝液（PH6.5）
３mlに加えた際、該化合物（）の0.5ｍＭの存
在の有無による呈色度の変化を各酸化縮合体の有
する極大吸収波長付近に於いて調べたが、添加の
有無による吸光度の差は認められなかつた。

【表】 測定試液中４−アミノアンチピリンは0.4ｍＭ、
フエノールおよび１−ナフトール−２−スルホン
酸は５ｍＭ、MEHA、DAOSは１ｍＭを使用し
た。 (1) ３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロ
キシエチル）−アニリンの略。 (2) 3.5−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）アニリンの
略。 次いで、本発明について、更に具体的に説明す
る。 基質として、例えば、トリグリセライドを測定
するには、第１試液として、グリセロキナーゼ、
アデノシン−5′−リン酸、グリセロール−３−リ
ン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、マグネシ
ウム塩、本発明の化合物（）例えば２−ナフト
ール−７−スルホン酸、及び緩衝剤を含む試液を
調製し、第２試液として、リポプロテインリパー
ゼ、４−アミノアンチピリン、アニリン誘導体と
して、例えば、3.5−ジメトキシ−Ｎ−エチル−
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ア
ニリン、及び緩衝剤を含む試液を調製する。 試料として、例えば、血清を第１試液に加え、
37℃で５分間反応させ、血清中に存在する遊離グ
リセロールから生成した過酸化水素をペルオキシ
ダーゼの存在下、２−ナフトール−７−スルホン
酸と反応させた後、第２試液を加えて37℃で10分
間反応させ、トリグリセライドから遊離したグリ
セロールのみから生成した過酸化水素を600nｍ
で比色定量する。 人血清に、グリセリンを添加した試料血清を用
い、実施例１に従つて測定したトリグリセライド
測定法は、表３の如くである。

【表】 本発明の方法は、前記の具体例に限定されるも
のではなく、他の基質あるいは酵素活性の測定に
広く利用されるものである。 次に、本発明を実施例により説明する。 実施例 １ （トリグリセライドの定量） １ 試液 第１試液 0.05M トリス緩衝液（PH6.5） グリセロキナーゼ 15単位／ml グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ 15単
位／ml ペルオキシダーゼ 10単位／ml ２−ナフトール−７−スルホン酸 0.5ｍＭ 酢酸マグネシウム ５ｍＭ アデノシン5′−シリン酸 ６ｍＭ 第２試液 0.05M トリス緩衝液（PH6.5） リポプロテインリパーゼ 100単位／ml ４−アミノアンチピリン 0.2ｍＭ 3.5−ジメトキシ−Ｎ−エチル−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホプロピル）アニリン １ｍＭ ２ 測定法 試料（血清）20μに第１試液１mlを加えよ
く混合後、37℃で５分間反応させる。次いで第
２試液２mlを加えよく混合後37℃で10分間反応
させる。蒸留水20μをとり、以下前記試料血
清と同様の操作を行つた試薬盲検を対照にして
波長600nｍで試料血清の吸光度を測定する。 別に含有既知の管理血清を用い、試料と同様
に操作して得られる吸光度から比例計算によつ
て試料血清中のトリグリセライド含量を求める
と、遊離グリセロールを誤差として含まない真
値のトリグリセライド含量が求められる。 実施例 ２ グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ
（GPT）の活性測定） １ 試薬 第１試液 0.02Mリン酸緩衝液 PH7.0 ピルビン酸オキシダーゼ ６単位／ml ペルオキシダーゼ 10単位／ml チアミンピロリン酸 0.06％ フラビンアデニン−ジヌクレオチド 0.002％ 酢酸マグネシウム ９ｍＭ ２−ナフトール−３−カルボン酸 0.5ｍＭ 第２試液 0.02Mリン酸緩衝液 PH7.0 α−ケトグルタル酸 35ｍＭ DL−アラニン 700ｍＭ ４−アミノアンチピリン 50mg／dl ３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキ
シエチル）アニリン 50mg／dl 反応停止液 0.05Mリン酸緩衝液 PH9.0 エチレンジアミン四酢酸２ナトリウム 0.05M クエン酸３ナトリムウ 0.1M ２ 測定法 試料（血清）20μに第１試液0.5mlを加え、
よく混合後37℃で５分間反応させる。次いで第
２試液0.2mlを加え、よく混合後正確に37℃で
20分間反応させ、反応停止液２mlを加える。蒸
留水20μを用い、前記の試料血清と同様の操
作を行つた試薬盲検を対照にして、波長560n
ｍで試料血清の吸光度を測定する。 別にGPT活性値既知の管理血清を用い、試
料血清と同様に操作して得られた吸光度から比
例計算により試料血清中のGPT活性値を求め
ると、試料血清中に存在するピルビン酸に由来
する誤差が除かれたGPT活性値の真値が得ら
れる。 実施例 ３ （グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナ
ーゼ（GOT）活性測定） １ 試薬 第１試液 0.02Mリン酸緩衝液 PH7.0 ピルビン酸オキシダーゼ ６単位／ml ペルオキシダーゼ 10単位／ml オキザロ酢酸脱炭酸酵素 10単位／ml チアミンピロリン酸 0.06％ フラビンアデニンジヌクレオチド 0.002％ 酢酸マグネシウム ９ｍＭ ２−ナフトール−３−カルボン酸 0.5ｍＭ 第２試液 0.02Mリン酸緩衝液 PH7.0 α−ケトグルタル酸 35ｍＭ Ｌ−アスパラギン酸 280ｍＭ ４−アミノアンチピリン 50mg／dl ３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキ
シエチル）アニリン 50mg／dl 反応停止液 0.05Mリン酸緩衝液 PH9.0 エチレンジアミン四酢酸２ナトリウム 0.05M クエン酸３ナトリムウ 0.1M ２ 測定法 試料（血清）20μに第１試液0.5mlを加え、
よく混合後37℃で５分間反応させる。次いで第
２試液0.2mlを加え、よく混合後正確に37℃で
20分間反応させ、反応停止液２mlを加える。蒸
留水20μを用い、前記の試料血清と同様の操
作を行つた試薬盲検を対照にして、波長560n
ｍで試料血清の吸光度を測定する。 別にGOT活性値既知の管理血清を用い、試
料血清と同様に操作して得られた吸光度から比
例計算により試料血清中のGOT活性値を求め
ると、試料血清中に存在するピルビン酸に由来
する誤差が除かれたGOT活性値の真値が得ら
れる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 基質、又は酵素反応により生成した物質に酸
   化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を測定す
   ることにより、試料中の基質又は酵素活性を定量
   する方法において、下記一般式(1) 〔式中R₁、R₂は同一又は異なつてよく、水素、
   ヒドロキシル基、カルボキシル基及びスルホン酸
   基を示す。〕で表わされる２−ナフトール誘導体、
   酸化酵素及びペルオキシダーゼを含む試液を第１
   試液とし、４−アミノアンチピリンと、フエノー
   ル誘導体、１−ナフトール誘導体あるいはアニリ
   ン誘導体を含む試液を第２試液とし、試料に第１
   試液を加えた後、第２試液を加えることを特徴と
   する基質又は酵素活性の定量方法。