JPS6322196A - 基質の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は体液中の基質の定量方法に関するものである。

近年、臨床検査において体液中の基質量または酵素活性
を定量する方法として、基質または該基質から酵素反応
により生成した物質に酸化酵素を作用させ、生成する過
酸化水素を測定する方法が盛んに用いられている。

これらの過酸化水素の測定方法として、ペルオキシダー
ゼの酵素作用により、（ｉ）４−アミノアンチピリン、
３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等のカ
ップラーと■フェノール誘導体、アニリン誘導体または
ナフトール誘導体等の色原体とを酸化縮合させて発色体
とし、その光学的吸光度を測定する方法が用いられてい
る。この方法は操作が簡単であるという特徴を有してい
る。

ところが、最近、この測定方法を用いたコレステロール
エステル、トリグリセライド、アミラーゼ、グルタミン
酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（（ｉｉ）Ｔ）　、
グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）
等の臨床診断において、体液中の遊離コレステロール、
遊離グリセロール、ブドウ糖、ピルビン酸等を誤差とし
て計り込むことが問題になっている。

本発明者等は体液中の遊離コレステロール、ブドウ糖、
遊離グリセロール、ピリビン酸等の計り込みを防止し、
正確に目的とするコレステロールエステル、トリグリセ
ライド等の基質またはアミラーゼ、グルタミン酸ピルビ
ン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）　、グルタミン酸オ
ギザロ酢酸トランスアミナーゼ（（ｉｉ）Ｔ）等の酵素
活性を定ｎすることを目的として、種々鋭意検討したと
ころ、本発明に到達した。すなわち本発明は基質から酵
素反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ、生成
する過酸化水素を測定することにより、試料中の基質を
定量する方法において、（ｉ）酸化酵素と（ｉｉ）ペル
オキシダーゼとＧｉＯＮ−スルホプロル基含有アニリン
誘導体またはナフトール誘導体を含む試料を第１試液と
し、ＩＪｖ）カップラーを含む試液を第２試液とし、試
料に第１試液を却えた後、第２試液を加えることを特徴
とする基質の定量方法である。

本発明では、上記第１試液を加えた後、第２試液を加え
ることにより、体液中の遊離コレステロール、遊離グリ
セロール、ブドウ糖、ピルビン酸等の計り込みを防止し
、簡便且つ正確に目的とする基質を測定することが可能
となった。体液中の遊離コレステロール、遊離グリセロ
ール、ブドウ糖、ピルビン酸等はＮ−スルホプロピル基
含有アニリン誘導体またはナフトール誘導体と反応（自
己縮合反応）して可視部に吸収を示さない化学物質に変
換され、目的とする基質を測定する反応系に関与しない
ものと考えられる。逆に第２試液を加えてから第１試液
を加えると、目的が達成されない。また４−アミノアン
チピリンを酸化酵素、ペルオキシダーゼとともに含む試
液を第１試液とし、アニリン誘導体またはナフトール誘
導体を含む試液を第２試液とし、第１試液を加えてから
第２試液を加えても目的は達成されない。例えばトリグ
リセライド測定において、グリセロキナーゼとグリセロ
リン酸オキシダーゼを用いて生成した過酸化水素をペル
オキシダーゼの存在下、４−アミノアンチピリンと反応
（自己縮合反応）させた後、リパーゼとアニリン誘導体
を加え発色体を生成して、真のトリグリセライドのみを
比色測定しようと試みた。しかし、この方法では第１反
応である４−ミノアンチピリンと遊離グリセロールとの
反応（自己縮合反応）で可視部に吸収を有する物質（測
定波長に影響を与える物質）が生成し、第２反応で生成
した発色体の比色測定に正誤差となり、問題が生じた。

また、真のトリグリセライドを測定する方法として、遊
離グリセロール値を計り込んだ総トリグリセライド値と
遊離グリセロール値を各々測定し、その差を求める方法
があるが、簡易性の点で問題があった。本発明は上記方
法より簡易性の点で優れる。

本発明方法は基質から酵素反応により生成した物質に酸
化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を測定すること
により、試料中の基質を測定する方法である。

定量する基質としては、体液中のコレステロールエステ
ル、トリグリセライド、クレアチニン、クレアチンなど
がある。

酵素反応により生成した物質としては、コレステロール
エステルにコレステロールエステラーゼを作用させて生
成したコレステロール、トリグリセライドにリパーゼを
作用させて生成したグリセロール、グリセロールにグリ
セロキナーゼを作用させて生成したグリセロール−３−
リン酸などがある。

上記基質から上記酵素反応により生成した物質に作用さ
せる酸化酵素としては、コレステロールオキシダーゼ、
グリセロールオキシダーゼ、グリセロリン酸オキシダー
などがある。

Ｎ−スルホプロピル基含有アニリン誘導体としては、Ｎ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル
）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル
−ｍ−）ルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−
３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキ
シアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ニシジ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−　（２−ヒドロキシ−３７スルホ
プロピル）−ｍ−アニンジン等がある。

ナフトール誘導体としては１−ナフトール、２−ナフト
ール、４−クロロ−１−ナフトール等がある。

本発明に用いるカップラーとしては、４−アミノアンチ
ピリン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン
等がある。

本発明に用いる試液は（ｉ）酸化酵素とＱＯベルオキン
ダーゼとＧｉｅ　Ｎ−スルホプロピル基含有アニリン誘
導体またはナフトール誘導体を含む試液を第１試液とし
、Ｇ→カップラーを含む試液を第２試液とする。第１試
液および第２試液には前記成分に加えて、緩衝剤、およ
び必要により界面活性剤、安定剤等を含む。緩衝剤とし
ては通常のものが使用され、第１試液および第２試液の
ｐＨを通常５〜１０に調製するものが好ましい。

Ｎ−スルホプロピル基含有アニリン誘導体又はナフトー
ル誘導体の含優量は第１試液においてＩＸ　１０−’〜
ｌＸｌ０−”Ｍである。カップラーの含有量は第２試液
についてｌＸｌ０−”〜１×１ｍ”Ｍである。

本発明に用いる試薬には、他の酵素、基質、各種安定剤
、妨害物質除去のための試薬、界面活性剤等を含んでい
てもよい。

次に基質測定について具体的に説明する。本発明はこれ
らの具体的に説明されるものに限定されない。

基質として例えばコレステロールエステルを測定するに
は、第１試液として、コレステロールオキシダーゼ、ペ
ルオキシダーゼとＮ−スルホプロピル基含有アニリン誘
導体又はナフトール誘導体と緩衝剤を含む試液を調製し
、第２試液としてコレステロールエステラーゼと４−ア
ミノアンチピリンと緩衝剤を含む試液を調製する。試料
に第１試液を作用させ、遊離コレステロールから生成し
た過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、Ｎ−スルホ
プロピル基含有アニリン誘導体又はナフトール誘導体と
反応（自己縮合）させた後、第２試液を作用させ、コレ
ステロールエステルから生成したコレステロールのみか
ら生成した過酸化水素にペルオキシダーゼの存在下、Ｎ
−スルホプロピル基台何アニリン誘導体又はナフトール
誘導体と４−アミノアンチピリンを作用させて発色体を
得、これを比色定量する。

基質として例えばトリグリセライドを測定するには、第
１試液としてグリセロールオキシダーゼ、ペルオキシダ
ーゼとＮ−スルホプロピル基含有アニリン誘導体又はナ
フトール誘導体と緩衝剤を含む試液、又はグリセロール
キナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、ペルオキシダ
ーゼとＮ−スルホプロピル基含有アニリン誘導体は又は
ナフトール誘導体と緩衝剤を含む試液を調製し、第２試
液としてリポプロティンリパーゼと４−アミノアンチピ
リンと緩衝剤を含む試液を調製する。試料に第１試液を
作用させて、遊離グリセロールから生成した過酸化水素
をペルオキシダーゼの存在下、Ｎ−スルホプロピル基含
有アニリン誘導体又はナフトール誘導体と反応（自己縮
合）させた後、第２試液を作用させ、トリグリセライド
から生成したグリセロールのみから生成した過酸化水素
を比色定量する。

本発明方法は上記基質の測定のほかに、他の酸化酵素に
よる過酸化水素の測定にも利用し得る。

本発明方法は第１試薬と第２試液との混合液を用いる定
置法に比べて、試料中に共存する測定誤差を生ずる物質
の計り込みを減少させ、真の基質又は酵素活性を簡単に
測定することが可能となった。

次に本発明を実施例を用いて説明する。

実施例　１゜ 血清中のトリグリセライドを下記試薬を用い、下記方法
により測定した。

１、　サンプル； 血清；水　　　　　　　＝９：１　■ 血清；グリセリン水溶液＝９：１　■ （ｉ０４０富ｇ／ｄｌ） ２　　試　　　　薬　ニ アニリン誘導体、ナフトール誘導体が下記第１表に示さ
れる化合物であり、第１試液に添加した試薬Ａ〜Ｈ、第
２試液に添加した試薬ａ−ｂをｙＡ袈した。

第１試液 ト　リ　ス緩衝液　（ｐＨ７，０） グリセロキナーゼ　　　　　２．０単位／ｍｅグリセロ
リン酸オキンダーゼ　　　　　　　６．０単位／　ｍ　
Ｑペルオキシダーゼ　　　　１０．０単位／ｍｅアニリ
ン誘導体またはナフトール誘導体　　　　１０ｍｇ／ｄ
ｉ第２試液 トリス緩衝液（ｐＨ７，０） リボプロティンリパーゼ　６００単位置□Ｉ１党４−ア
ミ／アンチピリン　　　　　　　　　　　１０１客／ｄ
ｌアニリン誘導体またはナフトール誘導体　　　　１０
■／ｄｌ３、　７！１１１定法 各サンプル２０μ党に第１試液２ｍ２を加え、３７°Ｃ
にて５分関反応させた後、第２試液をｌｌ１１！加えて
３７°Ｃにて１００分関応させ、４−アミノアンチピリ
ンとアニリン誘導体またはナフトール誘導体との発色体
を試薬Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｆは５５０ｎｍｓ試薬り、Ｅは５９
０ｎｍ１試薬Ｇ。

Ｈは５５ＯＮＭで測定した。その結果を第２表に示す。

本発明である試薬Ａ−Ｈで用いた方法は比較例ａ−ｈに
比較してグリセロール消去能力において優れている。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 　基質から酵素反応により生成した物質に酸化酵素を作
   用させ、生成する過酸化水素を測定することにより、試
   料中の基質を定量する方法において、（ｉ）酸化酵素と
   （ｉｉ）ペルオキシダーゼと（ｉｉｉ）Ｎ−スルホプロ
   ピル基含有アニリン誘導体またはナフトール誘導体を含
   む試液を第１試液とし、（ｉｖ）カップラーを含む試液
   を第２試液とし、試料に第１試液を加えた後、第２試液
   を加えることを特徴とする基質の定量方法。