JPS6123998B2

JPS6123998B2 -

Info

Publication number: JPS6123998B2
Application number: JP56050430A
Authority: JP
Inventors: Shinichi Tejima; Noboru Mitsuhida; Yoshitaka Nakagiri
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1981-04-02
Filing date: 1981-04-02
Publication date: 1986-06-09
Also published as: JPS57163497A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は体液中の基質又は酵素活性の定量方法
に関するものである。

近年、臨床検査において体液中の基質量または
酵素活性を定量する方法として、基質または酵素
反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ、
生成する過酸化水素を測定する方法が盛んに用い
られている。

これらの過酸化水素の測定方法として、ペルオ
キシダーゼの酵素作用により、(1)４−アミノアン
チピリン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン
ヒドラジン等のカツプラーと(2)フエノール誘導
体、アニリン誘導体またはナフトール誘導体等の
色原体とを酸化縮合させて発色体とし、その光学
的吸光度を測定する方法が用いられている。この
方法は操作が簡単であるという特徴を有してい
る。

ところが、最近、この測定方法を用いたコレス
テロールエステル、トリグリセライド、アミラー
ゼ、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナー
ゼ（GOT）、グルタミン酸ピルビン酸トランスア
ミナーゼ（GPT）等の臨床診断において、体液
中の遊離コレステロール、遊離グリセロール、ブ
ドウ糖、ピルビン酸等を誤差として計り込むこと
が問題になつている。

本発明者等は体液中の遊離コレステロール、遊
離グリセロール、ブドウ糖、ピルビン酸等の計り
込みを防止し、正確に目的とするコレステロール
エステル、トリグリセライド等の基質またはアミ
ラーゼ、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナ
ーゼ（GPT）、グルタミン酸オギザロ酢酸トラン
スアミナーゼ（GOT）等の酵素活性を定量する
ことを目的として、種々鋭意検討したところ、本
発明に到達した。すなわち本発明は基質又は酵素
反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ、
生成する過酸化水素を測定することにより、試料
中の基質または酵素活性を定量する方法におい
て、(i)酸化酵素と(ii)ペルオキシダーゼと(iii)フエノ
ール誘導体、アニリン誘導体またはナフトール誘
導体を含む試液を第１試液とし、(iv)カツプラーを
含む試液を第２試液とし、試料に第１試液を加え
た後、第２試液を加えることを特徴とする基質又
は酵素活性の定量方法である。

本発明では、上記第１試液を加えた後、第２試
液を加加ることにより、体液中の遊離コレステロ
ール、遊離グリセロール、ブドウ糖、ピルビン酸
等の計り込みを防止し、簡便且つ正確に目的とす
る基質又は酵素活性を測定することが可能となつ
た。体液中の遊離コレステロール、遊離グリセロ
ール等はフエノール誘導体、アニリン誘導体また
はナフトール誘導体と反応（自己縮合反応）して
可視部に吸収を示さない化学物質に変換され、目
的とする基質又は酵素活性を測定する反応系に関
与しないものと考えられる。逆に第２試液を加え
てから第１試液を加えると、目的が達成されな
い。また４−アミノアンチピリンを酸化酵素、ペ
ルオキシダーゼとともに含む試液を第１試液と
し、フエノール誘導体、アニリン誘導体またはナ
フトール誘導体を含む試液を第２試液とし、第１
試液を加えてから第２試液を加えても目的は達成
されない。例えばトリグリセライド測定におい
て、グリセロキナーゼとグリセロリン酸オキシダ
ーゼを用いて生成した過酸化水素をペルオキシダ
ーゼの存在下、４−アミノアンチピリンと反応
（自己縮合反応）させた後、リパーゼとアニリン
誘導体を加え発色体を生成して、真のトリグリセ
ライドのみを比色測定しようと試みた。しかし、
この方法では第１反応である４−アミノアンチピ
リンと遊離グリセロールとの反応（自己縮合反
応）で可視部に吸収を有する物質（測走波長に影
響を与える物質）が生成し、第２反応で生成した
発色体の比色測定に正誤差となり、問題が生じ
た。

また、真のトリグリセライドを測定する方法と
して、遊離グリセロール値を計り込んだ総トリグ
リセライド値と遊離グリセロール値を各々測定
し、その差を求める方法があるが、簡易性の点で
問題があつた。本発明は上記方法より簡易性の点
で優れる。

本発明方法は基質又は酵素反応により生成した
物質に酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素
を測定することにより、試料中の基質又は酵素活
性を定量する方法である。

定量する基質としては、体液中のコレステロー
ルエステル、トリグリセライド、クレアチニン、
クレアチンなどがある。

定量する酵素としては、体液中のアミノトラン
スアミナーゼ、例えばグルタミン酸オキザロ酢酸
トランスアミナーゼ（GOT）、グルタミン酸ピル
ビン酸トランスアミナーゼ（GPT）、アミラーゼ
などがある。

酵素反応により生成した物質としては、コレス
テロールエステルにコレステロールエステラーゼ
を作用させて生成したコレステロール、トリグリ
セライドにリパーゼを作用させて生成したグリセ
ロール、グリセロールにグリセロキナーゼを作用
させて生成したグリセロール−３−リン酸、α−
ケトグルタル酸とアラニンにグルタミン酸ピルビ
ン酸トランスアミナーゼ（GPT）を作用させて
生成したピルビン酸、デンプンまたはγ−サイク
ロデキストリンを基質として、アミラーゼ、グル
コアミラーゼを作用させ生成したブドウ糖などが
ある。

上記基質又は上記酵素反応により生成した物質
に作用させる酸化酵素としては、コレステロール
オキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、グリ
セロリン酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダー
ゼ、ザルコシンオキシダーゼなどがある。

本発明に用いるフエノール誘導体としては、フ
エノール、ｐ−クロロフエノール、２，４−ジク
ロロフエノール、ｐ−グロモフエノール、ｏ−ク
ロロフエノール、ｍ−クロロフエノール、２，６
−ジクロロフエノール、２，３−ジクロロフエノ
ールなどがある。

アニリン誘導体としては、アニリン、Ｎ，Ｎ−
ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、
Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジ
メチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３
−メチルフエニル）−N′−アセチルエチレンジア
ミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチ
ル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トル
イジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，
５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２
−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−
ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプ
ロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２
−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニ
シジン等がある。

ナフトール誘導体としては、１−ナフトール、
２−ナフトール、４−クロロ−１−ナフトール等
がある。

本発明に用いるカツプラーとしては、４−アミ
ノアンチピリン、３−メチル−２−ベンゾチアゾ
リンヒドラゾン等がある。

本発明に用いる試薬は(i)酸化酵素と(ii)ペルオキ
シダーゼと(iii)フエノール誘導体、アニリン誘導体
またはナフトール誘導体を含む試液を第１試液と
し、(iv)カツプラーを含む試液を第２試液とする。
第１試液および第２試液には前記成分に加えて、
緩衝剤、および必要により界面活性剤、安定化剤
等を含む。緩衝剤としては通常のものが使用さ
れ、第１試液および第２試液のPHを通常５〜10に
調製するものが好ましい。

フエノール誘導体、アニリン誘導体又はナフト
ール誘導体の含有量は第１試液において１×10^-5
〜１×10^-2Mである。カツプラーの含有量は第２
試液において１×10^-6〜１×10^-2Mである。

本発明に用いる試薬には、他の酵素、基質、各
種安定剤、妨害物質除去のための試薬、界面活性
剤等を含んでいてもよい。

次に基質又は酵素活性について具体的に説明す
る。本発明はこれらの具体的に説明されるものに
限定されない。

基質として例えばコレステロールエステルを測
定するには、第１試液として、コレステロールオ
キシダーゼ、ペルオキシダーゼとフエノール誘導
体、アニリン誘導体又はナフトール誘導体と緩衝
剤を含む試液を調製し、第２試液としてコレステ
ロールエステラーゼと４−アミノアンチピリンと
緩衝剤を含む試液を調製する。試料に第１試液を
作用させ、遊離コレステロールから生成した過酸
化水素をペルオキシダーゼの存在下、フエノール
誘導体、アニリン誘導体又はナフトール誘導体と
反応（自己縮合）させた後、第２試液を作用さ
せ、コレステロールエステルから生成したコレス
テロールのみから生成した過酸化水素にペルオキ
シダーゼの存在下、フエノール誘導体、アニリン
誘導体又はナフトール誘導体と４−アミノアンチ
ピリンを作用させて発色体を得、これを比色定量
する。

基質として例えばトリグリセライドを測定する
には、第１試液としてグリセロールオキシダー
ゼ、ペルオキシダーゼとフエノール誘導体、アニ
リン誘導体又はナフトール誘導体と緩衝剤を含む
試液、又はグリセロールキナーゼ、グリセロリン
酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼとフエノール
誘導体、アニリン誘導体又はナフトール誘導体と
緩衝剤を含む試液を調製し、第２試液としてリポ
プロテインリパーゼと４−アミノアンチピリンと
緩衝剤を含む試液を調製する。試料に第１試液を
作用させて、遊離グリセロールから生成した過酸
化水素をペルオキシダーゼの存在下、フエノール
誘導体、アニリン誘導体又はナフトール誘導体と
反応（自己縮合）させた後、第２試液を作用さ
せ、トリグリセライドから生成したグリセロール
のみから生成した過酸化水素を比色定量する。

酵素として例えばグルタミン酸ピルビン酸トラ
ンスアミナーゼ（GPT）の活性を測定するに
は、第１試液としてピルビン酸オキシダーゼ、ペ
ルオキシダーゼとフエノール誘導体、アニリン誘
導体又はナフトール誘導体と緩衝剤を含む試液を
調製し、第２試液としてα−ケトグルタル酸、
DL−アニリンと４−アミノアンチピリンと緩衝
剤を含む試液を調製し、試料に第１試液を作用さ
せて遊離ピルビン酸から生成した過酸化水素をペ
ルオキシダーゼの存在下、フエノール誘導体、ア
ニリン誘導体又はナフトール誘導体と反応（自己
縮合）させた後、第２試液を作用させ、GPTの
作用により生成したピルビン酸のみから生成した
過酸化水素を比色定量する。

本発明方法は上記基質、酵素活性の測定のほか
に、他の酸化酵素による過酸化水素の測定にも利
用し得る。

本発明方法は第１試液と第２試液との混合液を
用いる定量法に比べて、試料中に共存する測定誤
差を生ずる物質の計り込みを減少させ、真の基質
又は酵素活性を簡単に測定することが可能となつ
た。

次に本発明を実施例を用いて説明する。

実施例１血清中のコレステロールエステルを下記試薬を
用い、下記方法により測定した。

１試薬：第１試液リン酸緩衝液（PH5.2）コレステロールオキシダーゼ 0.8単位／ml ペルオキシダーゼ 10単位／ml Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン 20mg／dl 第２試液リン酸緩衝液（PH5.2）コレステロールエステラーゼ 0.4単位／ml ４−アミノアンチピリン２mg／dl ２測定法：血清20μに第１試液１mlを加え、37℃にて
10分間反応させた後、第２試液２mlを加えて37
℃にて10分間反応させた。次いで波長550nmで
吸光度を測定した。

血清中のコレステロールエステル量を既知濃
度のコレステロールリノレート標準液と比較し
てコレステロール濃度として求めた。コレステ
ロールリノレートを用いた検量線を第１図に示
す。また上記第１試液と第２試液との混合液を
用いた場合のコレステロール濃度Ｘ（mg／dl）
と第１試液を添加した後、第２試液を加える本
発明方法によるコレステロール濃度Ｙ（mg／
dl）との関係を第２図に示す。第２図において
ｎ＝80、ｒ＝0.999、ｙ＝0.998x−48である。
ｙ切片の−48は血清中の正常遊離コレステロー
ル値に近く、本発明方法は血清中の遊離コレス
テロールの計り込みがないことを示している。

比較例１実施例２および参考例１血清中のコレステロールエステルを下記試薬を
用い、下記方法により測定した。

１試薬：Ａ４−アミノアンチピリンによる遊離コレステ
ロールの消去法（比較例１）第１試液リン酸緩衝液（PH5.35）コレステロールオキシダーゼ
0.8単位／ml ペルオキシダーゼ 10単位／ml ４−アミノアンチピリン２mg／dl 第２試液リン酸緩衝液（PH5.35）コレステロールエステラーゼ
0.4単位／ml Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン20mg／dl ＢＮ，Ｎ−ジエチルアニリンによる遊離コレス
テロールの消去法（実施例２）第１試液リン酸緩衝液（PH5.35）コレステロールオキシダーゼ
0.8単位／ml ペルオキシダーゼ 10単位／ml Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン20mg／dl アスコルビン酸オキシダーゼ
1.0単位／ml 第２試液リン酸緩衝液（PH5.35）コレステロールエステラーゼ
0.4単位／ml ４−アミノアンチピリン２mg／dl Ｃ総コレステロール測定後、遊離コレステロー
ルを測定し、その差を求める方法（参考例１）第１試液リン酸緩衝液（PH5.35）コレステロールエステラーゼ
0.4単位／ml コレステロールオキシダーゼ
0.8単位／ml ペルオキシダーゼ 10単位／ml ４−アミノアンチピリン２mg／dl Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン20mg／dl 第２試液リン酸緩衝液（PH5.35）コレステロールオキシダーゼ
0.8単位／ml ペルオキシダーゼ 10単位／ml ４−アミノアンチピリン２mg／dl Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン20mg／dl (2) 測定法：Ａ，Ｂ：血清20μに第１試液１mlを加え、37℃
にて３分間反応させた後、第２試液２mlを
加えて37℃にて10分間反応させた。次いで
波長550nmで吸光度を測定した。

血清中のコレステロールエステル濃度を既知濃
度のコレステロールリノレート標準液と比較して
求めた。Ａ法による検量線を第３図に示す。Ｂ法
による検量線を第４図に示す。

Ｃ：血清20μに第１試液３mlと加え、37℃に
て10分間反応させた後、波長550nmで吸光
度を測定した。

血清20μに第２試液３mlを加え、37℃にて10
分間反応させた後、波長550nmで吸光度を測定し
た。

血清中の総コレステロール量、遊離コレステロ
ール量を既知濃度のコレステロールリノレートを
標準液と比較して求め、総コレステロール量から
遊離コレステロール量を差し引き、コレステロー
ル値とした。検量線を第５図に示す。

３測定結果：Ａ法とＣ法との相関を第６図に、Ｂ法とＣ法
との相関を第７図に示す。第６図ではｎ＝80、
ｒ＝0.99、ｙ＝0.998x＋21であり、第７図でで
はｎ＝80、ｒ＝0.99、ｙ＝0.997x＋２である。

第６図および第７図から明らかなように、Ｂ
法（実施例２）ではＣ法（参考例１）とほぼ同
じ値を測定することができ、さらにＣ法より簡
便であるという特徴を有する。Ａ法（比較例
１）では正の誤差が見られる。

実施例３血清中のトリグリセライドを下記試薬を用い、
下記方法により測定した。

１試薬：第１試液トリス緩衝液（PH7.5）グリセロキナーゼ 1.0単位／ml グリセロリン酸オキシダーゼ
3.0単位／ml ペルオキシダーゼ 10.0単位／ml ｐ−クロロフエノール 20mg／dl 第２試液トリス緩衝液（PH7.5）リポプロテインリパーゼ
150単位／ml ４−アミノアンチピリン２mg／dl ２測定法：血清20μに第１試液１mlを加え、37℃にて
10分間反応させた後、第２試液を２ml加えて37
℃にて10分分間反応させた。波長505nmで吸光
度を測定した。

血清中のトリグリセライド量を既知濃度のト
リオレイン標準液と比較して求めた。検量線を
第８図に示す。

また上記第１試液と第２試液との混合液を用
いた場合のトリグリセライド濃度ｘ（mg／dl）
と第１試液を添加した後、第２試液を加える本
発明方法によるトリグリセライド濃度ｙ（mg／
dl）との関係を第９図に示す。第９図において
ｎ＝80、ｒ＝0.9997、ｙ＝0.998x−9.7であ
る。ｙ切片の−9.7は血清中の正常遊離グリセ
ロール値に近く、本発明方法は血清中の遊離グ
リセロールの計り込みがないことを示してい
る。

実施例４血清中のグルタミン酸ピルビン酸トランスアミ
ナーゼ（GPT）を下記試薬を用い、下記方法に
より定量した。

１試薬：第１試液リン酸緩衝液（PH7.0）ピルビン酸オキシダーゼ６単位／ml ペルオキシダーゼ 10.0単位／ml フエノール 20mg／dl チアミンピロリン酸 0.045％フラビンアデニンジヌクレオチド
0.002％酢酸マグネシウム 0.007M 第２試液リン酸緩衝液（PH7.0） α−ケトグルタル酸 0.035M DL−アラニン 0.7M ４−アミノアンチピリン２mg／dl 反応停止液リン酸緩衝液（PH9.0）エチレンジアミン四酢酸２−ナトリウム 0.05M クエン酸３−ナトリウム 0.1M ２測定法：血清20μに第１試液0.5mlを加え、37℃に
て20分間反応させた後、第２試液0.2mlを加え
て37℃にて20分間反応させ、反応停止液２mlを
加え、波長500nmで吸光度を測定した。血清中
のGPT活性量を既知濃度のGPT基準液と比較
して求めた。検量線を第１０図に示す。

また上記第１試液と第２試液との混合液を用
いた場合のGPT活性（カルメン単位）と第１
試液を添加した後、第２試液を加える本発明方
法によるGPT活性値（カルメン単位）との関
係を第１１図に示す。第１１図においてｎ＝
80、ｒ＝０・998、ｙ＝0.98x−3.4である。ｙ
切片の−3.4は血清中の正常遊離離ピルビン酸
値に近く、本発明方法は血清中の遊離ピルビン
酸の計り込みがないことを示している。

【図面の簡単な説明】

第１図はコレステロールエステルの検量線を示
す。第２図は本発明方法と比較法との相関図であ
る。第３〜５図はコレステロールエステルの検量
線を示す。第３図はＡ法（比較例１）、第４図は
Ｂ法（本発明方法）、第５図はＣ法（参考例１）
による。第６図はＡ法とＣ法との相関図、第７図
はＢ法とＣ法との相関図を示す。第８図はトリグ
リセライドの検量線を示す。第９図は本発明方法
と比較方法との相関図である。第１０図はGPT
の検量線を示す。第１１図は本発明方法と比較方
法との相関図である。

Claims

【特許請求の範囲】

１基質又は酵素反応により生成した物質に酸化
酵素を作用させ、生成する過酸化水素を測定する
ことにより、試料中の基質または酵素活性を定量
する方法において、(i)酸化酵素と(ii)ペルオキシダ
ーゼと(iii)フエノール誘導体、アニリン誘導体また
はナフトール誘導体を含む試液を第１試液とし、
(iv)カツプラーを含む試液を第２試液とし、試料に
第１試液を加えた後、第２試液を加えることを特
徴とする基質又は酵素活性の定量方法。