JP2727207B2 - 鮮度測定法及びこれに用いる測定用キット - Google Patents

鮮度測定法及びこれに用いる測定用キット

Info

Publication number
JP2727207B2
JP2727207B2 JP63328329A JP32832988A JP2727207B2 JP 2727207 B2 JP2727207 B2 JP 2727207B2 JP 63328329 A JP63328329 A JP 63328329A JP 32832988 A JP32832988 A JP 32832988A JP 2727207 B2 JP2727207 B2 JP 2727207B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
test piece
test
toluidine
sulfobutyl
freshness
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP63328329A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH01289500A (ja
Inventor
直也 大草
均 内山
義孝 野崎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd
Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd
Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd, Daiichi Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd
Priority to JP63328329A priority Critical patent/JP2727207B2/ja
Priority to EP89902539A priority patent/EP0383922B1/en
Priority to PCT/JP1989/000160 priority patent/WO1989007655A1/ja
Priority to DE68919347T priority patent/DE68919347T2/de
Priority to AT89902539T priority patent/ATE114046T1/de
Publication of JPH01289500A publication Critical patent/JPH01289500A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2727207B2 publication Critical patent/JP2727207B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/008—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions for determining co-enzymes or co-factors, e.g. NAD, ATP
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • G01N33/12—Meat; Fish
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes
    • C12Q2326/90—Developer
    • C12Q2326/96—4-Amino-antipyrine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、鮮度を判定する方法に関し、更に詳細には
魚介類や食肉類の鮮度低下に伴なって生成するATP関連
化合物を簡易かつ迅速に測定する方法及びこれに使用す
るキットに関する。
〔従来の技術〕
近年、魚介類や食肉類の流通において、その鮮度を客
観的に判定することが流通部門を中心に強く要望されて
いる。
従来から魚介類等の鮮度を判定する指標として、ATP
の分解生成物の消長を調べることが知られている。つま
りATPは、ADP、AMP、イノシン酸、イノシン、ヒポキサ
ンチンの順に分解し魚肉内に蓄積する。ATP関連化合物
全量とイノシン、ヒポキサンチン量の比であるＫ値は鮮
度の判定指標として最も的確な指標と評価されている。
このＫ値測定法としては、すでに紫外部吸光度法、可視
部吸光度法、酸素電極法などが実用化されている。これ
らの方法の中で可視部吸光度法はATP関連化合物すべて
を尿酸にまで分解する系を用いている。即ち、酵素反応
系では尿酸とともに過酸化水素（H2O2）が生成するが、
このH2O2を発色法により測定するのが可視部吸光度法で
ある。この方法においては、各酵素試液にカタラーゼ及
び発色剤、例えば４−アミノアンチピリン（カップラ
ー）とフェノール、ジメチルアニリン又はジエチル−ｍ
−トルイジンを加え反応させることによりATP関連化合
物の量に比例した色素の発色がみられる。従って、この
色を分光光度計で測定すればＫ値を求めることができ
る。
この方法は、発色法を利用するため、紫外部の吸光度
を測定する必要がなく、より安価な測定器を利用するこ
とができる利点を有する。また、ATP関連化合物以外に
紫外部吸収化合物が存在する場合には鮮度判定に誤差を
生ずる点を考えると可視部吸光度法は鮮度判定法として
優れた方法である。
〔発明が解決しようとする課題〕
しかしながら、上述の可視部吸光度法においては、す
べての試薬が用時調製であり、作業能率等の面に多くの
問題があった。また、上記可視部吸光度法を簡便に実施
するために、発色剤を試験片に含浸せしめ、ドライ化す
ることも考えられるが、従来用いられている発色剤であ
るフェノール、ジメチルアニリン、ジエチル−ｍ−トル
イジン等はいずれも油状物質であるため、現実には困難
であり、また試験片を用いた場合の感度は溶液を用いた
場合に比べ劣っていた。
〔課題を解決するための手段〕
本発明者らは、魚介類及び食肉類の鮮度判定を、用時
調製の煩わしさがなく、現場において小型の装置を用い
簡便かつ迅速におこなうことのできる方法を開発すべく
鋭意研究をおこなった。そして、その結果、可視部吸光
度法においてＮ−エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トル
イジンを発色剤とし、これをカップラーである４−アミ
ノアンチピリンと組み合せれば、従来の発色剤であるフ
ェノール、ジメチルアニリン、ジエチル−ｍ−トルイジ
ンに比べより鋭敏にATP関連化合物を検出できること及
びこのＮ−エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジン
は容易に試験片に含浸、ドライ化することができ、しか
も試験片で使用した場合でも検出感度が良好であること
を見出した。
すなわち、本発明は（ｉ）ATP関連化合物を含む被検
試料を中和する工程と、（ii）工程（ｉ）で中和された
被検試料の一定量に、ATP関連化合物を過酸化水素と尿
酸に分解する酵素を反応させ、この反応液をＮ−エチル
−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジンを含浸させた試験
片と接触させて試験片を発色させる工程と、（iii）工
程（ｉ）で中和された被検試料の一定量に、イノシン及
びヒポキサンチンを過酸化水素と尿酸に分解する酵素を
反応させ、この反応液にＮ−エチル−Ｎ−スルホブチル
−ｍ−トルイジンを含浸させた試験片と接触させ試験片
を発色させる工程と、（iv）工程（ii）での試験片の発
色と、工程（iii）での試験片の発色を比較する工程と
を含むことを特徴とする鮮度測定法及び当該方法におい
て用いる測定用キットを提供するものである。
本発明方法の工程（ｉ）において用いるATP関連化合
物を含む被検試料は、例えば魚介類または食肉類にタン
パク質変性剤を加え粉砕後濾過する公知の方法によって
調製されたものでも、また魚介類または食肉類を単に緩
衝液中でホモジナイズしたものでもよい。ここでタンパ
ク質変性剤としては、トリクロル酢酸、エタノール、過
塩素酸等が用いられ、試料50〜100mgに対して1.25〜2.5
0mg用いられる。この被検試料は、工程（ｉ）において
中和剤でpH6.8〜８程度に中和される。中和剤には炭酸
緩衝液、水酸化カリウム、リン酸カリウム、または酢酸
カリウム等のpH調節薬が使用できる。
本発明の工程（ii）で用いられる酵素は、被検試料中
に含まれるATP関連化合物全体をH2O2及び尿酸に分解す
るものであり、この中にはアルカリホスファクターゼ、
アデノシンデアミナーゼ、ヌクレオチドホスホリラーゼ
及びキサンチン酸化酵素が含まれることが必要である。
また、工程（iii）で用いられる酵素は、ATP関連化合物
のうちイノシン及びヒポキサンチンをH2O2及び尿酸に分
解するものであり、ヌクレオチドホスホリラーゼ及びキ
サンチン酸化酵素を含み、アルカリホスファクターゼ、
アデノシンデアミナーゼを含まないことが必要である。
上記した酵素反応のうち（ii）工程における各酵素の
使用量は、被検試料50〜100mgに対し、アルカリホスフ
ァクターゼ218〜438U、アデノシンデアミナーゼ31〜63
U、キサンチンオキシダーゼ0.25〜0.5U、ヌクレオチド
ホスホリラーゼ1.25〜2.5Uであり、また（iii）工程に
おける各酵素の使用量は、ヌクレオチドホスホリラーゼ
1.25〜2.5U、キサンチンオキシダーゼ0.25〜0.5Uであ
る。
これら両工程において用いられる試験片は、発色剤で
あるＮ−エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジンを
水に溶解し、これを担体に含浸させた後、乾燥させるこ
とにより調製される。担体としては、濾紙のほか、不織
布、ゼラチン膜、コラーゲン膜等を利用することができ
る。この試験片調製に当っての好ましい製造方法の例と
しては、リン酸−カリウム230〜460mg、リン酸二ナトリ
ウム43〜86mgとＮ−エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−ト
ルイジンナトリウム13〜24mgを精製水2.5〜3mlに溶解
し、該溶液を常法により担体に含浸させた後乾燥させ、
この乾燥させた担体を適当な大きさに裁断し必要に応じ
てスティック状のプラスチック等に接着固定する方法が
挙げられる。工程（ii）及び工程（iii）における試験
片の発色は、試験片を各酵素で処理した中和被検試料に
浸漬することによりおこなわれる。このうち工程（ii）
の発色はATP関連化合物総量を示し、工程（iii）の発色
は、イノシン及びヒポキサンチン分解生成物量を示すも
のである。なお、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−
トルイジンに対するカップラーとしては、４−アミノア
ンチピリンが好ましく、該化合物は、工程（ii）及び
（iii）の酵素反応時に添加することもできるが、工程
（ｉ）の中和時に添加することが安定性の面で望まし
い。
工程（iv）における、工程（ii）及び工程（iii）の
試験片の発色量の比較は、例えば当該発色片の色相の反
射率を調べることによりおこなわれる。すなわち、工程
（ii）及び（iii）によって得られる試験片から吸取紙
等によって付着水を除去した後反射率を測定する方法に
よって行われるが、付着水を除去することなく反射率を
測定する方法によっても行うこともできる。そして、こ
の比較の結果から魚介類又は食肉類の鮮度を判定する。
すなわち、ATP関連化合物総量（Ａ＋Ｂ）に対するイノ
シン及びヒポキサンチン分解生成物量（Ｂ）の割合（Ｋ
値）を求め、Ｋ値が零に近づく程新鮮度が大であると判
断できるし、またＫ値が100％に近づく程新鮮度が小で
あると判断される。
ここにおいて、付着水を除去した試験片について反射
率を測定した場合には、その反射率比（〔Ｂ〕／〔Ａ＋
Ｂ〕）からＫ値を求めればよい。また付着水を除去しな
い試験片について反射率を測定した場合には、その絶対
反射率（Ｒ∞）をクベルカームンク（Kubelka−Munk）
の式〔月刊薬時,vol.26,No.2,301（1984）〕に当てはめ
てK/S値〔K/S＝（１−Ｒ∞）2/2R∞〕（式１）を求め、
次式に従ってＫ値を求める。
なお、上記中和剤及び酵素製剤を各々試験管等で凍結
乾燥しておくと試薬の安定性も増し、また使用も容易で
ある。これらの凍結乾燥する場合は、例えば中和剤は、
pH調節試薬を溶解した溶液にフィコールとカップラーと
して４−アミノアンチピリンを溶解し試験管に分注し常
法で凍結乾燥すれば良く、また各酵素製剤も所要酵素及
びフィコール等の任意成分を生成水に溶解し試験管に分
注し同様に凍結乾燥すれば良い。なお、酵素製剤は、所
要酵素をすべて混合したものを製剤化しても、中和剤と
混合したものを製剤化してもまた、いくつかの酵素群を
分包したものであっても良い。
次に本発明方法の態様を、試薬及び測定方法とともに
第１表に示す。
本発明第一態様において、Ａは、（ｉ）の中和のため
に用いられるものであり、中和剤としては炭酸ナトリウ
ム緩衝液等が用いられる。また、酵素製剤のうち、Ｂ試
薬は工程（ii）において、Ｃ試薬は工程（iii）におい
て使用される。
本発明第二態様及び第三態様は、第４図に示すような
Ｃ試薬と発色剤を同一の支持体に含浸せしめた複合試験
片を用いるものである。これら態様において用いられる
試験片は、各試験片の末端を介して相互に吸着的接触状
態にあるシート状ゾーンからなり、酵素反応成分（Ｃ試
薬）と発色成分が相互に空間的に分離されて存在するよ
うに配置されている。そしてそれら試験片は固体支持体
に固定されており、被検試料に浸すと毛細管力により制
御される液体が発色剤を含有する試験片を経由し、最終
的に試薬Ｃの試験片は発色する。
この複合試験片調製に当っての好ましい製造方法の例
としては、リン酸−カリウム5.0〜10.5mg、リン酸二ナ
トリウム8.5〜17.5mg、ペルオキシダーゼ125〜250U、キ
サンチンオキシダーゼ0.3〜0.6U、ヌクレオチドホスホ
リラーゼ1.5〜3U、フィコール100〜200mg、ショ糖40〜8
5mgを精製水1.5〜2.0molに溶解し、該溶液を常法により
担体に含浸させた後乾燥させ、この乾燥させた担体を適
当な大きさに裁断した試薬Ｃの試験片を、リン酸一カリ
ウム230〜460mg、リン酸二ナトリウム43〜86mg及びＮ−
エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジンナトリウム
12〜24mgを精製水0.8〜1.0molに溶解し、該溶液を常法
により担体に含浸させた後乾燥させ、この乾燥させた担
体を適当な大きさに裁断して得た発色剤の試薬に隣接さ
せて、スティック状のプラスチック等に接着固定する方
法が挙げられる。
この複合試験片を用いれば、被検体中へのＣ試薬の添
加と、発色片の浸漬を同時におこなうことができ、より
簡便に魚介類及び食肉類の鮮度を測定することが可能と
なる。
複合試験片を用いる方法のうち、第三態様の方法によ
ればATP関連化合物を含む被検試料を中和する工程とイ
ノシン及びヒポキサンチンに分解する酵素を反応させる
工程とを合一にし、工程を簡略させることができる。す
なわち、具体的に例を挙げて説明すれば、４−アミノア
ンチピリン20〜40.5mg、フィコール200〜400mgを0.2M炭
酸緩衝液16〜20mlに溶かし、この溶液を試験管に100μ
ずつ分注し凍結乾燥してイノシン及びヒポキサンチン
分解生成物測定用とする。一方、４−アミノアンチピリ
ン20〜40.5mg、フィコール200〜400mg、アルカリホスフ
ァターゼ凍乾品525〜1050U、アデノシンデアミナーゼ凍
乾品75〜150Uを0.2M炭酸緩衝液16〜20mlに溶かし、この
溶液を試験管に100μずつ分注し凍結乾燥してATP関連
化合物総量測定用とする。第６図に示すように、この方
法によれば、被検試料を直接、上記のATP関連化合物総
量試験管とイノシン及びヒポキサンチン分解生成物量用
試験管に注入し、それぞれ複合試験片を同時に浸漬する
ことができ、さらにより簡便に魚介類及び食肉類の鮮度
を測定することが可能となる。
次に本発明の方法の実施に関して第一の態様の凍結乾
燥試薬を例にとりより具体的に説明する。
魚介類若しくは食肉類の肉片少量と、タンパク質変性
剤溶液を加え乳鉢等で肉片を粉砕した後、濾過を行う。
該濾過液を試薬Ａの試験管に入れ、凍結乾燥試薬を溶解
する。次にこの溶液の一定量を取り、試薬Ｂの試験管に
加え、室温〜37℃で数分〜数十分間インキュベートす
る。
一方、試薬Ｃの試験管は２本用意しておき、１本の試
験管には前記試薬Ａの試験管中の残液を先と同量分取し
加える。他の１本には先にインキュベートしておいた溶
液を加える。そして各々の試験管に前記記載の方法で作
成した試験片を各々浸漬し室温〜37℃で数分〜数十分間
インキュベートした後、各々の試験片の色相を反射率を
求めＫ値を算出する。
斯くすることにより容易に魚介類及び食肉類の鮮度を
容易に判定することができる。
〔発明の効果〕
本発明方法は感度が高くかつドライ化し得るＮ−エチ
ル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジンを発色剤とし、
これを浸漬せしめた試験片あるいは試薬Ｃと前記発色剤
との複合試験片を用いるものであるので、魚介類及び食
肉類の鮮度を、大掛かりな装置等を要さずに容易に迅速
に測定することが可能となる。
〔実施例〕
実施例1. （１） 試薬の調製 Ａ試薬（中和剤） 0.2M炭酸緩衝液40mlに４−アミノアンチピリン81mg
及びフィコール400 800mgを溶かす。上記溶液を試験管
に200μずつ分注し、凍結乾燥する。乾燥後試験管はN
2ガス置換して密栓する。
Ｂ試薬： アルカリホスファクターゼ凍乾品525U、アデノシン
デアミナーゼ凍乾品75U及びフィルコール400 200mgを
精製水10mlに溶かす。上記溶液を試験管に100μずつ
分注し、凍結乾燥する。乾燥後試験管はN2ガス置換して
密栓する。
Ｃ試薬： リン酸−カリウム42mg、リン酸二ナトリウム70mg、
ペルオキシダーゼ800U、キサンチンオキシダーゼ2.4U、
ヌクレオチドホスホリラーゼ12U、フィコール800mg、シ
ョ糖340mgを精製水40mlに溶かす。上記溶液を試験管に1
00μずつ分注し、凍結乾燥する。乾燥後試験管はN2ガ
ス置換して密栓する。
試験片： リン酸−カリウム230mg、リン酸二ナトリウム43m
g、及びＮ−エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジ
ンナトリウム12mgを精製水3mlに溶かす。この溶液を６
×6cm（36cm2）の東洋濾紙No.526に浸漬した後、これを
真空乾燥する。乾燥濾紙は６×6mmの正方形に裁断し、
プラスチック製支持体の一端に両面粘着テープ（バイエ
ルスドルフ製「テサバンド」）で接着固定する。
（２） 操作手順 AMPとイノシンをその合計量で0.4μM/mlとなるように
混合して被検体を調製し、その120μをＡ試薬に入
れ、この内60μをＢ試薬に分注し37℃15分間インキュ
ベートする、Ｃ試薬２本を用意し、上記Ａ試薬残液60μ
と先にインキュベートしたＢ試薬の60μをそれぞれ
Ｃ試薬に注入する。そして各試験管に試験片をそれぞれ
浸漬して37℃15分間インキュベートする。試験管から試
験片を取り出し軽く吸取紙で付着水を除いた後反射率計
で560nmの反射率を測定し、〔Ａ＋Ｂ〕、〔Ｂ〕の反射
率をそれぞれ求め、〔Ｂ〕／〔Ａ＋Ｂ〕を反射率比とし
た。
この操作手順の概要を第１図に示す。
上記の如くして得た反射率比と従来法による吸光度比
についてそれらの関係を調べた。この結果を第２図に示
す。なお、吸光度比の求め方は試験片の代わりに下記処
方の発色液200μを試験片を浸漬する時点でＣ試薬凍
結試験管に注入しインキュベート37℃15分間後吸光度を
測定し、〔Ａ＋Ｂ〕、〔Ｂ〕をそれぞで求め、〔Ｂ〕／
〔Ａ＋Ｂ〕を吸光度比とした。
第２図から明らかなように、本発明方法は従来方法と
良い相関関係を示し、Ｋ値測定法として使用できること
が明らかである。
実施例2. 発色剤として、フェノール、ジメチルアニリン、ジエ
チル−ｍ−トルイジン及びＮ−エチル−Ｎ−スルホブチ
ル−ｍ−トルイジンを用い、本発明方法と同一な試験片
法及び公知の発色液法を用い、発色剤の相異による感度
の差を比較した。試料としてはイノシン0.2μM/mlとAMP
0.2μM/ml等量50μを使用した。公知方法の発色液の
処方は下記の通りで、その操作は下記処方の発色液を試
験片の代わりにＣ試薬・凍結試験管に200μ注入しイ
ンキュベートした後吸光度（500nm）を測定した。
また、試験片法は、変色を目視で判定（白色（−）
紫色（））する以外は実施例１に準じておこなった。
この結果を第１表に示す。
第１表に示す通り発色液の方法も試験片の方法もフェ
ノール、ジメチルアニリン、ジエチル−ｍ−トルイジン
の感度はＮ−エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジ
ンナトリウムより明らかに劣ることが判った。
実施例3. （１） 試薬の調製 Ａ試薬（中和剤） 実施例1.に同じ Ｂ試薬 実施例1.に同じ Ｃ試薬試験片 リン酸−カリウム10.5mg、リン酸二ナトリウム17.5
mg、ペルオキシダーゼ200U、キサンチンオキシダーゼ0.
6U、ヌクレオチドホスホリラーゼ3U、フィコール400 2
00mg、ショ糖85mgを精製水1.8mlに溶かす。この溶液を
６×6cmの東洋濾紙No.526に浸漬した後、これを真空乾
燥する。乾燥濾紙は６×6mmの正方形に裁断する。
発色剤試験片 リン酸−カリウム230mg、リン酸二ナトリム43mg及
びＮ−エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジンナト
リウム12mgを精製水1mlに溶かす。この溶液を６×3cmの
東洋濾紙No.526に浸漬した後、これを真空乾燥する。乾
燥濾紙は６×3mmの矩形に裁断する。
、２つの試験片を相前後して接触させながら両
面粘着テープ（バイエルスドルフ製「テサバンド」）に
よりプラスチック支持体に固定して巾6mm長さ9mmの複合
試験片を形成する。第４図に複合試験片の斜視図を示
す。
（２） 操作手順 AMPとイノシンをその合計量で0.4μM/mlとなるように
混合して被検体を調製し、その120μをＡ試薬に入
れ、この内60μをＢ試薬に分注し37℃15分間インキュ
ベートする。Ｃ試薬と発色剤をそれぞれ含浸した試験片
を組合せた複合試験片２本を用意し、上記Ａ試薬残液と
先にインキュベートしたＢ試薬にそれぞれ複合試験片を
浸漬して37℃15分間インキュベートする。試験管から複
合試験片を取り出し、軽く吸取紙で付着水を除いた後反
射率計で560nmの反射率を測定し、〔Ａ＋Ｂ〕、〔Ｂ〕
の反射率をそれぞれ求め〔Ｂ〕／〔Ａ＋Ｂ〕を反射率比
とした。その操作手順の概要を第３図に示す。上記の如
くして得た反射率比を第５図に示した。
実施例4. （１） 試薬の調製 Ａ試薬 0.2M炭酸緩衝液20mlに４−アミノアンチピリン40.5
mg、フィコール400 400mgを溶かす。上記溶液を試験管
に100μずつ分注し凍結乾燥する。乾燥後試験管をN2
ガス置換して密栓する。
Ａ＋Ｂ試薬 0.2M炭酸緩衝液19.4mlに４−アミノアンチピリン4
0.5mg、フィコール400 400mg、アルカリホスファター
ゼ凍乾品1050U、アデノシンデアミナーゼ凍乾品150Uを
溶かす。上記溶液を試験管に100μずつ分注し凍結乾
燥する。乾燥後、試験管をN2ガス置換して密栓する。
Ｃ試薬試験片 実施例3.に同じ 発色剤試験片 実施例3.に同じ （２）操作手順 AMPとイノシンをその合計量で0.4μM/mlとなるように
混合して被検体を調製し、その60μをそれぞれＡ試薬
とＡ＋Ｂ試薬に入れる。被検体の入ったＡ＋Ｂ試薬の試
験管は37℃15分間インキュベートする。Ｃ試薬と発色剤
をそれぞれ含浸した試験片を組合せた複合試験片２本を
用意し、上記Ａ試薬と先にインキュベートしたＡ＋Ｂ試
薬に複合試験片を浸漬し37℃15分間インキュベートす
る。試験管から複合試験片を取り出し、軽く吸取紙で付
着水を除いた後、反射率計で560nmの反射率を測定し
〔Ａ＋Ｂ〕、〔Ｂ〕の反射率をそれぞれ求め〔Ｂ〕／
〔Ａ＋Ｂ〕を反射率比とした。その操作手順の概要を第
６図に示す。上記の如くして得た反射率比は実施例3.の
反射率比と同様な結果を得た。
実施例5. （１） 試薬の調製 Ａ試薬、Ａ＋Ｂ試薬、Ｃ試薬試験片及び発色剤試験片
は総て実施例4.と同様の物を使用した。
（２） 操作手順 実施例4.と同様に操作するが、試験管から複合試験片
を取り出し、付着水を除くこと無く、分光色差計（日本
電色工業（株）シグマ（Σ）−80）で560nmの反射率を
測定し、式（１）によって（K/S）A+B、（K/S）Ｂ、（K
/S）ブランク(A+B)、（K/S）ブランク(B)をそれぞれ求
め、式（２）によってＫ値を算出した。その結果を第２
表に示す。
実施例6. （１） 試薬の調製 Ａ試薬 0.1Mトリス緩衝液20mlに４−アミノアンチピリン4
0.5mg、フィコール400 400mgを溶かす。上記溶液を試
験管に100μずつ分注し凍結乾燥する。乾燥後試験管
をN2ガス置換して密栓する。
Ａ＋Ｂ試薬 0.1Mトリス緩衝液13.4mlに４−アミノアンチピリン
40.5mg、フィコール400 400mg、アルカリホスファター
ゼ凍乾品1050U、アデノシンデアミナーゼ凍乾品150Uを
溶かす。上記溶液を試験管に100μずつ分注し凍結乾
燥する。乾燥後、試験管をN2ガス置換して密栓する。
Ｃ試薬試験片 実施例3.に同じ 発色剤試験片 実施例3.に同じ （２） 操作手順 0.1Mトリス緩衝液5mlに刺身用まぐろ100mgを入れ、こ
れをホモジナイズする。その60μをそれぞれＡ試薬と
Ａ＋Ｂ試薬に入れる。被検体の入ったＡ＋Ｂ試薬の試験
管は37℃15分間インキュベートする。Ｃ試薬と発色剤を
それぞれ含浸した試験片を組合せた複合試験片２本を用
意し、上記Ａ試薬と先にインキュベートしたＡ＋Ｂ試薬
に複合試験片を浸漬し37℃15分間インキュベートする。
試験管から複合試験片を取り出し、濡れた状態で、分光
色差計で560nmの反射率を測定し、実施例５と同様にし
てＫ値を算出した。
尚比較として、刺身用まぐろを0.1Mトリス緩衝液でホ
モジナイズする代りに、トリクロル酢酸で除タンパクし
た後ホモジナイズする公知の方法によって調製した検液
について上記と同様に操作してＫ値を算出した。
その結果は第３表に示すとうりであり、両者の結果は
よく一致した。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明方法の工程の一例を示す図面である。 第２図は、本発明実施例1.の方法による反射率比と従来
法による吸光度比の関係を示す図面である。 第３図は、本発明方法の第２の態様の工程の例を示す図
面である。 第４図は、本発明方法で使用した複合試験片の図面であ
る。 第５図は、本発明実施例3.の方法で得た検量線を示す図
面である。 第６図は、本発明方法の第３の態様の工程の例を示す図
面である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/12 Ｇ０１Ｎ 33/12 審査官 田中 美奈子 (56)参考文献 特開 昭60−47698（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−213399（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−130200（ＪＰ，Ａ)

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ｉ）ATP関連化合物を含む被検試料を中
    和する工程と、（ii）工程（ｉ）で中和された被検試料
    の一定量に、ATP関連化合物を過酸化水素と尿酸に分解
    する酵素を反応させ、この反応液をＮ−エチル−Ｎ−ス
    ルホブチル−ｍ−トルイジンを含浸させた試験片と接触
    させて試験片を発色させる工程と、（iii）工程（ｉ）
    で中和された被検試料の一定量に、イノシン及びヒポキ
    サンチンを過酸化水素と尿酸に分解する酵素を反応さ
    せ、この反応液にＮ−エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−
    トルイジンを含浸させた試験片と接触させ試験片を発色
    させる工程と、（iv）工程（ii）での試験片の発色と、
    工程（iii）での試験片の発色を比較する工程とを含む
    ことを特徴とする鮮度測定法。
  2. 【請求項２】工程（ｉ）の中和を４−アミノアンチピリ
    ンを含有する中和剤でおこなう特許請求の範囲第１項記
    載の鮮度測定法。
  3. 【請求項３】工程（ii）の酵素がアルカリホスファター
    ゼ、アデノシンデアミナーゼ、ヌクレオチドホスホリラ
    ーゼ及びキサンチン酸化酵素の混合物である特許請求の
    範囲第１項記載の鮮度測定法。
  4. 【請求項４】工程（iii）の酵素がヌクレオチドホスホ
    リラーゼ及びキサンチン酸化酵素の混合物である特許請
    求の範囲第１項記載の鮮度測定法。
  5. 【請求項５】ATP関連化合物を含有する試料が魚介類及
    び食肉類の肉片にタンパク質変性剤を加えて粉砕し、抽
    出して得たものである特許請求の範囲第１項記載の鮮度
    測定法。
  6. 【請求項６】（ａ）４−アミノアンチピリンを含有する
    中和剤 （ｂ）アルカリホスファターゼ、アデノシンデアミナー
    ゼを含有する酵素試薬 （ｃ）ヌクレオチドホスホリラーゼ、キサンチン酸化酵
    素及びペルオキシダーゼを含有する酵素試薬 （ｄ）Ｎ−エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジン
    を含浸した試験片 よりなる鮮度測定用キット。
  7. 【請求項７】（ａ）４−アミノアンチピリンを含有する
    中和剤 （ｂ）アルカリホスファターゼ及びアデノシンデアミナ
    ーゼを含有する酵素試薬 （ｃ）ヌクレオチドホスホリラーゼ、キサンチン酸化酵
    素及びペルオキシダーゼを含浸した試験片とＮ−エチル
    −Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジンを含浸した試験片
    との複合試験片 よりなるの鮮度測定用キット。
  8. 【請求項８】（ａ）４−アミノアンチピリンを含有する
    中和剤 （ｂ）４−アミノアンチピリン及びアルカリホスファタ
    ーゼ、アデノシンデアミナーゼを含有する中和剤及び酵
    素試薬 （ｃ）ヌクレオチドホスホリラーゼ、キサンチン酸化酵
    素及びペルオキシダーゼを含浸した試験片とＮ−エチル
    −Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジンを含浸した試験片
    との複合試験片 よりなる鮮度測定用キット。
JP63328329A 1988-02-18 1988-12-26 鮮度測定法及びこれに用いる測定用キット Expired - Fee Related JP2727207B2 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP63328329A JP2727207B2 (ja) 1988-02-18 1988-12-26 鮮度測定法及びこれに用いる測定用キット
EP89902539A EP0383922B1 (en) 1988-02-18 1989-02-17 Method for measuring degree of freshness and measuring kit for the method
PCT/JP1989/000160 WO1989007655A1 (en) 1988-02-18 1989-02-17 Method for measuring degree of freshness and measuring kit for the method
DE68919347T DE68919347T2 (de) 1988-02-18 1989-02-17 Messverfahren des frischegrades und messsatz dazu.
AT89902539T ATE114046T1 (de) 1988-02-18 1989-02-17 Messverfahren des frischegrades und messsatz dazu.

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP63-36047 1988-02-18
JP3604788 1988-02-18
JP63328329A JP2727207B2 (ja) 1988-02-18 1988-12-26 鮮度測定法及びこれに用いる測定用キット

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH01289500A JPH01289500A (ja) 1989-11-21
JP2727207B2 true JP2727207B2 (ja) 1998-03-11

Family

ID=26375056

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63328329A Expired - Fee Related JP2727207B2 (ja) 1988-02-18 1988-12-26 鮮度測定法及びこれに用いる測定用キット

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP0383922B1 (ja)
JP (1) JP2727207B2 (ja)
AT (1) ATE114046T1 (ja)
DE (1) DE68919347T2 (ja)
WO (1) WO1989007655A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4291381B2 (ja) * 2006-10-06 2009-07-08 實 佐藤 食肉の鮮度判定方法
JP5969731B2 (ja) * 2008-10-17 2016-08-17 国立大学法人東京海洋大学 鮮度測定用試薬キット
JP5386752B2 (ja) * 2009-04-21 2014-01-15 国立大学法人 東京大学 微生物の数または量を測定する方法および装置
CN111855651A (zh) * 2020-08-21 2020-10-30 黑龙江谱尼测试科技有限公司 一种肉新鲜度的快速筛查方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57163497A (en) * 1981-04-02 1982-10-07 Toyobo Co Ltd Determination of substrate or enzyme activity
JPS59130200A (ja) * 1983-01-11 1984-07-26 Nomura Seibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk 鮮度判定方法及び装置
JPS6047695A (ja) * 1983-08-26 1985-03-15 Oriental Yeast Co Ltd 魚介類の鮮度判定恒数ｋ値の簡易測定法
JPH066080B2 (ja) * 1984-11-13 1994-01-26 オリエンタル酵母工業株式会社 魚介類および食肉類の鮮度測定法およびそのためのキツト
ATE166904T1 (de) * 1993-03-31 1998-06-15 Montell North America Inc Flammwidrige propylenpolymerzusammensetzungen welche wismutcarbonat und eine bromierte aromatische verbindung enthalten

Also Published As

Publication number Publication date
DE68919347T2 (de) 1995-05-24
EP0383922A1 (en) 1990-08-29
JPH01289500A (ja) 1989-11-21
DE68919347D1 (de) 1994-12-15
EP0383922B1 (en) 1994-11-09
ATE114046T1 (de) 1994-11-15
WO1989007655A1 (en) 1989-08-24
EP0383922A4 (en) 1991-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6121050A (en) Analyte detection systems
CA1114268A (en) Glucose indicator and method
De la Harpe et al. A semi-automated micro-assay for H2O2 release by human blood monocytes and mouse peritoneal macrophages
CA1131107A (en) Color stable glucose test
LT3136B (en) Method of analysis, reagent composition and use thereof for glucose determination in the whole blood
US4277561A (en) Support for the determination of enzyme activities and process
FI78926B (fi) Bestaemning av esterasaktivitet i ett flytande prov.
US4030995A (en) Alkaline phosphatase isoenzyme determination
CN109916895A (zh) 一种定量测定肌酐浓度的干化学试剂片及其制备方法
JPH0721455B2 (ja) 液体試料中の特定成分を分析するための用具および方法
JP2727207B2 (ja) 鮮度測定法及びこれに用いる測定用キット
JPS61170400A (ja) 酵素阻害によるテオフイリンの分析用分析素子，組成物および方法
JPH0630633B2 (ja) アレルギーの検出法並びに該方法に好適な試薬及び装置、及びアレルギー用薬及び抗炎症剤の測定法
JPH04210599A (ja) 体液中の二酸化炭素の定量アッセイのための方法及び要素
JPS6152300A (ja) 過酸化水素測定用組成物
CA1174950A (en) Method and composition for urobilinogen control standard
CN109916894A (zh) 一种定量测定葡萄糖浓度的干化学试剂片及其制备方法
Capitán-Vallvey et al. Single-use optical sensor for the determination of iron in water and white wines
EP0258035B1 (en) Analytical element and method for theophylline determination having increased alkaline phosphatase isoenzyme
French et al. A comparison of methods for measuring acetyl cholinesterase activity in blood samples inhibited by carbamates
Heilbronn An electrometric method for the determination of cholinesterase activity
JPS58193459A (ja) アンモニアおよび尿素の分析具
JPH1099098A (ja) トレハロース分析用試薬
Crook et al. The colorimetric determination of dipeptides by means of oxygenated cobalt complexes
De La Huerga et al. The measurement of cholesterol in serum: reference method

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Cancellation because of no payment of annual fees