FI78926B - Bestaemning av esterasaktivitet i ett flytande prov. - Google Patents

Description

1 78926

Esteraasiaktiivisuuden määrittäminen nestemäisestä näytteestä

Keksinnön kohteena on valkosolujen läsnäolon tai 5 muun esteraasiaktiivisuuden määrittäminen testinäytteestä.

Lisäksi keksinnön kohteena on koeväline ja puoli-kvantitatiivinen määritysmenetelmä, joka on nopea ja joka tekee mikroskooppitutkimuksen tai nestekemialliset laboratorio-toimenpiteet tarpeettomiksi.

10 Epänormaalien valkosolumäärien läsnäolo potilaan virtsassa osoittaa mahdollisesti sellaisia sairalloisia tiloja kuin munuais- tai virtsa- ja sukuelinten alueen infektioita tai muita toimintahäiriöitä. Siten tarkka tieto virtsan valkosoluista voi olla korvaamattoman ar-15 vokas väline lääkärille tällaisten sairauksien taudinmäärityksessä ja hoidossa. Perinteisesti lääkärikunta on luottanut silmämääräisiin määritysmenetelmiin valkosolu-populaation laskemiseksi virtsasedimentistä tai sentrifu-goimattomasta virtsasta, eli prosessiin, joka vaatii kal-20 liin laitteiston, kuten sentrifugin ja mikroskoopin samalla, kun se vie myös melkoisen osan kliinikon ajasta. Lisäksi näissä perinnäisissä menetelmissä on se puute, että ainoastaan ehjät solut määritetään. Virtsajärjestelmässä esiintyvät valkosolut ovat syynä tiloihin, jotka voivat 25 edistää laajaa solujen hajoamista. On esimerkiksi tunnettua, että virtsoissa, joiden pH on epänormaalin korkea, valkosolujen puoliintumisaika voi olla niinkin lyhyt kuin 60 minuuttia. Koska hajonneita soluja ei havaita silmämääräisissä tutkimusmenetelmissä, voi tuloksena olla erheel-30 lisen alhaisia määriä ja vääriä negatiivisia tuloksia.

Kahdesta mikroskooppisesta valkosoluanalyysimene-telmästä - virtsasedimentin ja sentrifugoimattoman, homogenoidun virtsan analyysistä - edellinen on selvästi toivottavin. Vaikka jälkimmäiselläkin voidaan saada luotet-35 tavia tuloksia, käytetään useimmissa tapauksissa virtsa- 2 78926 sedimenttitutkimusta. Se edellyttää, että virtsanäyte sentrifugoidaan ja sedimentti eristetään ja tutkitaan sitten mikroskoopin avulla. Analyysin tekijä laskee sitten näkökentässä näkyvien valkosolujen lukumäärän. Tätä teh-5 tävää monimutkaistaa lisäksi muiden virtsakomponenttien, kuten epiteelisolujen ja suolaosasten läsnäolo sedimentissä. Sedimenttiaineosien vaihteleva sisältö, johon liittyy muita vaikeuttavia tekijöitä, kuten näytteen ei-homo-geenisyys ja mikroskooppilaitteiston vaihtelevat optiset 10 tehot, voi johtaa suuriin virheisiin lopullisessa määrityksessä.

Siten on selvää, että nopea, helppo valkosolujen määritysmenetelmä, joka poistaisi aikaavievien menetelmien ja kalliin laitteiston tarpeen ja antaisi tarkkoja tulok-15 siä, olivatpa solut eheitä tai hajonneita, todella veisi tekniikkaa suuresti eteenpäin.

Tämä keksintö tarjoaa tällaisen edun. Se ei perustu kykyyn nähdä valkosoluja, vaan se perustuu valkosolujen entsymaattiseen aktiivisuuteen, minkä vuoksi se ei ole 20 alttiina edellä kuvatuille epätarkkuuksille.

Ennestään tunnetaan joukko kirjallisuutta, jossa esitetään tiettyjen estereiden käyttö ja jossa esterit entsymaattisen pilkkoutumisen seurauksena aiheuttavat värin muodostusta tai muita havaittavia muutoksia. Siten 25 GB-patenttijulkaisussa 1 128 371 esitetään indoksyyli- ja tioindoksyyliesterien käyttö käyttökelpoisina väriä synnyttävinä aineina hydrolyyttisten entsyymien havaitsemiseksi kehon nesteissä. Entsyymit pilkkovat esterin, jolloin muodostuu vapaa indoksyyli, joka hapettuu ja muodos-30 tuu dimeerisen tuotteen helposti havaittava indigonsininen väri. Tällaisen aktiivisuuden sanotaan aiheutuvan muiden entsyymien ohella kolliiniesteraasista. Tässä julkaisussa esitetään myös, että esterisubstraatin indoksyyliosan lisäksi happoryhmä valitaan erityisesti löydettävän ent-35 syymin perusteella. On esim. todettu, että esteraasin tai 3 78926 lipaasin havaitsemista varten happoryhmä voi olla asetaat-ti, lauraatti tai stearaatti. Sellaisten entsyymien, kuten fosfataasin tai sulfataasin havaitsemiseksi voi asyyliryh-mä olla epäorgaaninen. Tässä GB-patenttijulkaisussa 5 ehdotetaan väriä synnyttävien esterien käyttöä substraatteina esterolyyttisten entsyymien määrittämistä varten, jolloin tällaisilla estereillä on alkoholi-osana indok-syyli tai tioindoksyyli, ja asyyli-osa valitaan kulloinkin tilanteen mukaan vaikuttamaan osaltaan määritettävään 10 nimenomaiseen entsyymiin.

Asyyliryhmän huolellisen valinnan vaikutus on parhaiten esimerkein selvitetty kahdessa kirjallisuusviitteessä, jotka osoittavat esteraasin spesifisyyden estereille, joissa asyyliryhmä on N-suojattu aminohappo tai 15 peptidi. Siten Janoff et ai., Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 136 (1971), ss. 1045 - 1049, esittävät, että alaniinieste-rit ovat spesifisiä substraatteja esteraasille, joka on saatu ihmisen valkosoluista. Erityisesti tämä viite esittää, että ihmisen valkosolujyvästen uute hydrolysoi n-20 asetyyli-l-alanyyli-l-alanyyli-l-alaniinimetyyliesterin.

Lisäksi 1-alaniini-p-nitrofenoliesteri hydrolysoitui samalla tavalla muodostaen p-nitrofenolin väriä.

Samalla tavalla Sweetman et ai.. Jour. Hist. Soc. 22, ss. 327 - 339, esittävät 1-naftyyli-N-asetyyli-DL-25 alaniinin ja 1-naftyyli-butyraatin sekä 1-naftyyli-l-ala- nyyli-l-alanyyli-l-alaniinin käytön esteraasin läsnäolon osoittamiseen.

US-patenttijulkaisussa 4 278 763 (joka on siirretty Boehringer Mannheim GmbH:lie) yhdistetään nämä opetukset 30 ja päädytään aminohappojen tai peptidien indoksyyli- tai tioindoksyyliestereihin vielä yhtenä esimerkkinä perinteisestä valkosoluesteraasiaktiivisuuden väriä synnyttävästä substraatista. Kuten Janoff- ja Sweetman-viitteissä myös Boehringer-patenttijulkaisussa esitetään proteaasien 35 ja esteraasin esterolyyttinen samanarvoisuus.

4 78926

Valkosolujen määrittämisen suhteen tunnetaan ennestään myös valkosolujyvästen peroksidaasiaktilvisuus (US-patenttijulkaisu 3 087 794). Tällainen lähestymistapa ei kuitenkaan pysty erottamaan valkosolua ja hemoglobiinia 5 eikä näin ollen voida sanoa osoittaako positiivinen testi valko- vai punasoluja.

Kaupallisesti on lisäksi saatavissa tuote, joka tunnetaan nimellä "Cutyrtest", jossa käytetään N-tosyyli-alaniini-indoksyyliesteriä, johon edellä viitattiin. Tämä 10 tuote käsittää suodatinpaperityynyn, joka on kyllästetty aminohappoindoksyyliesterillä. Tyyny on kiinnitetty muovi-liuskaan. Kun se kastetaan valkosoluja sisältävään virtsanäytteeseen, ilmestyy suodatinpaperityynyyn väri, mikä johtuu indigon muodostumisesta. Tällä testillä on kuiten-15 kin se haitta, että siihen liittyy huomattavan pitkä odotusaika (noin 15 minuuttia) ennen kuin testituloksia voidaan arvioida.

Siten, vaikka väriä synnyttävien esteraasisubst-raattien käyttö on tekniikan tasolla hyvin vakiintunut, 20 ja huolimatta esteraasiaffiniteetista indoksyylialaninaat-tia ja peptidaattia kohtaan, ei ole olemassa luotettavaa pikatestiä virtsan valkosolujen määrittämistä varten. Esillä oleva keksintö kohdistuu tämän ongelman ratkaisemiseen.

25 Tutkimus- ja kehitysponnistelujen yhteydessä kek sittiin, että oli mahdollista aikaansaada varsin helppo testi virtsan valkosolujen toteamiseksi; testaamiseen kuluu 3-4 minuuttia tai vähemmän, ja näin poistetaan eräs tunnettujen menetelmien vakava haitta.

30 Lyhyesti esitettynä tämä keksintö käsittää yhdis telmän, koevälineen ja menetelmän esteraasiaktiivisuuden määrittämiseksi testinäytteestä. Yhdistelmä sisältää väriä synnyttävän esterin, jolla on kaava 35 R-O-R' 5 78926 jossa R on osa, joka saa aikaan havaittavan vasteen, kun esteri pilkkoutuu esteraasi- tai esteraasin kaltaisen esterolyyttisen reaktion vaikutuksesta, ja R' on aminohap-5 po- tai peptidiosa, jossa on typpisuojaryhmä.

Yhdistelmälle on tunnusomaista, että se lisäksi sisältää 3-kinuklidinolia. Koeväline käsittää kanninmat-riisin, johon yhdistelmä on yhdistetty. Menetelmä käsittää koevälineen saattamisen kosketukseen nestemäisen testi-10 näytteen kanssa ja havaittavan vasteen havaitsemisen kan-ninmatriisista.

Tässä käytetyillä käsitteillä "esteraasiaktiivi-suus", "väriä synnyttävä esteri", "havaittava vaste" ja "esteraasi- tai esteraasin kaltainen reaktio" sekä "este-15 rolyyttinen reaktio" on seuraavassa määritelty merkitys: "Esteraasiaktiivisuus" tarkoittaa testinäytteen laatua, jossa näyte käyttäytyy kuten esteraasientsyymi. Siten esteraasiaktiivisuuden läsnäolo testinäytteessä käy ilmi siitä, että näyte pystyy pilkkomaan väriä synnyttä-20 vän, jäljempänä määritellyn esterisubstraatin tavalla, joka myös määritetään jäljempänä.

"Väriä synnyttävä esteri" tarkoittaa esteriä, jolla on tässä määritelty rakenne, jossa yksi esterolyyttisen pilkonnan tuotteista, nimittäin tällaisen pilkonnan alko-25 holitähde, pystyy antamaan havaittavan vasteen, joko itsessään tai lisäreaktion välityksellä.

Käsitteellä "havaittava vaste" tarkoitetaan muutosta ulkonäössä tai fysikaalisessa parametrissä, jonka ihminen voi aistia tai joka voidaan havaita jollakin lait-30 teella. Siten havaittava vaste voi olla näkyvän värin ilmestyminen tai muutos edellä esitetyn koevälineen kan-ninmatriisissa tai liuoksessa, johon yhdistelmä on liuotettu tai suspendoitu. Vaste voi myös olla muutos kannin-matriisin absorboiman tai heijastaman valon määrässä. 35 Kanninmatriisi voidaan analysoida esimerkiksi käyttämällä _ 78926 o heijastusmittaria tai spektrofotometriä. Mitattu heijastunut tai absorboitunut valo voi olla laajalta aallonpituusalueelta, infrapunasta ultraviolettiin. Vaihtoehtoisesti havaittava vaste voi ilmetä kerniluminesenssinä.

5 Voidaan havaita, että väriä synnyttävän esterin alkoholi-osan R valinnasta riippuen tämän keksinnön avulla mahdollistetaan suuri joukko erilaisia havaittavia vasteita ja vasteiden laatu- ja astevaihtelu on todella laaja.

Käsitteet "esteraasireaktio", "esteraasin kaltainen 10 reaktio" ja "esterolyyttinen reaktio" tarkoittavat mitä tahansa reaktiota, jolla katalysoidaan väriä synnyttävän esterin pilkkoutumista alkoholi- ja asyylikomponenteiksi riippumatta siitä, johtuuko tällainen katalyysi esteraasin läsnäolosta vai onko se jonkin muun komponentin aiheut-15 tama, jolla on esteraasiaktiivisuutta.

Yhdistelmän "väriä synnyttävää esteriä" luonnehditaan kahdella yleisellä arvosteluperusteella: alkoholi-osalla R, joka saa aikaan havaittavan vasteen, kun esteri saippuoidaan tai pilkotaan esterolyyttisesti, ja asyyli-20 osalla R', joka on aminohappo- tai peptiditähde, jolloin aminoryhmä on substituoitu typpisuojaryhmällä. Tyypillisesti R tarkoittaa sellaisia kromogeenejä kuin indoksyyli (3-hydroksi-indoli) ja tioindoksyyli ja niiden johdannaisia, samoin kuin p-nitrofenolia ja p(β-nitrovinyyli)feno-25 lia. Substituoituja ja substituoimattomia indoksyyli- ja tioindoksyyliosia on selostettu GB-patenttijulkaisussa 1 128 371 ja US-patentti julkaisussa 4 278 763, joihin molempiin tässä viitataan.

Esterin asyyliosa, ts. aminohappo- tai peptiditäh-30 de, on myös haluttu määritellä laajasti. Siten aminohappotähde on jokin a-aminohapoista L- tai D-muodossa. Erityisen edullinen on L-alaniini, mutta edullisia ovat myös glysiini, väliini, leusiini, isoleusiini, fenyylialaniini ja tyrosiini. Kaikki vapaat hydroksyyliryhmät ovat edul-35 lisesti asyloituja.

7 78926

Jos R' on peptidi, tämä keksintö kohdistuu pepti-deihin, jotka koostuvat noin 1-5 aminohaposta. Edullisia ovat edellä mainittujen aminohappojen di- ja tripeptidit.

N-suojaryhmät, joita tavanomaisesti käytetään pep-5 tidikemiassa, sekä myös muita on sisällytetty tähän käsitteenä "typpisuojaryhmä". Tällaisia ryhmiä ovat esim. asyy-li, oksikarbonyyli, tiokarbonyyli, sulfonyyli, sulfenyy-li, vinyyli, sykloheksenyyli, fosforyyli tai karbonyyli.

Siten tämän keksinnön mukainen yhdistelmä sisältää 10 väriä synnyttävän esterin lisäksi 3-kinuklidinolia. On havaittu, että jälkimmäisen yhdisteen sisällyttäminen lyhentää voimakkaasti väriä synnyttävän esterin pilkkou-tumisreaktioaikaa esteraasiaktiivisuutta sisältävän näytteen vaikutuksesta. Sisällyttämällä 3-kinuklidinoli yhdis-15 telmään osoitusajat lyhenevät moninkertaisesti; ilman tätä yhdistettä aika on 15 minuuttia ja kun tämä yhdiste on läsnä yhdessä väriä synnyttävän esterin kanssa, aika on vain 2-3 minuuttia.

3-kinuklidinolin systemaattinen nimi on 1-atsabi-20 syklo£2,2,2/oktan-3-oli, ja sen rakennekaava on:

OH

25 Se esiintyy optisesti aktiivisissa isomeerimuodois- sa, joista jokaisella on erilaiset fysikaaliset ominaisuudet. dl-muoto voidaan kiteyttää asetonista tai bentseenis-tä, jolloin saadaan kiteitä, jotka sulavat 225 - 227°C:ssa ja jotka härmistyvät 120°C:ssa ja 20 mmHg:ssa. 1-isomeeri 30 muodostaa prismoja, jotka sulavat 220 - 222°C:ssa. Yhdistettä on käytetty sellaisenaan tai jonakin johdannaisenaan hypotensiivisenä lääkeaineena. Ks. "Merck Index", 9. painos, sivu 1052, Entry No. (rekisteröintinumero) 7905, Merck & Co. Inc., Rahway, New Jersey (1976). Sen on il-35 moitettu olevan käyttökelpoinen myös β-ketoestereiden 8 78926 pilkoiltaan. Ks. Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin (1981 - 1982).

Vaikka yhdistelmässä läsnäolevan, väriä synnyttävän esterin ja 3-kinuklidinolin vastaavia määriä ei pidetä 5 ratkaisevina, on havaittu edulliseksi, että niitä on läsnä esteri/3-kinuklidinoli-moolisuhteessa väliltä 1:5 - 100. Erityisen hyödylliseksi on havaittu käyttää yhdistelmää, jossa moolisuhde on 1:30 - 75.

Edellä mainittujen aineosien lisäksi yhdistelmä 10 voi sisältää myös alkoholia, jossa on 1 - 20 hiiliatomia. Edullinen on alkoholi, jossa on 8 - 12 hiiliatomia. Esimerkkinä tällaisista alkoholeista, joita voidaan sisällyttää yhdistelmään ja joiden on havaittu olevan erityisen edullisia, voidaan mainita mikä tahansa dekanolin isomee-15 ri, erityisesti n-dekanoli.

Tämän keksinnön mukainen koeväline käsittää kannin-matriisin, johon yhdistelmä on yhdistetty, jolloin saadaan aikaan väline valkosolujen tai muun esteraasiaktiivisuus-lähteen läsnäolon nopeaan, luotettavaan määrittämiseen 20 testinäytteestä. Kanninmatriisi on tavallisesti (mutta ei välttämättä) huokoista ainetta, kuten suodatinpaperia. Muita alalla tunnettuja kanninmatriisiainemuotoja ovat huopa, huokoiset keraamiset liuskat ja kudotut tai huovi-tetut lasikuidut (US-patenttijulkaisu 3 846 247). On myös 25 ehdotettu käytettäväksi puuta, kangasta, sieniainesta ja savipitoisia aineita (US-patenttijulkaisu 3 552 928).

Kaikki tällaiset kanninmatriisiaineet ovat sopivia käytettäviksi tässä keksinnössä, mutta muitakin voidaan käyttää. On havaittu, että suodatinpaperi on erityisen sopiva.

30 Eräässä edullisessa suoritusmuodossa suodatinpaperi kastellaan 3-kinuklidinolin liuoksella tai liuoksen suspensiolla vesipitoisessa puskurissa (pH noin 8,5) tai muussa sopivassa liuottimessa, joka on helposti määritettävissä laboratoriorutiinikokein, ja kuivataan sitten. 35 Kuivattuun suodatinpaperiin lisätään sen jälkeen väriä 9 78926 synnyttävän esterin liuos. Yleensä esteriliuos on orgaanisessa liuottimessa, kuten asetonissa. Muita käytettäviksi sopivia liuottimia ovat metanoli, etanoli, N,N-dime-tyyliformamidi ja dimetyylisulfoksidi. Esteriliuoksella 5 kyllästämisen jälkeen suodatinpaperi kuivataan koevälineen saamiseksi, joka on herkkä valkosolujen tai muun esteraa-siaktiivisuuslähteen läsnäololle.

Kuivattu, reagenssia sisältävä kanninmatriisi voidaan haluttaessa kiinnittää tukiainekseen. Siten koeväli-10 neen edullinen suoritusmuoto käsittää suodatinpaperikan-ninmatriisin, johon yhdistelmä on yhdistetty kuten edellä on selostettu, jolloin matriisi on kiinnitetty pitkänomaisen läpinäkyvän polystyreenikalvon kappaleen toiselle puolelle. Matriisi on kiinnitetty kalvon toiseen päähän 15 jollakin sopivalla tavalla, kuten kaksipuolisella teipillä (Double Sticl^,jota toimittaa 3M Company) jolloin polystyreenikalvon toinen pää toimii vartena. Käytössä tällaista välinettä pidellään polystyreenikalvotukiaineen vapaasta päästä ja matriisipää upotetaan testinäytteeseen 20 (esim. virtsaan) ja poistetaan nopeasti. Värin muutos tai muu havaittava vaste havaitaan ennalta määrätyn ajan kuluttua ja sitä verrataan vertailustandardiin, joka vastaa vasteita valkosolujen tai muun analyysin, jolla on este-raasiaktiivisuus, tunnettuihin väkevyyksiin. On havaittu, 25 että 1-3 minuutin inkubointiaika on riittävä reagenssia sisältävän suodatinpaperin värin kehittymiselle.

Tämän keksinnön edellä mainittuja ja muita suoritusmuotoja valaistaan viittaamalla seuraaviin esimerkkeihin.

30 Esimerkki 1 - Vertailukoeväline

Kokeeksi valmistettiin valkosolujen läsnäolon määrittämiseen nestemäisestä testinäytteestä käyttökelpoinen koeväline. Yleisesti koeväline käsitti neliön muotoisen palan suodatinpaperia (sivun pituus n. 0,2 cm), joka oli 35 kyllästetty väriä synnyttävällä esterillä, indoksyyli-N- 10 78926 tosyylialaninaatilla ja n-dekanolilla. Suodatinpaperin palanen kastettiin peräkkäin kumpaankin kahdesta kasto-liuoksesta ja paperi kuivattiin kummankin kastamisen jälkeen. Syntynyt kuivattu, reagenssia sisältävä paperi lei-5 kattiin 0,2 tuuman neliöiksi, joista toinen kiinnitettiin pitkulaisen polystyreeniliuskan, jonka mitat olivat noin 4 x 0,2 tuumaa, päähän. Tartunta paperin ja muovin välillä aikaansaatiin käyttämällä kaksipuolista teippiä, joka tunnetaan nimellä Double Stictf^, valmistaja 3M Company.

10 Ensimmäinen kastoliuos oli boraattipuskuriliuos, johon lisättiin anionista pesuainetta (Bio-Terge AS-40) ja kaliumboraattia. Boraattipuskuri (pH 8,6) valmistettiin lisäämällä 4,5 ml 0,2 M boorihappoliuosta 5,5 ml:aan 0,05 M booraksiliuosta, kaikki tislatussa vedessä. Tähän 15 liuokseen lisättiin riittävä määrä Bio-Terge AS-40 (anio-ninen pesuaine, valmistaja Stepan Chemical CO.) antamaan 0,2 ml: n liuos desilitraa kohti. Saatu liuos tehtiin 10 mM:ksi (millimooliseksi) kaliumbromaatissa.

Palanen Eaton and Dikeman 205-suodatinpaperia kas-20 tettiin lyhyen aikaa ensimmäiseen kastoliuokseen ja kuivattiin kuivatusuunissa 100C:ssa 20 minuutin ajan.

Toinen kastoliuos oli asetoniliuos, jossa oli po-lyvinyylipyrrolidonia, n-dekanolia, kiniinihydrokloridia ja 3-(N-tosyyli-L-alanyyli-oksi)indolia. Liuenneiden ai-25 neiden pitoisuudet olivat seuraavat: 1 ml/dl polyvinyylipyrrolidonia metanolissa (Luviskol, jota toimittaa GAF Corporation) 2 ml/dl n-dekanolia 10 mM kiniinihydrokloridia ja 30 2 mM 3-(N-tosyyli-L-alanyyli-oksi)indolia.

Ensimmäisen kaston jälkeen kuivattu suodatinpaperi kastettiin toiseen kastoliuokseen ja kuivattiin kuivatus-uunissa 60°C:ssa 5 minuutin ajan. 0,2 tuuman neliömäinen kappale kuivattua paperia kiinnitettiin polystyreenilius-35 kaan kuten edellä on selostettu.

11 78926

Koevälineen valkosolujen mittaamistehokkuuden testaamiseksi valmistettiin tekovirtsaliuos, joka sisälsi tunnetun pitoisuuden valkosoluja, ja se pakastettiin sen jälkeen, kun sitä oli käytetty testiliuskan arvioimiseen.

5 Annos tätä tekovirtsaa sulatettiin; sen valkosolupitoisuus oli 3,3 valkosolua/mikrolitra (μΐ). Yksi koevälineistä kastettiin tähän testinäytteeseen hetkellisesti, poistettiin ja annettiin inkuboitua. 14 minuutin kuluttua liuskaan oli kehittynyt riittävästi väriä positiivisen testin 10 havaitsemiseksi.

Esimerkki 2 - 3-kinuklidinolin vaikutus

Testattiin kokeellisesti 3-kinuklidinoliyhdisteen vaikutusta esimerkin 1 mukaisen liuskan suorituskykyyn. Tällöin seurattiin esimerkin 1 menettelyä paitsi, että 15 ensimmäinen kastoliuos tehtiin 50 mM:ksi 3-kinuklidinolin suhteen ja 10 mM kaliumferrosyanidin suhteen (bromaatin asemesta). Suodatinpaperin kuivaaminen ensimmäisen kastamisen jälkeen suoritettiin 80°C:ssa 25 minuutin aikana. Myös toinen kastoliuos sisälsi 0,2 ml/dl n-dekanolia, 1,5 20 ml/dl polyvinyylipyrrolidonia ja 1,5 mM 3-(n-tosyyli-L-alanyyli-oksi)indolia.

Kinuklidinolia sisältävän koevälineen suorituskyvyn arvioimiseksi käytettiin esimerkissä 1 käytettyä tekovirt-saliuosta. Koeväline kastettiin virtsaliuokseen ja sen 25 annettiin inkuboitua. 4 minuutin kuluttua reagenssilius-kassa oli kehittynyt riittävästi väriä osoittamaan valkosolujen läsnäolon tekovirtsanäytteissä.

Esimerkki 3 - Edullinen suoritusmuoto

Suoritettiin koe esimerkin 2 tulosten edelleen 30 parantamiseksi. Koevälineen valmistuksessa seurattiin esimerkin 1 menettelyä seuraavassa esitetyin poikkeuksin.

Ensimmäinen kastoliuos oli pyrofosfaattipuskuri, jonka pH oli 8,6. Tämä saatiin valmistamalla 0,2 M nat-riumpyrofosfaatti (Na4P207 )-liuos tislattuun veteen ja 35 lisäämällä hitaasti riittävästi metafosforihapon ^ThP03 )nJ

i2 78926 kiteitä, kunnes syntyneen liuoksen pH oli 8,6. Tähän liuokseen lisättiin riittävä määrä Bio-Terge AS-40:tä antamaan 0,2 ml/dl liuos. Seuraavaksi liuos tehtiin 10 mM:ksi kaliumferrosyanidin suhteen ja 50 mM:ksi 3-5 kinuklidinolin suhteen.

Kappale Eaton and Dikeman-suodatinpaperia kasteltiin ensimmäiseen kastoiluokseen, poistettiin ja kuivattiin 80°C:ssa 35 minuuttia.

Toinen kastoliuos valmistettiin asetoniin. Se 10 sisälsi 0,2 ml/dl n-dekanolia, 2,0 ml/dl polyvinyylipyr-rolidonia metanolissa (Luviskol) ja 1 mM 3-(N-tosyyli-L-alanyyli-oksi)indolia.

Ensimmäisen kaston jälkeen kuivattu suodatinpaperi kastettiin toiseen kastoiiuokseen, poistettiin ja kuivat-15 tiin 60°C:ssa 7 minuuttia. Syntyneen kantomatrlisin 0,2 tuuman neliömäinen palanen kiinnitettiin polystyreenilius-kaan koevälineen saamiseksi kuten esimerkissä 1.

Koeväline testattiin käyttäen kolmea tekovirtsa-näytettä, joista jokaisen ominaispaino oli 1,010 ja jotka 20 sisälsivät vastaavasti 0, 8,3 ja 25 liuskatumaista valkosolua mikrolitraa kohti (ΡΜΝ/μΙ). Näitä liuoksia nimitettiin vastaavasti "negatiivisiksi", jälkiä sisältäviksi" ja "positiivisiksi". Kuusi henkilöä, jotka olivat kokeneita "kasta ja lue"-koevälineiden tulkinnassa, tutki koevä-25 lineet. Havaitsijoiden puolueettomuuden varmistamiseksi tekovirtsanäytteet eivät olleet merkittyjä. Jokainen havaitsija kastoi hetkellisesti koevälineen virtsanäytteeseen, poisti sen ja teki havaintonsa 1, 2 ja 3 minuutin inkubointiaikojen jälkeen.

30 Valmistettiin tutkimuksessa käytettävä värikartta koevälineeseen kehittyneen värin vertailua varten, joka kartta oli valmistettu etukäteen ja vastasi negatiivista, pienten määrien (8,3 ΡΜΝ/μΙ) ja positiivista tulosta (25 ΡΜΝ/μΙ) vastaavasti. Siten 3 tässä valmistettua koe-35 välinettä kastettiin kukin yhteen kolmesta virtsanäyttees- 13 78926 tä, jotka olivat negatiivisia, sisälsivät pieniä määriä valkosoluja ja olivat positiivisia valkosolujen suhteen. Annettiin inkuboitua 2 minuuttia minkä jälkeen väri arvioitiin. Sitten valmistettiin väriryhmiä, jotka vastasi-5 vat koevälineisiin 2 minuutin jälkeen kehittynyttä väriä.

Jokaiselle väriryhmälle annettiin mielivaltainen numero: 10 = negatiivinen, 20 = jälkiä sisältävä ja 30 = positiivinen. Kuutta sokeaan kokeeseen osallistunutta henkilöä pyydettiin lukemaan jokainen liuska 1, 2 ja 3 10 minuutin välein kastamisen ja poistamisen jälkeen nimenomaisesta tekovirtsanäytteestä. Jokainen henkilö arvioi lukuarvon värin kehittymiselle jokaiselle aikavälille ja jokaiselle virtsanäytteelle. Tulokset olivat seuraavat:

Valkosolupatoisuudet 15 Aika Nega- Pienet Posi- (minuut- tiivinen määrät tiivinen teia) (10)_(20)_(30) 1 10,0 13,8 22,3 2 10,0 19,6 29,6 20 3 10,1 23,8 31,0

Lukuarvot osoittavat värierot eri valkosolupitoi-suuksien välillä 1 minuutin kohdalla, 2 minuutin kohdalla erot ovat erinomaiset.

Claims (9)

1. Yhdistelmä esteraasiaktiivisuuden läsnäolon määrittämiseksi nestemäisestä testinäytteestä, joka yhdis-5 telmä sisältää väriä synnyttävän esterin, jolla on kaava R-O-R' jossa R on osa, joka saa aikaan havaittavan vasteen, kun 10 esteri pilkkoutuu esteraasi- tai esteraasin kaltaisen esterolyyttisen reaktion vaikutuksesta, ja R’ on aminohappo- tai peptidiosa, jossa on typpisuojaryhmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä lisäksi sisältää 3-kinuklidinolia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä, tunnettu siitä, että R on indoksyyli tai tio-indoksyyli, edullisesti indoksyyli.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä, tunnettu siitä, että R' on aminohappotähde.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä, tunnettu siitä, että R' on peptiditähde.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä, tunnettu siitä, että R' on N-tosyylialaninaatti.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä, 25 tunnettu siitä, että väriä synnyttävä esteri on indoksyyli-N-tosyylialaninaatti.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen yhdistelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä sisältää lisäksi alkoholin, jossa on 1 - 20 hiiliatomia.

8. Koeväline esteraasiaktiivisuuden läsnäolon mää rittämiseksi nestemäisessä testinäytteessä, tunnettu siitä, että se käsittää kanninmatriisin, johon on yhdistetty jonkin vaatimuksen 1-7 mukainen yhdistelmä.

9. Menetelmä esteraasiaktiivisuuden läsnäolon mää- 35 rittämiseksi nestemäisessä testinäytteessä, tunnet- is 78926 t u siitä, että se käsittää vaiheet, joissa testinäyte saatetaan kosketukseen vaatimuksen 8 mukaisen koevälineen kanssa ja havaittava vaste havaitaan kanninmatriisista. i6 78926