NO164201B - Reagens for spektrofotometrisk bestemmelse av tilstedevaerelsen av leukocytter, esterase eller protease i en proeve, forsoeksinnretning omfattende denne og fremgangsmaate til bestemmelse av tilstedevaerelsen av de nevnte stoffene. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører reagens for spektrofotometrisk bestemmelse av tilstedeværelsen av leuko-

cytter, esterase eller protease i en prøve, forsøksinnret-ning omfattende denne og fremgangsmåte til bestemmelse av tilstedeværelsen av de nevnte stoffene. Oppfinnelsen er spesielt nyttig ved deteksjon av leukocyttnivåer i kroppsvæsker som f.eks. urin, og reduserer det laboratoriearbeid som er nødvendig ved en slik analyse fra en arbeidskrevende telleprosedyre som var påkrevet ved mikroskopundersøkelse til en rask, enkel neddyppings- og avlesningsprosedyre.

Nærværet av et abnormalt høyt nivå av leukocytter i en pasients urin er en mulig indikasjon på slike patologiske tilstander som nyreinfeksjon eller infeksjon i urogenital-trakten eller andre dysfunksjoner. Nøyaktig informasjon om leukocyttnivået i urinen kan følgelig være et verdifullt hjelpemiddel for legen ved diagnose og behandling av slike sykdomstilstander.

Tradisjonelt har man innen medisinen anvendt visuelle bestem-melsesteknikker for å telle leukocyttpopulasjonen i urinsedi-menter eller usentrifugert urin, dette er en fremgangsmåte som krever dyrt urstyr som f.eks. sentrifuge og mikroskop, samtidig som den er uforholdsmessig tidkrevende for legen. Videre er de tradisjonelle fremgangsmåtene beheftet med

den ulempen at bare intakte celler bestemmes. Leukocytter som finnes i urinsveissystemet utsettes for betingelser som kan fremme omfattende celle-lysering. F.eks. er det kjent at i urin med unormalt høy pH, kan leukocytthalveringstiden være så lav som 60 minutter. Siden lyserte celler unnslipper detektering ved visuell bestemmelse, kan dette resultere i. feilaktige lave bestemmelser og falske negative resultater.

Av de to teknikkene til mikroskopisk leukocyttanalyse - urinsediment og usentrifugert, homogenisert urin - er den førstnevnte klart den mest ønskelige. Selv om pålitelige resultater kan oppnås ved den sistnevnte fremgangsmåten,

er urinsedimentanalyse den fremgangsmåten som benyttes

i de aller fleste tilfeller. Det krever at urinprøven sentrifugeres, og sedimentet isoleres og underkastes mikroskopisk undersøkelse. Ved analysen telles så antall leukocytter som trer frem i synsfeltet. Denne oppgaven kompliseres ytterligere ved nærværet av andre urinkomponenter i sedimentet, som f.eks. epitelceller og saltpartikler. Det varierende innholdet av sedimentbestanddeler, sammen med andre kompli-serende faktorer innbefattet inhomogenitet i prøven og forskjellig optisk oppløsningsevne for forskjellig mikroskop-utstyr, kan føre til svært store feil i den endelige bestemmel-sen.

Det er følgelig klart at en rask, enkel fremgangsmåte til leukocyttbestemmélse, en fremgangsmåte som eliminerer behovet for tidkrevende teknikker, samt dyrt utstyr, og som kan tilveiebringe nøyaktige responser på esterase, protease eller leukocyttceller, uavhengig av om cellene er intakte eller lyserte ville utgjøre et stort fremskritt sammenlignet med teknikkens nåværende stand. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et slikt fremskritt. Videre er den basert,

ikke på evnen til å se leukocytter, men på den enzymatiske aktiviteten de oppviser, og den er derfor i det vesentlige fri for de unøyaktighetene som er beskrevet ovenfor.

Før foreliggende oppfinnelse innbefattet fremgangsmåten

for bestemmelse av hydrolytiske bestanddeler kromogene estere som, når de ble hydrolysert av esterase eller protease, ga et farget alkoholisk produkt, hvor den intakte esteren hadde en annen farge enn den frie alkoholen. Mange av disse systemene innbefattet akseleratorforbindelser og koplingsmidler,i form av diazondumsalt.

Det eksisterer følgelig innen kjent teknikk en rekke referanser som beskriver anvendelsen av disse estere som, når de spaltes ved enzymatisk aktivitet, resulterer i dannelsen av farge eller andre detekterbare species. Britisk patent nr. 1.128.371 beskriver anvendelsen av indoksyl- og tioindoksylestere som nyttige kromogene forbindelser ved deteksjon av hydrolytiske enzymer i kroppsvæsker. Enzymene spalter esteren slik at det genereres fri indoksyl som deretter oksyderes slik at. det dimere produktet indigo dannes, dette er et lett observerbart blått fargestoff. Slik aktivitet tilskrives, blant andre enzymer, cholinesterase. I dette patentet beskrives også at i tillegg til indoksyldelen av estersubstratet, velges syreradikalet med spesiell refe-ranse til det enzymet som skal detekteres. F.eks. angis det at syreradikalet kan være acetat, laurat eller sterat for deteksjon av henholdsvis esterase eller lipase. For deteksjon av enzymer som f.eks. fosfatase eller sulfatase kan acylradikalet være uorganisk. Det britiske patentet beskriver følgelig anvendelsen av kromogene estere som substrat for bestemmelse av esterolytiske enzymer, slike estere innbefatter indoksyl eller tioindoksyl som den alkoho-liske delen av esteren, acyldelen velges med tanke på det spesielle enzymet som skal bestemmes.

Betydningen av omhyggelig utvelgelse av acylradikalet eksem-plifiseres ikke noe sted så klart som i to referanser som beskriver esterasespesifisitet for estere hvor acylradikalet innbefatter en N-beskyttet aminosyre eller peptid. Janoff, et al., Proe. Soc. Exper. Biol. Méd. 136:104 5-1049 (1971) beskriver at alaninestere er spesifikke substrater for esterase fra menneskelige leukocytter. Nærmere bestemt beskriver denne referansen at et ekstrakt av menneskelige leukocyttpartikler er i stand til å hydrolysere N-acetyl— L-alanyl-L-alanyl-L-alanin-metylester. Videre ble L-alanin-p-nitrofenylester på tilsvarende måte hydrolysert slik at man fikk den gule p-nitrofenol-fargeformen.

Videre beskriver Sweetman et al., Jour. Hist. Soc, 22 :327-339 anvendelsen av 1-naftyl-N-acetyl-DL-alanin, 1-naftyl-N-acetyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alanin og 1-naftyl-butyrat

for å demonstrere nærværet av esterase.

I US patent nr. 4.278.763 kom man ved å kombinere disse beskrivelsene, frem til indoksyl- eller tioindoksylestere av aminosyrer eller peptider som nok et eksempel på et tradisjonelt klorogent substrat for leukocyttesterase-aktivitet. I likhet med Janoff og Sweetman beskrives i det nevnte patentet ekvivalensen mellom protease og esterase når det gjelder esterolytisk tilbøyelighet.

Det er kjent at esterhydrolysereaksjoner kan aktiveres

ved nærværet av mange nukleofile midler, innbefattet en lang rekke alkoholer. Følgelig økes hastigheten for hydrolyse av fenylacetat og p-nitrofenylacetat ved esterase med en faktor på 2,5 til 5,5 ved tilsats av metanol eller butanol,

se Greenzaid og Jencks, Biochemistry, 10(7), 1210-1222

(1971). Videre øker denne effekten med lengden av n-alkyl-gruppen, se Wynne og Shalatin, Eur. J. Biochem., 31:554-

560 (1972).

Spesielt har denne aktiverende effekten av alkoholer vært observert med estere av aminosyrer, p-nitrofenyl-N-acetyl-L-alaninat-hydrolyse aktiveres .(akselereres) ved nærværet

av metanol, se Fastrez og Fersht, Biochemistry, 12(11), 2025-2034 (1973). Alkoholer av høy molekylvekt øker hastigheten for esterase-indusert hydrolyse av p-nitrofenyl-t-BOC-L-tyrosinat, se Ashe og Zimmermann, Biochem. og Biophys. Res. Comm., 75(1), 194-199 (1977). I US patent nr. 4.299.917 beskrives andre kjente esterhydrolyse-aktivatorer som f.eks. visse metallkomplekser, pyridinderivater og imidazoler.

Videre er anvendelsen av visse diazoniumsalter for tilkopling til fenoler og pseudofenoler slik at det dannes azofargestof-fer kjent, se Martinet og Donier, Compt. Rend., 170, 592

(1920). En slik teknikk benyttes i en esterase-analyse hvorved indoksylestere hydrolyseres via esterase slik at det dannes indoksyl, som i sin tur koples med et diazoniumsalt slik atdet .'tilsvarende azof argestof f et dannes, se Holt og Hiéks,,Jl>Cell. Biol. 29, 261-366 (1966); Gossrau, Histochemis.try; 57, 323-342 ( 1978 ); og DE-OS 30 17 721.

Diazoniumsaltene som er kjent for bruk som koplingsmidler

i en sammensetning for deteksjon av leukocytter, esterase eller protease bygger på et eksogent anion som motpart for diazo-kationet. Videre er alle de løsningene som hittil er diskutert, i alle fall i noen grad, beheftet med interferens eller unøyaktighet som skyldes nærværet av fenoliske, eller andre, forbindelser som er tilstede i prøven som kan reagere med diazoniumsaltet. Slik interferens kan gi falske negative analyser.

For å oppsummere den teknologiske utviklingen som fører

frem til foreliggende oppfinnelse, er flere fremgangsmåter for analyse av hydrolytiske enzymer og leukocyttceller i oppløsning kjent. For bestemmelse av leukocyttpopulasjoner, f.eks. i urin, har mikroskopi lenge vært den foretrukne fremgangsmåten. Dette krever at laboratoriepersonalet lager et mikroskop-preparat av en urinprøve og teller antallet leukocytter i synsfeltet i et mikroskop; dette er en fremgangsmåte som krever svært lang tid og dyrt utstyr som f.eks. mikroskop og sentrifuge.

Kjemiske og biokjemiske fremgangsmåter vinner nå raskt

frem på bekostning av mikroskopi for diagnostisk analyse av leukocytter, og disse er tidsbesparende hjelpemidler i et forsøkslaboratorium. Kromogene estere som har utgjort hjørnestenen for kjemiske analyser innbefatter følgende alkohol- og acyldeler:

Kjemikalier som benytter slike estere har som hjelpemidler inneholdt forskjellige hydrolyse-akseleratorer, så vel som koplingsmidler i form av diazoniumsalt. Som akseleratorer har mange alkanoler vært benyttet, det har også visse metallkomplekser, pyridinderivater og imidazoler. Dia2onium-kationer som har egnede eksogene anion ionisk bundet eller tilknyttet er velkjente som koplingsmidler for slike kjemikalier, hvorved alkoholen (fenolen) som dannes ved hydrolyse av esteren koples med diazoniumsaltet slik at det dannes et azo-fargestoff. Det er imidlertid også kjent at falske negative, eller feilaktig lave analyseresultater kan oppstå ved interferens mellom diazoniumsaltet og fenoler og andre forbindelser i prøven som reageres med diazoniumsaltet.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en forsøksreagens,

en innretning og en fremgangsmåte for bestemmelse av nærværet av leukocytter, esterase eller protease i en prøve.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig en reagens for spektrofotometrisk bestemmelse av tilstedeværelsen av leukocytter, esterase eller protease i en prøve som er kjennetegnet ved at den innbefatter en ester bestående av en aromatisk fenol eller pseudoaromatisk fenol som er i stand til å hydrolyseres katalytisk i nærvær av leukocytter, esterase eller protease slik at det oppstår en fenol som kan koples med et. diazo-dobbeltion, og et diazoniumsalt som har strukturen

hvor A er et anion og R som kan være like eller forskjellige er H, laverealkyl, aryl, eller begge R kan sammen danne et kondensert ringsystem, og hvor R' er H, OH eller laverealkyl, og eventuelt en akselerator.

Videre tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en forsøks-innretning som innbefatter en bærermatriks inkorporert med den ovenfor omtalte reagensen.

Endelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte til bestemmelse av tilstedeværelsen av leukocytter, esterase eller protease i en prøve som omfatter at prøven bringes i kontakt med den ovenfor omtalte forsøksinnret-ningen og det observeres en detekterbar respons.

Visse betegnelser som benyttes i foreliggende beskrivelse bør klargjøres for å sikre at deres respektive betydning ikke misforstås. Følgende definisjoner er tilveiebragt for å klargjøre omfanget av foreliggende oppfinnelse, og for å muliggjøre dens utførelse og anvendelse.

Uttrykkene "N-blokkert-aminosyreresidu" og "N-blokkert-peptidresidu" krever definisjon av to grunner. "N-blokkert" refererer til kjemien for aminogruppen av en aminosyre eller et peptid hvorved et hydrogen bundet til nitrogenatomet er erstattet av en beskyttende gruppe som f.eks. acetyl, p-toluensulfonyl (tosyl) og tert-butyloksykarbonyl (t-BOC)

og andre velkjente N-beskyttende grupper.

Ved uttrykket "aminosyreresidu" og "peptidresidu" forstås

et aminosyre- eller peptidmolekyl uten -0H i dets karboksyl-gruppe.

Ved uttrykket "aryl" forstås et hvilket som helst ringsystem som inneholder aromatisitet. Innbefattet i uttrykket er slike 5- og 6-leddede ringer som pyrrol, fenyl og pyridyl,

så vel som kondenserte ringsystemer som f.eks. naftyl.

Dvs. at det aromatiske ringsystemet kan være heterocyklisk eller homocyklisk, og kan være substituert eller usubstituert, forutsatt at subsituentgruppene ikke påvirker reagensens evne til å hydrolyseres i nærvær av leukocyttceller, esterase eller protease. Valg av slike substituenter er, med utgangs-punkt i foreliggende oppfinnelse,, en rutinemessig laboratorie-oppgave.

Uttrykket "laverealkyl", slik det benyttes i foreliggende oppfinnelse, er en alkylenhet som inneholder 1-6 karbonatomer. Innbefattet i betydningen av laverealkyl er metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sek-butyl, tert-butyl og alle isomerer av pentyl og heksyl. Disse kan være usubsti-tuerte, eller de kan være substituerte forutsatt at de ikke påvirker reagensens eller forsøksinnretningens evne til å detektere leukocyttceller, esterase eller protease.

Under betegnelsen "egnet bufferstoff" forstås en buffer

som, når den bringes i kontakt med en vandig prøve, vil tilveiebringe en resulterende pH på minst 7. Fortrinnsvis er bufferen i stand til å produsere en pH i området fra

7 til 10 og, optimalt, 8,5-9,0. Borsyre-NaOH, bicin (N,N-bis[2-hydroksyetyl]-glyein) eller CHES(2-[N-cykloheksylamino]-etansulfonsyre) er eksempler på egnede bufferstoff. Uttrykket "akselerator" vedrører en hvilken som helst forbindelse som tjener til å øke hastigheten for hydrolysen av de kromogene esterne som her beskrives. Innbefattet er kjemisk så forskjellige ;stoff som pyridin, imidazol og derivater derav; metallkomplekser av formelen Dm[B(CN^(NO) ] hvor D er alkalimetall , B er et tungmetall-ion, p er 0 eller 1, m er 2-5, n er 4-8, og m er summen av n og valensen av B; og alkoholer.- Egnede alkoholer inneholder fra 1 til 15 karbonatomer. Lineære alkoholer er foretrukket fremfor forgrenede alkoholer, selv om sistnevnte er innbefattet innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse.

Ved "kondensert ringsystem" forstås to eller flere aromatiske ringer som deler et par karbonatomer. F.eks. i strukturen

kan begge R-ene sammen danne det kondenserte ringsystemet hvor begge R-ene tilsammen utgjør Nok et eksempel er

hvor begge R-ene tilsammen utgjør -4CH=CH-CH=N4— . Følge-lig er det kondenserte ringsystemet polynukleært, aromatisk, og kan være hetereocyklisk eller homocyklisk.

Uttrykket "detekterbar respons" er her ment å bety en forandring i, eller oppståen av, en parameter i et forsøks-innretningssystem som kan oppfattes, enten ved direkte observasjon eller instrumentelt; og som er en funksjon av nærværet av en spesifikk komponent i en vandig prøve. Slike detekterbare responser er forandring i, eller tilsyne-komsten av, farge, fluorescens, reflektans, pH, kjemilumine-scens og infrarødt spektrum.

Betegnelsen "anion" slik som den benyttes her, innbefatter enheter som er negativt ladet ved en pH i området 7-10,

og som er kovalent bundet til ringen som er gjengitt i

strukturen (I). Sistnevnte gruppe innbefatter så forskjellige former som n-.heksyl-6-sulf onat, fenylkarbonat og n-propyl-3-fosfonat.

Reagensen ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter en ester og et diazoniumsalt. Selv om disse bestanddelene kan velges fra store grupper, foreligger det foretrukne utførelser som vil gi maksimale resultater, dvs. en høy grad av detekterbar respons utviklet i løpet av kort tid. Denne optimaliseringen kan fremmes ytterligere ved at det innbefattes en akselerator i reagensen.

Både reagensen og forsøksinnretningen ifølqe forelig-

gende oppfinnelse inneholder en ester av en aromatisk,

eller pseudoaromatisk, fenol og en syre. Videre er esteren en ester som er i stand til katalytisk å hydrolyseres i nærvær av leukocytter, esterase eller protease slik at fenolen eller pseudofenolen oppstår, denne er så fri til å koples med diazo-dobbeltionet.

Noen estere som er egnet for anvendelse i foreliggende oppfinnelse innbefatter indoksylacetat, indoksylbutyrat, indoksyllaurat, indoksylstearat, indoksylester av en N-blokkert aminosyre eller et peptid og tioindoksylanaloger derav. Også innbefattet er p-nitrofenyl-N-tosyl-L-alaninat, a-naftyl og alaninat. Ytterligere eksempler på esteren innbefatter estere av strukturen

hvor A er residuet av en ester-dannende syre uten dens karakteristiske sure -OH-gruppe,. R er laverealkyl, aryl, karboksyl, karboksylester, amido eller cyano, R* er II, laverealkylseller aryl, og X er 0, S eller NR<*>. Uttrykket "syreresidu" innbefatter fosfor-, sulfon-, karbon-og karboksylsyreresidu, dvs. henholdsvis

Estere som svarer til strukturen (V) innbefatter 3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-5-fenylpyrrol, l-metyl-3-(N-tosyl-L-alaninyl-oksy)-5-fenylpyrrol, 3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-5-(p-kloro-fenyDpyrrol og 3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-5-fenyltiofen.

Reagensen ifølge foreliggende oppfinnelse kan, i

tillegg til esteren, innbefatte forskjellige akseleratorer som definert ovenfor. Alkoholer er funnet å være spesielt nyttige for økning av den esterase- og protease-katalyserte hydrolysen av esterne, diskutert ovenfor. Alkoholer som inneholder 8-15 karbonatomer er foretrukket for dette formål, mens dekanol, undekanol og dodekanol er foretrukket for anvendelse med forsøksinnretningen, først og fremst på grunn, av deres lave flyktighet sammenlignet med alkoholer av lavere molekylvekt.

Reagensen innbefatter et spesielt diazoniumsalt som

et koplingsmiddel. Deltagelsen av diazoniumsaltet i det totale reaksjonsforløpet kan representeres ved følgende eksempel:

hvor ArN+=N er diazoniumsaltet (I), og A, R, R<*> og X er som definert ovenfor. Reaksjonsproduktet VII er et azo-fargestoff<som kan vise en dyp, distinkt farge.

Følgelig er dobbeltionet et specie av diazoniumsalt hvor motionet til diazoniumgruppen er kovalent bundet til ringsystemet. Eksempler på slike anioner innbefatter sulfonyl (S03~), karbonyl: (C02~), fosfonyl (PO^ ) og andre. Innbefattet innenfor omfanget av (I) er slike forbindelser som 1-diazonaftalen-4-sulfonat, l-diazo-2-naftol-4-sulfonat, 1-diazofenyl-3-karbonat og mange andre. Det er funnet mest hensiktsmessig å benytte l-diazo-2-naftol-4-sulfonat.

Reagensen besKrevet ovenfor kan benyttes som den er

ved bestemmelse av leukocytter, esterase eller protease, eller den kan inkorporeres med en bærermatriks slik at det dannes en forsøksinnretning, derved tilveiebringes et verktøy for raskt og pålitelig å kunne fastslå nærværet av komponenten som skal bestemmes. Bærermatriksen er vanligvis, men ikke nødvendigvis, et porøst stoff som f.eks. filterpapir. Andre kjente former for bærermatriksmaterialer er filt, strimler av porøst keramisk materiale, og vevede eller sammenfiltrede glassfibrer (US patent nr. 3.846.247). Også foreslått er anvendelsen.av tre, tekstil, svampmaterialer og leirholdige stoff '(US patent nr. 3.552.928). Alternativt kan bærermatriksen være uporøs, som f.eks. forskjellige polymere filmer, glass og lignende. Alle slike bærermatriksmaterialer kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse, det kan videre en rekke andre materialer. Det er funnet at filterpapir er spesielt velegnet.

I en foretrukket fremgangsmåte' for fremstilling av innretningen fuktes et stykke filterpapir med en vandig oppløsning av bufferen. ;Denne første dyppe-oppløsningen kan også inneholde forskjellige bearbeidelsestilsetninger som f.eks. et rensemiddel, et klebemiddel som f.eks. polyvinylpyrrolidon, og andre inerte bestanddeler.

Det impregnerte filterpapiret tørkes så og fuktes med en

andre dyppe-oppløsning av esteren og, om ønsket av akseleratoren og/eller diazoniumsaltet i aceton eller et annet ikke-vandig oppløsningsmiddel. Det dobbelt-impregnerte papiret tørkes så for andre gang, derved dannes en forsøks-innretning som er følsom for nærværet av leukocytter og andre komponenter som skal analyseres.

Den tørkede, reagensholdige bærermatriksen kan monteres

på et støttematerialet dersom dette ønskes. En foretrukket utførelse av forsøksinnretningen er en filterpapirmatriks inkorporert med reagensen beskrevet ovenfor, hvor matriksen er festet til en side av et avlangt stykke av transparent polystyrenfilm. Matriksen er festet til filmen ved hjelp av en hvilken som helst egnet innretning, som f.eks. dobbeltklebende tape ("Double Stick"), den andre enden av polystyrenfilmen tjener som et håndtak. Ved bruk holdes en slik innretning i den frie enden av polystyrenfilmen og den enden av støttematerialet hvor matriksen er festet dyppes i prøven (f.eks. urin) og fjernes fort. Enhver fargedannelse, eller annen detekterbar respons, observeres etter en bestemt tid og sammenlignes med en referansestandard som tilsvarer responser på kjente konsentrasjoner av leukocytter eller andre komponenter som har esterase- eller protease-aktivitet. Det er funnet at en inkubasjonstid på 1-3 minutter vanligvis er tilstrekkelig til at fargeutvikling kan finne sted i det reagensholdige filterpapiret.

De følgende eksemplene er tilveiebragt for å lette fremstil-lingen og anvendelsen av foreliggende oppfinnelse. Følgelig er foretrukne utførelser beskrevet i detalj og resultatene av disse er analysert.

I den følgende eksperimentelle diskusjonen er følgende forkortelser benyttet:

g = gram

kg = kilogram

1 = liter

ml = milliliter

M = molar

mM = millimolar

N = normal

ekv.= ekvivalenter

mol = gram molekylformel (mol)

mmol = gram molekylformel x 10 3 (millimol)

aq = vandig

hr = time

TLC = tynnsjiktkromatografi

Infrarøde (IR) spektra ble" tatt opp med et "Perkin-Elmer modell 710B" eller "237" infrarødt spektrofotometer som oppløsninger i CHCl^ med mindre annet er angitt; 1602 cm ^ båndet av polystyrenfilm ble benyttet som en ytre kalibrerings-standard. Signalene er angitt som cm ^.

Kjernemagnetiske resonans (NMR) spektra ble tatt opp ved 89,55 MHz ved å benytte et "JEOL FX-900" spektrometer, eller ved 60 MHz ved å benytte et "Varian T-60" spektrometer; spektrene ble tatt opp i CDCl^-oppløsning med mindre annet er angitt. Kjemiske forskyvninger er angitt i sigma-enheter nedover fra den indre standarden tetrametylensilan.

Karbon-13 magnetiske resonans (<13>C NMR) spektra ble oopnådc ved 22,5 MHz ved å benytte et "JEOL FX90Q" spektrometer med Fourier-transformasjon og med fullt proton-bred-bånds støyavkopling; spektrene ble tatt opp i CDCl^-oppløsning med mindre annet er angitt. Karbonforskyvninger er angitt i deler pr. million nedover fra den indre standarden tetra-metylsilan.

Massespektra (MS) ble tatt opp på et "Hewlett-Packard 5985A" spektrometer som ble drevet enten i modusen elektronstøt

(EI - electron impact) eller i modusen raskt atombombardement (FAB - fast atom bombardment). Høyoppløsningsmassespektra

ble oppnådd på et "AEI MS-902" spektrometer.

Organiske reagenser ble levert av Aldrich Chemical Company,

og ble benyttet uten rensing med mindre annet er angitt. Uorganiske reagenser var av "ACS"-kvalitet fra Fisher Scientific Company eller andre større forhandlere. Reaksjonsoppløsnings-midler var av "ACS"-kvalitet; tetrahydrofuran (THF) var av "HPLC"-kvalitet fra J.T. Baker Chemical Company. Salt-oppløsning refererer til en mettet vandig natriumklorid-oppløsning.

Tynnsjiktkromatografi (TLC) ble utført ved å benytte silikagel "60F-254"-plater fra E. Merck. Kolonnekromatografi ble utført ved å benytte "Silica Gel 60" (70-230 mesh) fra E.. Merck. Alle smelte- oq kokepunkter som angis er ukorrigerte.

EKSEMPLER

Fremstilling av noen pseudofenoliske estere

Følgende forsøk ble utført for å illustrere syntesen av

estere som er nyttige ved foreliggende oppfinnelse. Selv om disse eksperimentene vedrører spesifikke utgangsmaterialer og sluttprodukter, antas det at fremgangsmåtene kan anvendes på en lang rekke esterespecies som beskrevet heri.

1. Syntese av 3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-5-fenylpyrrol

(4)

Syntesen av 3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-5-fenylpyrrol illu-streres ved følgende reaksjonsskjema.

N-tosyl-L-alanin

L-alanin (100 g; 1,11 mol) ble oppløst i 2,25 1 lN natrium-hydroksyd (aq), avkjølt til 5°C og omrørt mens en oppløsning av p-toluensulfonylklorid (218 g, 1,11 mol) oppløst i 450 ml toluen sakte ble tilsatt. Blandingen ble omrørt ved om-givelsestemperaturen i 20 timer. Lagene ble separert og det avkjølte vandige laget ble surgjort til pH 1 med konsentrert saltsyre. Den hvite faste forbindelsen angitt i overskriften ble samlet ved filtrering, vasket med vann og tørket. Utbyttet 178,5 g (66%), smeltepunkt 134-135°C.

IR (CHC13) cm"1 1726, 1340, 1165, 1095;

<2>H NMR (DMSO-d6) 6 1,20 (d, J=7,3H), 2,40 (s,3H), 3,85 (p, J=8,1H), 6,4 (br s, 1H)(C02H), 7,41 (d, JAB=8, 2H) og 7,75 (d, JAB=8,2H) [sentrum av diagram: 7,58; AVAB=20,49Hz], 8,03 (br d, J=8,1H)(NH).

N-tosyl-L-alaninylklorid

Fremgangsmåte A

En blanding av N-tosyl-L-alanin (12,4 g; 0,05 mol) og tionyl-klorid (25 ml) ble oppvarmet til 55°C i 90 minutter, og deretter konsentrert på rotasjonsfordamperen ved 40°C. Det røde faste residuet ble oppløst i 200 ml kokende CC14, av-farget med 20 g ovnstørket "Norit 211", filtrert og avkjølt. Det kremfargede, faste produktet i overskriften ble samlet ved filtrering, vasket med heksan og tørket. Utbytte 8,48 g (65%) med smeltepunkt 101-101,5°C.

IR (CHC13) cm"1 3360, 3260, 3025, 1775, 1605, 1350, 1170, 910;

<1>H NMR (CDC13) 6 1,48 (d, J=7,3H), 2,43 (s, 3H), 4,33 (p, J=8,1H), 5,93 (br d,J=8,lH)(NH), 7,31 (d, JAB=8, 2H) og

7,76 (d, JAB=8,2H) [sentrum av diagram: 7,53; AVAB=26,83Hz!.

Analyse

Beregnet for C10H12ClNO3S: C 45,89; H 4,62; N 5,35

Funnet: C 46,63; H 4,90; N 5,19

Fremgangsmåte B

En blanding av N-tosyl-L-alanin (3,1 g; 13 mmol) og tionyl-klorid (6 ml) ble oppvarmet til 50°C i 90 minutter, og deretter fortynnet med 50 ml tørr heksan. Blandingen ble raskt omrørt, avkjølt og det faste produktet ble filtrert. Utbytte 3,15 g (93%), smeltepunkt 99-100°C. IR-spektret var iden-tisk med det for rekrystallisert materiale fremstilt ved fremgangsmåte A.

2-hydroksy-3- (karboksymetylami.no) -hydrokanelsyre-dikalium-salt-dihydrat (1)

En omrørt oppslemming av 1,0 kg trans-kanelsyre (6,75" mol)

i 4,5 1 aceton ble behandlet først med NaHCC>3 (2,47 kg;

29,4 mol; 4,36 ekv.), deretter forsiktig med vann (4,5 1) Den resulterende tykke blandingen ble, i løpet av et tidsrom på 1,5-2,0 timer, behandlet dråpevis med en oppløsning av "OXONE" monosulfatforbindelse (3,78 kg; inneholder l.,,825 ekv. av KHSOj.) i 0,5 mM vandig dinatriumetylendiamintetraeddik-syre (EDTA) (14,5 1; fremstilt ved å oppløse 2,17 g<;>dinatrium-EDTA-dihydrat i 14,5 1 destillert vann). I løpet av. denne tilsatsen ble reaksjonstemperaturen holdt ved 24-27°C ved å benytte et vannbad; reaksjonens pH ble registrert til ca.

7,4. Etter at tilsatsen var avsluttet, ble blandingen omrørt i ytterligere 0,5 timer, deretter avkjølt til ca. 10;°C. Reaksjonsblandingen ble surgjort med konsentrert HC1 (ca.

1,2 1) til pH = 2, mens temperaturen ble holdt på ca. 10°C, og den ble deretter behandlet med CH2C12 (5,05 1) og kraftig omrørt i 10 minutter.

Etter at blandingen hadde fått sedimentere, ble det. vandige laget dekantert av og det organiske laget, som inneholdt uoppløselige salter, ble filtrert gjennom papir med. avsug-ning. De filtrerte faste stoffene ble vasket med CH2C12

(1,9 1) og det vandige laget ble ekstrahert med dette filtratet. De filtrerte stoffene ble igjen vasket med.CH2Cl2 (3,15 1) og det vandige laget ekstrahert med dette filtratet. De kombinerte CH2Cl2-lagene ble ekstrahert med en oppløsning av KOH (593,3 g) i vann "(6,31 1) - forsiktig oppvarming til ca. 40°C er ofte påkrevet for å oppløse et fast stoff som kan separere under base-ekstraksjonen. CH2Cl2~laget ble så ekstrahert med en oppløsning av KOH (99 g) i vann 1,5 1) og de kombinerte base-ekstraktene ble så behandlet med.glycin (481,7 g; 6,416 mol; 0,95 eq); det organiske laget ble kastet.

Oppløsningens pH ble regulert til 11,5 med 25% vandig KOH, oppløsningen ble deretter oppvarmet til .koking. Ca. 900 ml av lavtkokende væske (aceton og vann) ble destillert av inntil damptemperaturen nådde 99°C, deretter ble blandingen kokt med tilbakeløp i 2 timer. Etter avkjøling ble reaksjonsblandingen ekstrahert med CH2C12 (3,15 1), CH2C12~ fasen ble kastet og den vandige fasen ble inndampet til tørr-het under redusert trykk på et bad med temperatur 70°C. Residuet ble kokt i 95% EtOH (8,83 1) i 30 minutter, fikk deretter langsomt avkjøle under omrøring, hvorpå produktet separerte fra som fine krsytaller. Disse ble filtrert, vasket med ny 95% EtOH (1,26 1) og tørket i en ovn ved temperatur 50-60°C slik at man fikk forbindelsen i overskriften (1,77 kg; 74,6%) i form av hvite krystaller med smeltepunkt = 120-122°C (ukorrigert).

IR (KBr) cm<-1> 3^420 (br.), 1590 (br.), 1410, 1130,

710;

<*>H NMR (<D>20-TSP) S 3,1 (s, 2H), 3,89 (d, JAB=4,1H) og 4,52 (d, J Ad =4,1H) (sentrum av diagram: 4,21; 4VA„ d=18,83 Hz), 4,68 (s, 6H, utvekselbare protoner), 7,4 (s, 5H);

TLC Rf = 0,59 (EtOH:IM trietylammoniumbikarbonat, 7:3).

Analyse

Beregnet for C^H^NOy1^1 c 37>59' > H 4»30; N 3,99

Funnet: C 37,22; H 4,24; N 3,96

N-acetyl-3-acetoksy-5-fenylpyrrol (2)

En suspensjon av 2-hydroksy-3-(karboksymetylamino)-hydro-kanelsyre-dikaliumsalt-dihydrat (1) (1,0 kg; 2,84 mol) i pyridin (3,0 1) ble behandlet med eddiksyreanhydrid (4,0 1) ved omgivelsestemperatur under en atmosfære av inert gass. En svakt eksoterm reaksjon fulgte og reaksjonstemperaturen steg eksponentielt til 60-70°C i løpet av et tidsrom på 1,5-2,5 timer. Når reaksjonstemperaturen begynte å falle, ble blandingen oppvarmet til 120-123°C i 15 minutter, den fikk deretter avkjøles til omgivelsestemperatur i løpet av 1 time, i løpet av denne tiden ble pyridiniumacetat fraseparert som krystaller. Blandingen ble filtrert gjennom papir med avsug og saltene ble vasket med EtOAc inntil de var farge-løse; filtratet ble inndampet til tørrhet i vakuum.

Det mørkt røde residuet ble oppløst i EtOAc (3,0 1) vasket tre ganger med vann (1,0 1 hver gang), tørket over MgS04 og behandlet med "Darco-G60" (300 g). Etter omrøring i 30 minutter ble blandingen filtrert gjennom "Celite" og inndampet til tørrhet i vakuum, slik at man fikk en rød-oransje olje. Denne oljen ble oppløst i varm 2-propanol (1,2 1), den fikk deretter langsomt avkjøles til romtemperatur over natten, hvorpå et fast stoff ble separert fra. Det kry-stallinske produktet ble filtrert, vasket med 50% vandig 2- propanol og tørket i vakuum slik at man fikk forbindelsen i overskriften (417 g; 60%) med smeltepunkt = 58-60°C (kor-rigert). En del ble opptatt i Et20, behandlet med "Norit 211", filtrert og konsentrert under redusert trykk; ved henstand ved 0°C ble fargeløse små nåler separert fra. Disse ble filtrert, vasket med Et20/heksan (1:1) og vakuumtørket slikjat man fikk den analytiske prøven med smeltepunkt = 60-62, 5°C (ukorrigert).,

IR (CHC13) cm<-1> 3020, 1760, 1730, 1595, 1378, 1320, 1220 (br.), 1030, 960, 903;

<1>H NMR (CDC13) « 2,23 (s, 3H), 2,27 (s, 3H), 6,18 (d, J=2, 1H), 7,35 (s, 5H), 7,42 (d, J=2, 1H>;

TLC Rf = 0,56 (toluen:dioksan, 4:1).

Analyse

Beregnet for C14H13N03: C 69,12; H 5,38; N 5,76

Funnet: C 68,88; H 5,25; N 5,53

3- hydroksy-5-fenylpyrrol (3)

En finfordelt porsjon av N-acetyl-3-acetoksy-5-fenylpyrrol (2) (36,8 g; 0,15 mol) ble renset for oksygen ved omrøring i en strøm av argongass i 10 minutter, deretter suspendert i desoksydert MeOH (379 ml), avkjølt til -6°C (i et

metanol (MeOH)/tørrisbad ved -15°C) under en atmosfære av inert gass og raskt behandlet med en iskald desoksydert oppløsning av 2NiNaOH (300 ml). Reaksjonstemperaturen steg øyeblikkelig ved tilsats av base til 18°C, og etter ca. 3 minutter var- reaksjonsblandingen homogen. Ved avkjøling av reaksjonsblandingen separerte forbindelse (3) fra som fine

krystaller. Etter 15 minutter ble en oppløsning av kald desoksydert 2M sitronstyre (150 ml) tilsatt, den resulterende blandingen ble omrørt i 10 minutter, og deretter filtrert. Det faste stoffet ble grundig vasket med desoksydert vann (200 ml), idet man omhyggelig unngikk å eksponere produktet overfor luft, deretter tørket under vakuum over natten, slik at man fikk forbindelsen i overskriften (22,3 g; 93,6%) i form av lyst rosa små nåler.

IR (KBr) cm"<1> 3400, 3110, 2900, 1600, 1580, 1555, 1480, 1268, 1180, 742, 640;

<1>H NMR (DMSO-D<6>) 6 6,1 (m, 1H), 6,3 (m, 1H), 7,0-7,7 (m, 5H), 8,0 (s, 1H), 10,4 (br s, 1H);

TLC Rf = 0,20-0,28 (EtOH:CHCl3, 1:9).

Analyse

Beregnet for C^HgNO: C 75,45; H 5,70; N 8,80

Funnet: C 75,30; H 5,69; N 8,67

3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-5-fenylpyrrol (4)

En oppløsning av vannfri tetrahydrofuran (THF, 450 ml), pyridin (43,8 ml; 0,542 mol; 1,2 ekv.) og trifluoreddiksyre (85,0 ml; 1,10 mol; 2,4 ekv.), holdt ved 0°C under en inert atmosfære, ble behandlet i en del med 3-hydroksy-5-fenyl-pyrrol (3) (71,5 g; 0,45 mol; 1,0 ekv.) straks etterfulgt av dråpevis tilsats av en oppløsning av nyfremstilt N-tosyl-L-alaninylklorid (141,0 g; 0,54 mol; 1,2 ekv.) i vannfri THF (4 50 ml) i løpet av 5-10 minutter. Den resulterende blandingen ble omrørt i 15 minutter ved 0°C. Reaksjonen ble så slukket ved tilsats av en oppløsning av 1,0 M vandig sitronsyre (315 ml) og EtOAc (1,35 1). Etter kort blanding ble fasene separert og det organiske laget ble vasket med en oppløsning av vandig NaCl (360 ml; 0,18 g NaCl pr. ml vann). Det organiske laget ble så ekstrahert to ganger med en oppløsning, av 5% vandig NaHC03 (1,35 1 hver gang), og deretter vasket med en annen porsjon av vandig NaCl (360 ml; 0,18 g NaCl pr. ml vann). Det rød-brune organiske laget ble omrørt ved omgivelsestemperatur i 15 minutter med MgSO^

(101 g) og "Darco-G60" (143 g), deretter filtrert gjennom

"Celite" og inndampet til tørrhet i vakuum fra et bad ved 37°C, slik at man fikk (4) i form av et rosa-hvitt faststoff. Råproduktet ble nedmalt til et pulver og oppløst i varm (50°C) THF (250 ml), omrørt kraftig og fortynnet med n-heksan (250 ml). Omrøringen ble fortsatt i 1 time ved romtemperatur, mens produktet krystalliserte. Det faste stoffet ble fil-trert, vasket med toluen (ca. 1,0 1) inntil filtratet var fargeløst, deretter tørket i vakuum over natten slik at man fikk forbindelsen i overskriften (112; 65%) i form av et hvitt pulver med smeltepunkt = 154,5-155°C.

IR (KC1) cm"<1> 3350, 3325, 1760, 1508, 1320, 1155, 770;

^H NMR (DMSO-d<6>) 6 1,33 (d, J=7, 3H), 2,36 (s, 3H),

4,13 (p, J=8, 1H), 6,25 (m, 1H), 6,73 (m, 1H), 7,05-7,50

(m, 5H), 7,5-7,85 (m, 4H), 8,42 (d, j=8, 1H), 11,18 (br s, 1H); ;

<13>C NMR (DMSO-d<6>) ppm 18.335, 21.001, 51.370, 98.061, 108.336, 123.423, 126.024, 126.610, 128.560, 128.756, 129.601, 132.397, 137.600, 138.380, 142.737, 169.919;

[a]D = -70° (c=l,ll, MeOH);

TLC Rf = 0,4 5 (EtOAc:heksan, 1:1);

TLF Rf = 0,4 0 (toluen .-dioksan, 4:1).

Analyse

Beregnet for C^H^N^S: C 62,48; H 5,24; N 7,29

Funnet: C.62,62; H 5,27; N 7,30

2. Syntese av 3-(N-tosylalaninyloksy)-5-fenyltiofen

(9)

En serie forsøk ble utført for å fremstille 3-hydroksy-5-fenyltiofen med små modifikasjoner av de fremgangsmåtene som er angitt i litteraturen 1' 2, angitt på en av. de følgende sider. Det resulterende hydroksytiofenet ble så acylert med N-tosyl-L-alaninylklorid slik at man fikk den tilsvarende N-tosyl-L-alaninatesteren med 46% utbytte (ikke-opti-malisert fremgangsmåte).

3-fenyl-1,2-ditia-3-cyklopenten-5-on (5)

En suspensjon av 10 g etylcinnamat (56,82 mmol) og 10 g svovel ble oppvarmet til 250°C i 4 timer i en 50 ml flaske utstyrt med et destillasjonshode og en mottagerbeholder for å fjerne etanol fremstilt under reaksjonen. Reaksjonsblandingen fikk så avkjøle til 100°C og ble tilsatt til 500 ml tilbakestrøms-etanol. Den resulterende utfellingen ble filtrert og suksessivt vasket med 500 ml kokende aceton og to ganger med 500 ml porsjoner av etanol. De kombinerte Qvervæskene ble konsentrert slik at man fikk et sort faststoff, som ble krystallisert fra metanol til mørkt brune nåler. En andre' rekrystallisering fra metanol ved bruk av "Norit" og filtrering gjennom "Celite" ga 2,023 g lyst gule nåler med smeltepunkt 113-115°C.

IR (KBr) cm"<1> 1650, 1550, 1390, 1350, 1130, 770;

<X>H NMR (60 MHz, CDCl-j) 6' 6,92 (s, 1H), 7,58 (m, 5H) ;

TLC Rf = 0,5 (diklormetan).

Analyse

Beregnet for CgH602S: C 55,64; H 3,11

Funnet: C 55,53; N 3,4 7

cis-4-Keto-6-fenyl-3,7-ditia-5-n6nendionsyre (6)

En smeltet oppløsning av 35,48 g natriumsulfidnonahydrat (148 mmol) ved 94°C ble behandlet med 6,65 g 3-fenyl-l,2-ditia-3-cyklopenten-3-on (5) (34,23 mmol) tilsatt porsjons-vis i løpet av 5 minutter. Etter 15 minutter ble blandingen tilsatt til en iskald oppløsning som inneholdt 43,6 g brom-eddiksyre (314 mmol) i 60 ml H20, hvor pH var justert til 8,7 med natriumkarbonat. Den resulterende oppløsningen ble holdt ved 0°C, pH 8,7 i 45 minutter, og ble deretter filtrert. Overvæsken ble holdt ved 0°C og surgjort til pH 3,7 med en 5N HCl-oppløsning. Den resulterende blandingen ble omrørt over natten ved 5°C. Overvæsken ble så dekantert, og den resulterende oljen ble vasket med eter. Oljen ble inndampet med toluen inntil man fikk 6,98 g av et fargeløst skum (65%). Dette materialet ble anvendt uten ytterligere rensing.

En analytisk prøve ble oppnådd fra eter-overvæsken, som ved konsentrering, suksessive inndampninger med eddiksyre og toluen, og vasking med eter, ga brune krystaller. Smeltepunkt = 142,5-150°C.

IR (KBr) cm"<1> 1705, 1655;

<X>H NMR (60 MHz, DMSO-dg) 6 2,06 (s, CH3C02H forurensning), 3,30 (s, 2H), 3,77 (s, 2H), 5,67 (m, 2H)(OH), 6,37 (s, 1H), 7,43 (m, 5H);

TLC Rf = 0,85 (kloroform:metanol:eddiksyre, 5:5:1)

Analyse

Beregnet for <C>13H12S2°5: C 50'00; H 3'88

Funnet: C 50,26; H 3,98

3-hydroksy-5-fenyltiofenacetat (7)

En kraftig omrørt suspensjon av 3,40 g rå cis-4-keto-6-fenyl-3,7-ditia-5-nonendionsyre (6) (10,9 mmol), 3,40 g natrium-acetat (41,5 mmol) og 30 ml eddiksyreanhydrid ble oppvarmet til tilbakestrømning i en time. Blandingen fikk av-kjøle og ble så filtrert og inndampet slik at man fikk en sort olje. Dette residuet ble oppløst i 75 ml etylacetat og ekstrahert tre ganger med 50 ml porsjoner av iskald mettet natriumbikarbonatoppløsning. Det organiske laget ble så vasket med saltoppløsning, tørket over natriumsulfat, filtrert, og inndampet slik at man fikk 2,826 g av et sort faststoff. Råproduktet ble renset ved fordampningsdestillasjon ved 120-140°C og 0,1 mm slik at man fikk 1,235 g av en lyst oransje olje som størknet ved henstand (52%)..

IR cm"1 1700, 1745;

<1>H NMR (60 MHz, CDC13) 6 2,23 (s, 3H), 7,03 (d, j=2Hz, 1H), 7,13 (d, J=2Hz, 1H), 7,23-7,73 (m, 5H);

MS (EI, DIP) m/e 218 (M<+>, 12,6%);

TLC Rf = 0,48 (heksan .-etylacetat, 5:1).

Analyse

Beregnet for C12H10SO2'% H20: C 63'41- H 4'88

Funnet: C 63,78; H 4,86

3-hydrqksy-5-fenyltiofen (8)

En blanding av 2,126 g 3-hydroksy-5-fenyltiofenacetat (7)

(9,74 mmol) og 80 ml metanol under en atmosfære av argon, ble behandlet med 11 ml IN NaOH. Etter 20 minutter ble reaksjonen slukket ved tilsats av 11 ml IN HC1, inndampet ved 25°C, 12 mm, til et volum på ca. 50 ml, og behandlet med 100 ml etylacetat. Det organiske laget ble separert

fra, vasket méd saltoppløsning, tørket over natriumsulfat, filtrert og inndampet til et sort faststoff. Dette residuet ble oppløst i 75 ml etylacetat og tørket over MgSC>4. Filtrering og inndamping ga et sort faststoff som ble vasket fire ganger med varm heksan slik at man ved avkjøling fikk totalt 837 mg.av et gult faststoff, smeltepunkt 74-75°C (49%). De kombinerte moderlutene ble konsentrert slik at man fikk 0,87 g av et fast stoff som ble kromatografert over 100 g Sip2» eluert med en oppløsningsmiddelblanding av heksan:etylacetat (7:1). Etter rekrystallisering opp-nådde man ytterligere 380 mg av produktet. Smeltepunkt 73,5-74°C. Det totale utbyttet var følgelig 1,217 g (71%), smeltepunkt 74,5-75°C (Litteratur<1>,<2> 75°C, 78°C).

IR cm"<1> 3380, 1635;

<1>H NMR (90 MHz, CDC13) 6 3,81 (s, 2H), 6,57 (s, 1H), 7,2-7,7 (m, 5H);

MS (EI) m/e 176,0 (70,7%);

TLC Rf = 0,23 (heksan:etylacetat, 1:5).

Analyse

Beregnet f or C^HgOS: C 68,15; H 4,57

Funnet: C 68,05; H 4,70

3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-5-fenyltiofen (9)

En oppløsning inneholdende 440 mg 3-hydroksy-5-fenyltiofen (8) (2,5 mmol) i 20 ml diklorometan og 0,61 ml pyridin (7,5 mmol) ved 0°C under en argonatmosfære ble behandlet med en oppløsning inneholdende 1,314 g N-tosyl-L-alaninylklorid (5 mmol) i 10 ml diklorometan tilsatt dråpevis i løpet av et tidsrom på 5 minutter. Reaksjonen ble omrørt i 0,5 timer ved 0°C, og ble deretter helt i 100 ml kloro-form. Blandingen ble så suksessivt ekstrahert med 50 ml porsjoner av IN sitronsyre, vann, iskald natriumbikarbonat-oppløsning, vann og saltoppløsning. Blandingen ble så tør-' ket over natriumsulfat, filtrert, og inndampet slik at man fikk 1,78 g av en brun olje. Forsøk på krystallisering fra toluen etter behandling med 1,78 g "Norit" var mislyk-ket. Residuet ble så kromatografert på en 200 g kolonne av Si02, eluert med diklormetan ved en strømningshastighet på 10 ml/minutt. Fraksjoner som inneholdt produktet ble samlet og oppkonsentrert slik at man fikk 951 mg av en rødaktig olje. Produktet ble krystallisert fra toluen. Suksessive rekrystalliseringer fra toluen ga en total mengde på 463 mg produkt i form av et lyst gult faststoff (46%), smeltepunkt 85-87°C.

IR (KC1) cm-1 1735, 1330, 1150;

<1>H NMR (90 MHz, CDC13) 6 1,53 (d, J=7 Hz, 3H), 1,62 (s, 3H), 4,23 (m, 1H), 5,32 (d, J=9 Hz, 1H), 6,84 (d, J=l,4 Hz, 1H), 6,88 (d, J=l,4Hz, 1H), 7,23-7,83 (m, 9H);

MS (FAB) m/e 402 (M + 1, 15%);

TLC Rf = 0,20 (heksan:etylacetat, 4:1).

Analyse

Beregnet for C2QH19N04S: C 59,83, H 4,77; N 3,59

Funnet: C 59,60, H 4,77, N 3,43

3. Syntese av 3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-l-metyl-5-fenyl-pyrrol (13)

En serie forsøk ble utført for å fremstille esteren i overskriften svarende til forbindelse (I) hvor A er N-tosyl-L-alaninyl, R er fenyl, R<*> er H, X er NR' og R' er CH3. Reaksjonsskjemaet er som følger:

1. P. Friedlander og S. Kielbasinski, Chem. Ber. 45, 3389

(1912).

2. A.I. Kosak, R.J.F. Palchak, W.A. Steele og CM. Selwitz, J. Amer. Chem. Soc. 76, 4450 (1954).

2-hydroksy-3- (N-metylkarboksymetylami.no) -hydrokanelsyre-dikaliumsalt (10)

En blanding av B-fenylglycidinsyre-kaliumsalt (30 g; 0,15 mol), N-metylglycin (13,2 g; 0,15 mol), destillert vann (119 ml) og KOH-oppløsning (9N; 22,3 ml) ble oppvarmet til tilbakestrømning i 3 timer slik at man fikk en lyst gul opp-løsning. Reaksjonsblandingen ble inndampet til tørrhet under redusert trykk ved 70°C. Residuet ble så krystallisert fra 95% EtOH (100 ml) slik at man fikk et hvitt fast stoff som, etter tørking natten over under redusert trykk ved 110°C, ga et utbytte på 30,8 g av det hvite faste stoffet (10) (utbytte 63%).

IR (KC1) cm"<1> 3360 (br), 1580, 1405, 705;

<1>H NMR (CD3OD) 6 2,30 (s, 3H), 2,98 (s, 2H), 3,70 (d, J=3 Hz, 1), 4,48 (d, J;=3 Hz, 1H) , 4,92 (s, 1H), 7,40 (s, 5H);

TLC R^ 0 0,51 (EtOH:IM trietylammoniumbikarbonat, 7:3).

(Produktet hadde ikke noe smeltepunkt under 270°C).

3-acetoksy-1-mety1-5-fenylpyrrol (11)

En blanding av 2-hydroksy-3-(N-metylkarboksymetylamino)-hydrokanelsyre-dikaliumsalt (10) (15,2 g, 46 mmol), eddiksyreanhydrid (173 ml) og trietylamin (308 ml) ble oppvarmet til 90°C i 19 timer. Reaksjonsblandingen som fikk en dypt brun farge, ble filtrert og det faste stoffet vasket med eter. Filtratet ble inndampet under redusert trykk slik at man fikk et mørkt brunt residu, som ble opptatt i eter (300 ml) og vann (200 ml). Lagene ble separert og eterlaget vasket med en annen porsjon vann (200 ml). Eter-oppløsningen ble så tørket over MgS04, filtrert og konsentrert under redusert trykk slik at man fikk 10,7 g av et brunt residu som ble renset ved fordampningsdestillasjon (120-135°C; 0,03 torr) og krystallisasjon fra eter slik at man fikk 3,0 g av hvite krystaller (11) (utbytte 30%), smeltepunkt = 64-65°C.

IR (CHC13) cm"<1> 2990, 1750, 1570, 1518, 1482, 1375, 1230 (br), 1024, 910, 700;

■"•H NMR (CDC13 ) 6 2 , 20 (s, 3H), 3,58 (s, 3H), 6,10 (d, J= 2 Hz, 1H), 6,75 (d, J=2 Hz, 1H), 7,35 (s, 5H);

TLC Rf = 0,58 (heksanrEtOAc, 7:3).

Analyse

Beregnet for C13<H>13N02: C 72,54; H 6,10; N 6,44

Funnet: C 72,57; H 6,09; N 6,51

3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-1-metyl-5-fenylpyrrol

(13)

Til en blanding av desoksydert metanol (15,5 ml) og 3-acet-oksy-l-metyl-5-fenylpyrrol (11) (1,3 g, 6,2 mmol), under argon, ble det tilsatt desoksydert NaOH (2N, 12,5 ml). Reaksjonsblandingen ble omrørt på et isbad i 15 minutter. Deretter ble. desoksydert sitronsyre (2M, 7 ml) tilsatt og den resulterende blandingen ble omrørt på et isbad i 8 minutter. Reaksjonsblandingen ble konsentrert under redusert trykk, deretter ble 20 ml vann tilsatt og blandingen ble ekstrahert to ganger med etylacetat (EtOAc) (50 ml).

EtOAc-lagene ble kombinert, tørket over MgSC>4, filtrert

og konsentrert under redusert trykk slik at man fikk

3-hydroksy-l-metyl-5-fenylpyrrol (12) i form av et oransje residu. Under argon ble det tilsatt en kald oppløsning av vannfri THF (12,4 ml), pyridin (0,6 ml, 7,4 mmol, 1,2 ekv.) og trifluoreddiksyre (1,2 ml, 15 mmol, 2,4 ekv.) til det oransje residuet, straks etterfulgt av tilsats av en opp-løsning av nyfremstilt N-tosyl-L-alaninylklorid (1,2 g,

7,4 mmol, 1,2:ekv.) i vannfri THF (12,4 ml). Den resulterende blandingen ble omrørt i 1 time ved 0°C. Deretter ble reaksjonen slukket ved tilsats av vandig sitronsyre (IM,

5 ml) og EtOAc (30 ml). Etter en kort blanding ble lagene separert og det organiske laget ble suksessivt vasket med mettet NaCl-oppløsning, to ganger med 5% NaHCO^-oppløsning og igjen med mettet NaCl-oppløsning. EtOAc-ekstraktet ble så tørket over MgS04, behandlet med "Norit 211", filtrert

og konsentrert under redusert trykk slik at man fikk råproduktet (13) i form av et oransje residu. Dette ble oppløst i heksan:EtOAc (1:1) (5 ml) og kromatografert på en kolonne (SiC^f 100 g) ved eluering med heksan:EtOAc (7:3) slik at

man fikk 1 g av (13) som en tykk lys oransje olje. En del av dette råproduktet ble videre renset ved semi-preparativ HPLC (kolonne, "IBM silica", 1 cm x 25 cm; mobil fase, heksan:EtOAc, 8:2; strømningshastighet, 4,0 ml/min; trykk, 1,4 kPa) slik at man fikk en honningfarget tykk olje (13).

IR (film) cm"<1> 3260, 2950, 1760, 1520, 1350, 1170, 770; 1H NMR (DMSO-dg) 6 1,28 (d, J=7 Hz, 3H), 2,36 (s, 3H), 3,58 (s, 3H); 5,85 (d, J=2 Hz, 1H), 6,15 (m, 1H), 6,74 (d, J=2 Hz, 1H), 7,30-7,80 (m, 9H), 8,37 (d, J=8 Hz, 1H);

13C NMR (DMSO-d,) 18.205, 20,936, 34.917, 51.240, 100.598,

b 113.148, 126.544, 127.000, 128.105, 128.560, 129.601, 130.901, 132.202, 135.714, 138.315, 142.672, 169.724;

TLC Rf = 0,52 (toluen.-dioksan 4:1);

Høy-oppløsningsmassespektru<m,><C>2i<H>22<N>2°4<S> krever m/e 398,1300, funnet m/e 398,1297.

4. Syntese av 3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-5-(p-klor-fenyDpyrrol .(18)

En serie forsøk ble utført for å fremstille esterforbin-delsen i overskriften svarende til forbindelse (I) hvor A er N-tosyl-L-alaninyl, R er p-klorfenyl, R<*> er H, X er NR' og R' er H. Reaksjonsrekken er som følger:

trans-e-(p-klorfenyl)glycidinsyre (14)

Til en omrørt oppslemming av p-klorkanelsyre (68,5 g;

0,375 mol) i 260 ml aceton ble det tilsatt NaHC03 (137 g; 1,63 mol), etterfulgt av langsom tilsats av 260 ml vann. Til denne oppløsningen ble det, i løpet av et tidsrom på 2,5 timer, ved 22-27°C, tilsatt en blanding av "OXONE"

(211 g; 0,343 mol), 120 mg dinatrium-EDTA og 805 ml vann. Etter 5 timer ble blandingen surgjort med 70 ml kald 12N HC1, slik at pH ble bragt ned til ca. 2,5, og den ble så ekstrahert med 700 ml etylacetat. Dette ekstraktet ble vasket med saltoppløsning, tørket med MgS04, filtrert, og filtratet ble inndampet til tørrhet under vakuum. Det hvite faste stoffet ble krystallisert fra etylacetat, smeltepunkt 121-125°C (72,2 g; 97% utbytte).

^ NMR (CDCl3/DMSO-d6) 5 7,3 (m, 4H), 4,05 (d, J=2, 1H)

og 3,4 (d, J=2, 1H).

Analyse

Beregnet for CgH7Cl03: C 54,43; H 3,55; Cl 17,85

Funnet: C 54,53; H 3,80; Cl 17,91

2-hydroksy-3-(karboksymetylamino)-p-klorhydrokanelsyre-dikaliumsalt-dihydrat (15)

Til en oppløsning av KOH (85%) (46,7 g; 0,709 mol) og 400 ml vann ble det tilsatt glycin (25,9 g; 0,345 mol) etterfulgt av trans-e-p-klorfenylglycidinsyre (14) (72,2 q; 0,3635 mol). Denne blandingen ble oppvarmet til 100°C i 2 timer, avkjølt til romtemperatur og tilsatt tilstrekkelig KOH til å øke pH til 12. Den uklare oppløsningen ble ekstrahert tre ganger med etylacetat, disse ekstraktene ble så kastet; den klare vandige oppløsningen (ca. 500 ml) ble inndampet til tørrhet under vakuum på et vannbad ved 70°C. De faste stoffene ble så oppløst i ca. 350 ml varm etanol, filtrert, og filtratet ble avkjølt på et isbad i flere timer. Det krystalliserte faste stoffet ble samlet ved filtrering og vasket med noe kald etanol, smeltepunkt 93-95°C med dekar-boksylering ved 185°C (57,2 g; 41%).

"""H NMR (D20-TSP) 6 7,4 (s, 4H), 4,7 (s, 6H, utvekselbare protoner), 4,4 (d, J=4, 1H), 4,05 (d, J=4, 1H) og 3,1 (s, 2H) .

Analyse

Beregnet for Ci;lH10C1NO5K2 • 2H20: C 34 , 24 ; H 3,66; N 3,63

Funnet: C 34,40; H 4,03; N 3,42

N-acetyl-3-acetoksy-5-(p-klorfenyl)pyrrol (16)

Til 2-hydroksy-3-(karboksymetylamino)-p-klorhydrokanelsyre-dikaliumsalt-dihydratet (15) (10 g; 0,02591 mol) ble det tilsatt eddiksyreanhydrid (40 ml) og pyridin (30 ml). Denne blandingen ble forsiktig oppvarmet til 35°C, ved dette punktet startet en eksoterm reaksjon som bragte temperaturen til 67°C, når temperaturen deretter begynte å synke, ble oppvarmingen gjenopptatt. Blandingen ble oppvarmet til 121-122°C (indre temperatur) i en time og deretter av-kjølt. Til reaksjonsblandingen ble det tilsatt ca. 30 ml etylacetat som utfelte det meste av pyridiniumacetatsaltet; dette saltet ble samlet ved filtrering og vasket med en mindre mengde etylacetat. Filtratet ble så inndampet under vakuum til en olje og isvann ble tilsatt. Produktet ble ekstrahert med eter og eterekstraktene ble suksessivt vasket to ganger med kald fortynnet vandig sitronsyre, kaldt vann, tre ganger med kald fortynnet vandig NaHCO^, kaldt vann og saltoppløsning, etterfulgt av tørking over MgSO^ og filtrering. Filtratet ble inndampet under vakuum til en olje. Til oljen ble det tilsatt 25 ml 2-propanol. Den resulterende oppløsningen ga, ved avkjøling og skraping, svakt gule krystaller, smeltepunkt 69-71°C (3,4 g; 47%);

TLC Rf = 0,61 (toluen:dioksan, 95:5).

En analytisk prøve ble rekrystallisert fra 2-propanol, men det ble ikke observert noe forandring i smeltepunktet.

IR (KC1) cm<-1> 1755 (C=0, ester) og 1730 (C=0, amid);

""•H NMR (CDC13) 6 7,4 (m, 5H), 6,2 (d, 3=2, 1H), 2,4 (s, 3H) og 2,3 (s, 3H).

Analyse

Beregnet for C14H12C1N03: C 60,55; H 4,36; N 5,04

Funnet: C 60,65; H 4,55; N 5,07

i

3-hydroksy-5-(p-klorfenyl)pyrrol (17)

En prøve av N-acetyl-3-acetoksy-5-p-klorfenylpyrrol (16)

(2,8 g; 0,01 mol) ble desoksydert i 10 minutter med en strøm av N2. Det faste stoffet ble så oppløst i desoksydert metanol (30 ml) som så ble avkjølt til -8°C. Det ble straks tilsatt1en kald desoksydert oppløsning av NaOH (1,6

g; 0,04 mol) i 20 ml H20, oppløsningen ble kort oppvarmet til 15°C og deretter straks avkjølt til -5°C; etter 25 minutter ble den klare oppløsningen behandlet med en kald desoksydert oppløsning av sitronsyre (4,2 g; 0,02 mol) i 15 ml H20 og temperaturen steg for kort tid til 5°C. Etter omrøring ved -5°C i 0,5; timer ble det faste stoffet samlet ved filtrering og vasket med kald desoksydert H20. Det svakt grønne produktet ble tørket under vakuum ved romtemperatur og P2°5 i flere dager (1,3 g; 68%);

TLC Rf = 0,19 (CHCl3:EtOH, 9:1);

IR (KC1) viste ingen tegn på C=0-absorpsjon.

Analyse

Beregnet for C^HgClNO- 1/6H20; C 61,08; H 4,27; N 7,12

Funnet: C 61,36; H 4,44; N 6,85

3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-5-(p-klorfenyl)pyrrol (18)

Til N2-desoksydert THF (15 ml) ble det tilsatt pyridin

(0,65 ml; 0,008 mol), trifluoreddiksyre (1,27 ml; 0,0164 mol) og 3-hydfoksy-5-p-klorfenylpyrrol (17) (1,3 g;

0,0065 mol). Oppløsningen ble avkjølt til 0°C til -4°C og en N2~desoksydert, avkjølt (0°C til -4°C) oppløsning av N-tosyl-L-alaninylklorid (2,1 g; 0,008 mol) i 15 ml THF ble tilsatt i løpét av 10 minutter. Etter at blandingen var holdt ved 0°C i 1 time, ble en blanding av is og 100 ml IN sitronsyre tilsatt. Denne blandingen ble ekstrahert med etylacetat og ekstraktet vasket en gang med kald saltoppløs-

ning, to ganger med kald fortynnet NaHCH^, og en gang med kald saltoppløsning, deretter ble den tørket over MgS04

og filtrert. Filtratet ble behandlet med 2 g "Darco" og omrørt i 10 minutter, filtrert og filtratet ble konsentrert under vakuum til en rød-brun olje. En andre behandling med 1,3 g "Darco" ga en lyst rødlig olje. Oljen ble oppløst i toluen:cykloheksan (4:1) og plassert i kjøleskap over natten. Lyst lakserøde krystaller ble oppnådd. (1,45 g; 53%); smeltepunkt 113-115°C;

TLC Rf = 0,47 (Et20);

IR (KC1) cm<-1> 1740 (C=0, ester);

"""H NMR (CDC13) 6 8,4 (br s, 1H), 7,8-7,2 (m, 8H), 6,7 (m,

1H), 6,2 (m, 1H), 5,5 (d, J=9, 1H), 4,2 (p, J=8, 1H), 2,4

(s, 3H), 1,4 (d, 3H);

MS (EI, DIP) m/e 418 (M<+>, 2,3%) og 420 (M<+>, 0,8%).

Analyse

Beregnet for C20<H>19ClN2O4S: C 57,34; H 4,57; N 6,69

Funnet: C 57,63; H 4,58; N 6,67

Fremstilling av anvendelse av forskjellige forsøksinnretninger En serie forsøk ble utført . for å fremstille forsøksinnret-ninger ifølge foreliggende oppfinnelse, hvor estersubstratene, beskrevet ovenfor, ble undersøkt med hensyn til deres evne til å undergå leukocytt-katalysert hydrolyse, etterfølgende kopling med dobbeltion (I), dvs. deres respons på leukocytter i urin. Hver innretning innbefattet en liten firkant av filterpapir som inneholdt analysereagensene, papiret var montert på den ene enden av en strimmel polystyrenfilm. Filterpapiret var impregnert med buffer, esteren, en akselerator og et dobbeltion-koplingsmiddel. Hver av de under-søkte innretninger ble funnet å vise. positiv reaksjon på leukocytter i urin.

A. Forsøksinnretning hvor esteren er 3-(N-tosyl-L-alaninyl-oksy ) -5-f enylpyrrol (4)

Det ble fremstilt en forsøksinnretning som var følsom overfor nærværet av leukocytter i urin. Innretningen innbefattet en liten firkant av filterpapir montert på den ene enden av en avlang strimmel polystyrenfilm. Papiret var impregnert med forskjellige bestanddeler innbefattet en kromogen ester, en akselerator og et diazoniumsalt. Et 30 cm bredt stykke av "Eaton and Dickman nr. 2 05" filterpapir ble neddykket i en vandig oppløsning som inneholdt følgende:

0,4M borat-NaOH-buffer pH-9,0

2,0% (vekt/volum) polyvinylpyrrolidon K-30

0,2% (vekt/volum) "Bioterg AS-4 0"

0,25M NaCl

Papiret ble så, tørket i 7 minutter i en "Overly Air Foil"-papirtørker ved 79-93°C ved et luftstrøm-trykk på 25 mm H20. Deretter ble det tørkede papiret neddykket i en -acetonopp-løsning som inneholdt

1,5% (volum/volum) n-dekanol

0,7 mM l-diazo-2-naftol-4-sulfonat

1,1 mM 3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-5-fenylpyrrol

Etter denne impregneringen ble papiret tørket i 7 minutter

i "Overly"-ovnen ved 65°C ved 12,7 mm H20. Det ble oppnådd et elfenbenshvitt forsøkspapir.

Et stykke av det tørkede, impregnerte papiret ble skåret til en firkant med sidekant 5,1 mm og montert på den ene enden av en avlang polystyrenstrimmel med dimensjon 101,6 x 5,1 mm. Monteringen av papiret på strimmelen ble oppnådd ved hjelp av dobbeltklebénde limbånd.

B. Forsøksinnretning hvor esteren er 3-(N-tosyl-L-alaninyl-oksy )-l-metyl-5-fenylpyrrol (13)

Det ble fremstilt en forsøksinnretning som var følsom overfor nærværet av leukocytter i urin hvor l-metyl-3-(N-tosyl-L-alaninyloksy )-5-fenylpyrrol ble benyttet som esterindika-toren og koplingsmidlet var 1-diazo-naftalen-4-sulfonat.

Et stykke filterpapir ("Eaton and Dikeman nr. 205") ble neddykket i en vandig første dyppe-oppløsning som inneholdt:

0,4 M borsyre

2,0% (vekt/volum) polyvinylpyrrolidon (K-30)

0,2% (volum/volum) "Bioterge AS-40"

0,25 M NaCl

Før impregnering av filterpapiret, ble oppløsningen titrert med NaOH til en pH på 9,0.

Den andre dyppe-oppløsningen i aceton inneholdt:

0,75 mM l-diazo-2-naftol-4-sulfonat

1,3 mM l-metyl-3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-5-fenylpyrrol 1,5% (volum/volum) dodekanol

Etter impregneringen i den første vandige dyppe-oppløsningen, ble papiret tørket i ca. 5 minutter ved ca. 80°C, dyppet i den andre oppløsningen og deretter tørket i ca. 5 minutter ved 70°C.

Det dobbeltimpregnerte papiret ble så tørket i en ovn med tvungen luftsirkulasjon i 5 minutter ved 50°C.

Det tørkede papiret ble skåret til en firkant med en sidekant på 5,1 mm og montert på enden av en polystyrenfilm med dimensjon 5,1 x 8,25 mm. Monteringen ble utført ved å benytte dobbeltklebende limbånd. Forsøksinnretningen ble lagret i flasker som hver inneholdt 100 stykker, sammen med silikagel og molekylarsikter for å tilveiebringe tørking.

C. Forsøksinnretning hvor esteren er 3-(N-tosyl-L-alaninyl-oksy )-5-(p-klorfenyl)pyrrol (18)

Forsøksinnretningene ble fremstilt som i forsøk B, bortsett fra at acetonoppløsningen istedenfor fenylpyrrolen inneholdt 1,3 mM 3-(N-tosyl-L-alaninylcksy)-5-(p-klorfenyl)-pyrrol.

Vurdering av forsøksinnretningene

Forsøksinnretningene fremstilt i forsøkene beskrevet ovenfor ble vurdert med hensyn til sin evne til å detektere leukocytter som er tilstede i urin.

Prøvene ble fremstilt fra en normal menneskelig urin. En prøve tjente som en blindprøve og leukocytter isolert fra nytappet blod ble tilsatt til to andre urinprøver slik at man fikk konsentrasjoner på henholdsvis 0, 10 og 75 leukocytter/pl .

Forsøksinnretningene ble raskt neddykket i, og fjernet fra, prøven. 2 minutter senere ble innretningene undersøkt ved hjelp av et spektrofotometer ved at prosent reflektans ved forskjellige bølg<i>elengder fra 400-700 nm (nanometer) ble målt.

Resultatene viser at alle forsøksinnretningene demonstrerte klare forskjeller i lysreflektans svarende til forskjellige leukocyttnivåer i prøvene. Resultatene er gjengitt i den følgende tabellen.

Claims (9)

1. Reagens for spektrofotometrisk bestemmelse av tilstedeværelsen av leukocytter, esterase eller protease i en prøve, karakterisert ved at den innbefatter en ester bestående av en aromatisk fenol eller pseudoaromatisk fenol som er i stand til å hydrolyseres katalytisk i nærvær av leukocytter, esterase eller protease slik at det oppstår en fenol som kan koples med et diazo-dobbeltion, og et diazoniumsalt som har strukturen hvor A~ er et anion, og R som kan være like eller forskjellige er H, laverealkyl, aryl, eller begge R kan sammen danne et kondensert ringsystem, og hvor R' er H, OH eller laverealkyl, og eventuelt en akselerator.

2. Reagens ifølge krav 1, karakterisert ved at A" befinner på 4-posisjonen.

3. Reagens ifølge krav 2, karakterisert ved at A~ er S03.

4. Reagens ifølge krav 1, karakterisert ved at saltet er l-diazo-2-naftol-4-sulfonat.

5. Reagens ifølge krav 1, karakterisert ved at esteren er 3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-5-fenylpyrrol.

6. Reagens ifølge krav 1, karakterisert ved at akseleratoren er en alkohol som inneholder 8-15 karbonatomer.

7. Reagens ifølge et av kravene 1-5, karakterisert ved at akseleratoren er en alkohol som inneholder 8-15 karbonatomer, og diazoniumsaltet er 1—diazo-2-naftol-4-sulfonat.

8. Forsøksinnretning til bestemmelse av tilstedeværelsen av leukocytter, esterase eller protease, karakterisert ved at en bærermatriks inkorporeres med reagensen ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7.

9. Fremgangsmåte til bestemmelse av tilstedeværelsen av leukocytter, esterase eller protease i en prøve, karakterisert ved at den innbefatter at prøven bringes i kontakt med innretningen ifølge krav 8, og det observeres en detekterbar respons.