FI85990B - Sammansaettning innehaollande zwitterjonkopplingsmedel och testanordning foer bestaemning av leukocyter. - Google Patents
Sammansaettning innehaollande zwitterjonkopplingsmedel och testanordning foer bestaemning av leukocyter. Download PDFInfo
- Publication number
- FI85990B FI85990B FI851354A FI851354A FI85990B FI 85990 B FI85990 B FI 85990B FI 851354 A FI851354 A FI 851354A FI 851354 A FI851354 A FI 851354A FI 85990 B FI85990 B FI 85990B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- ester
- leukocytes
- composition according
- tosyl
- solution
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
- C12Q2334/70—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases the product, e.g. phenol, naphthol being diazotised in situ, e.g. with Fast Red
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/805—Test papers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/903—Diazo reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
Description
1 85990
Kahtaisionikytkentäaineen sisältävä koostumus ja testi-laite leukosyyttien määrittämiseen Tämä keksintö koskee uutta koostumusta ja testi-5 laitetta, joka on käyttökelpoinen analyyttien, kuten leu-kosyyttisolujen, esteraasin ja proteaasin määrittämiseksi testinäytteestä. Keksintö on erityisen käyttökelpoinen leukosyyttien havaitsemiseksi ruumiinnesteistä, kuten virtsasta, ja vähentää tällaisen kokeen suorituksen labo-10 ratoriossa vaivalloisesta laskemismenetelmästä, joka vaatii mikroskooppitarkkailua, nopeaksi, helpoksi kasta- ja-lue -operaatioksi.
Epänormaalin korkean leukosyyttimäärän läsnäolo potilaan virtsassa johtuu mahdollisesti sellaisista pato-15 logisista tiloista kuten munuais- tai urogenitaalisen alueen infektiosta tai muusta toimintahäiriöstä. Sen mukaisesti tarkka tieto virtsan leukosyyteistä voi olla korvaamattoman arvokas väline lääkärille diagnoosissa ja tällaisten sairauksien hoidossa.
20 Perinteisesti lääkäri on luottanut visuaaliseen määritystekniikkaan, jossa lasketaan leukosyyttipopulaa-tio virtsan sedimentissä tai sentrifugoimattomassa virtsassa, menetelmään, joka vaatii kallista laitteistoa, kuten sentrifugin ja mikroskoopin, sekä kohtuuttoman ajan-25 käytön kliinikon kohdalla. Lisäksi traditionaalisen tekniikan haittana on, että vain vahingoittumattomat solut määritetään. Virtsasysteemissä esiintyvät leukosyytit . ovat sellaisten olosuhteitten alaisia, jotka voivat suo sia solun hajoamista. Tiedetään esimerkiksi, että virt-30 soissa, joiden pH on epänormaalin korkea, leukosyytin puoliintumisaika voi olla jopa vain 60 minuuttia. Koska hajonneet solut jäävät havaitsematta visuaalisessa tutkimustekniikassa, voidaan saada liian pieniä määriä ja vää-: '· riä negatiivisia tuloksia.
!*: 35 2 85990
Kahdesta leukosyyttien mikroskooppianalyysiteknii-kasta - virtsasedimentti- ja sentrifugoimattoman homogenisoidun virtsan analyysistä - edellinen on selvästi toivottavin. Vaikka luotettavat tulokset voivat suosia jäl-5 kimmäistä, virtsasedimenttitarkkailua käytetään suurimmassa osassa tapauksia. Siinä pitää virtsanäyte sentrifu-goida ja sedimentti eristää ja tarkkailla mikroskooppi-sesti. Analyytikko laskee sitten näkökentässä esiintyvien leukosyyttien lukumäärän. Tämän tehtävän tekee monimut-10 kaiseksi muiden virtsakomponenttien, kuten epiteelisolujen ja suolapartikkelien, läsnäolo sedimentissä. Sedimentin aineosien vaihteleva pitoisuus liittyneenä muihin monimutkaistaviin tekijöihin, mukaanlukien näytteen epäho-mogeenisuus ja erilaiset optiset voimat mikroskooppilait-15 teiden välillä, voivat johtaa valtaviin erehdyksiin lop-pumäärityksessä.
On siksi ilmeistä, että nopea, helppo leukosyytti-määritysmenetelmä, joka poistaisi aikaa vievien tekniikoiden tarpeen sekä kustannuksia vaativan laitteiston, ja 20 joka antaisi tarkkoja vastauksia esteraasi-, proteaasi-tai leukosyyttisolujen määrästä, ovat solut vahingoittumattomia tai hajonneita, muodostaisi todellakin suuren edistyksen alan nykyiseen tilaan. Esillä olevalla keksinnöllä saavutetaan tällainen etu. Lisäksi se perustuu 25 - ei kykyyn nähdä leukosyytit, vaan niiden esittämään entsymaattiseen aktiivisuuteen, ja siksi siitä puuttuvat oleellisesti aikaisemmin kuvatut epätarkkuudet.
Ennen tätä keksintöä menetelmät hydrolyyttisten analyyttien määrittämiseksi sisälsivät väriä muodostavia 30 estereitä, jotka esteraasin tai proteaasin hydrolysoimina tuottivat värillisen alkoholituotteena vahingoittumatto-: : man esterin ollessa erivärinen kuin vapaa alkoholi. Monet näistä systeemeistä sisälsivät kiihdytinyhdisteitä ja di-' - at soniumsuola-ky tkentäainei ta.
. 35 • · · » · 1 · • · « 3 85990 väriä tuottavat esterit Näin ollen alalla löytyy kirjallisuusviitteitä, joissa on kuvattu tiettyjen esterien käyttö, jotka entsy-maattisen aktiivisuuden vaikutuksesta hajoavat ja johta-5 vat värin tai muiden havaittavien reaktiotuotteiden syntymiseen. GB-patentti n:o 1 128 371 kuvaa indoksyyli- ja tioindoksyyliesterien käytön hyödyllisinä värinmuodosta-jina hydrolyyttisten entsyymien havaitsemiseksi ruumiinnesteissä. Entsyymit pilkkovat esterin muodostaen vapaan 10 indoksyylin, joka sen jälkeen hapettuu dimeeriseksi tuotteeksi indigoksi, helposti havaittavaksi siniseksi väriaineeksi. Tällaisen aktiivisuuden sanotaan johtuvan muiden entsyymien lisäksi kolinesteraasista. Tämä patentti kuvaa myös, että esterisubstraatin indoksyyliosuuden li-15 säksi happoradikaali valitaan erityisesti havaittavan entsyymin mukaan. Esitetään esimerkiksi, että happoradikaali voi olla asetaatti, lauraatti tai stearaatti este-raasin tai lipaasin havaitsemiseksi, vastaavasti. Sellaisten entsyymien kuin fosfataasin tai sulfataasin ha-20 vaitsemiseen asyyliradikaali voi olla epäorgaaninen. Näin ollen GB-patentti kuvaa väriä muodostavien estereiden käytön substraatteina esterolyyttisten entsyymien havaitsemiseksi, ja tällaiset esterit käsittävät indoksyylin ja tioindoksyylin esterin alkoholiosuutena, Ja asyyliosuus 25 räätälöidään tietylle määritettävälle entsyymille.
Huolellinen asyyliradikaalin valinnan vaikutus on parhaiten selvitetty kahdessa viitteessä, jotka kuvaavat esteraasin spesifisyyttä estereiden suhteen, joissa asyyliradikaali käsittää N-suojatun aminohapon tai peptidin. 30 Näin ollen Janoff et ai., Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 136: 1045-1049 (1971) kuvaa, että alaniiniesterit ovat : 1· spesifisiä substraatteja ihmisen leukosyyteistä saadulle esteraasille. Erityisesti tämä referenssi opettaa, että '·.· uute ihmisen leukosyyttirakeista kykenee hydrolysoimaan 35 N-asetyyli-L-alanyyli-L-alanyyli-L-alaniinimetyylieste- 4 65990 riä. Lisäksi L-alaniini-p-nitrofenyyliesteri hydrolysoitui samoin, jolloin saatiin keltaista p-nitrofenoli-väri-muotoa.
Samoin Sweetman et ai., Jour. Hist. Soc., 22:327-5 339 kuvaa 1-naftyyli-N-asetyyli-DL-alaniinin, 1-naftyyli- N-asetyyli-L-alanyyli-L-alanyyli-L-alaniinin Ja 1-naftyy-libutyraatin käytön esteraasin läsnäolon toteamiseksi.
US-patentti n:o 4 278 763, Boehringer Mannheim GmbH, yhdistää nämä opetukset ja päätyy aminohappojen tai 10 peptidien indoksyyli- tai tioindoksyyliestereihin vielä yhtenä esimerkkinä traditionaalisesta värinmuodostussubs-traatista leukosyyttiesteraasiaktiivisuuden määrityksessä. Samoin kuin Janoffin ja Sweetmanin referenssit Boehringer in patentti kuvaa proteaasin ja esteraasin ekviva-15 lenttisuutta niiden esterolyyttisen vaikutuksen suhteen.
Kiihdvttimet
Tiedetään, että esterin hydrolyysireaktioita voidaan aktivoida monien nukleofiilisten aineiden, mukaan lukien monien alkoholien, läsnäololla. Näin ollen fenyy-20 liasetaatin ja o-nitrofenyyliasetaatin hydrolyysinopeus kasvaa 2,5-5,5-kertaiseksi metanolia tai butanolia lisättäessä. Greenzaid ja Jencks, Biochemistry, 10(7), 1210 -1222 (1971) . Lisäksi teho kasvaa n-alkyyliryhmän pituuden kasvaessa. Wynne ja Shalatin, Eur. J. Biochem., 25 31:554-560 (1972).
Erityisesti tämä alkoholien aktivointivaikutus on I havaittu aminohappoestereillä. o-nitrofenyyli-N-asetyyli- L-alaninaattihydrolyysiä aktivoidaan (kiihdytetään) meta-nolin läsnäololla. Fastrez ja Fersht, Biochemistry, 30 12(11), 2025 - 2034 (1973). Korkeamolekyylipainoiset al- : koholit lisäävät esteraasin aiheuttamaa hydrolyysinopeut- ta p-nitrofenyyli-t-BOC-L-tyrosinaatilla. Ashe ja Zimmer-mann, Biochem. and Biophys. Res. Comm., 75(1), 194 - 199 (1977). US-patentti 4 299 917 kuvaa muita tunnettuja es-35 terihydrolyysin aktivaattoreja, kuten tiettyjä metalli- * # komplekseja, pyridiinijohdannaisla ja imidatsoleja. 1 · 5 85990
Diatsoniumsuola-kvtkentäaineet
Tunnettua on myös tiettyjen diatsoniumsuolojen käyttö fenolien ja pseudofenolien kytkemiseen atsovärien tuottamiseksi. Martinet ja Dornier, Compt. Rend., 170, 5 592 (1920). Sellaista tekniikkaa käytetään esteraasiana- lyysissä, jolloin indoksyyliesterit hydrolysoidaan este-raasin kautta indoksyylin muodostamiseksi, joka vuorostaan kytketään diatsoniumsuolan kanssa vastaavan atsovä-rin tuottamiseksi. Holt ja Hicks, J. Cell. Biol. 29, 10 261 - 366 (1966); Gossrau, Histochemistry, 57, 323 - 342 (1978); DE-hakemusjulkaisu no. 30 17 721, julkaistu toukokuun 9:ntenä, 1980.
Diatsoniumsuolat, jotka tiedetään käyttökelpoisiksi kytkentäaineina leukosyyttien, esteraasin tai proteaa-15 sin havaitsemiseen tarkoitetuissa koostumuksissa, perustuvat eksogeeniseen anioniin diatsokationin vastaionina. Lisäksi tähän asti esitetyt formulaatiot kärsivät kukin jossakin määrin interferenssistä tai epätarkkuudesta, joka johtuu näytteessä läsnä olevista fenolisista tai muis-20 ta yhdisteistä, jotka kykenevät reagoimaan diatsoniumsuolan kanssa. Tällainen häiriö voi johtaa vääriin negatiivisiin tuloksiin.
Yhteenvetona tekniikan tasosta, joka johtaa tähän keksintöön, useita menetelmiä tunnetaan hydrolyyttisten 25 entsyymien ja leukosyyttisolujen testaamiseksi liuoksessa. Leukosyyttipopulaatioiden mittaamiseksi virtsasta on !'"! esimerkiksi mikroskopia ollut pitkään edullinen menetel mä. Näin ollen teknikon piti tehdä mikroskooppilevy virtsanäytteestä ja laskea leukosyyttisolujen lukumäärä mik-30 roskoopin näkökentässä; menetelmä joka vaatii kohtuutonta : ajankäyttöä ja kallista laitteistoa, kuten mikroskoopin ja sentrifugin.
Kemialliset ja biokemialliset tekniikat haastavat ;*·.· nopeasti mikroskoopin leukosyyttien tutkimiseksi diagnos- . 35 tiikassa ja ovat aikaa säästäviä välineitä tutkimuslabo- 6 85990 ratoriossa. Väriä tuottavat esterit, jotka ovat muodostaneet kulmakiven kemiallisissa testeissä, sisältävät seu-raavia alkoholi- ja asyyliosuuksia:
Alkoholi- (fenoli) osuudet asvvlirvhmät 5 indoksyyli asetaatti tioindoksyyli butyraatti p-nitrofenyyli lauraatti α-naftoli stearaatti aminohappo 10 peptidi Tällaisia estereitä käyttäviä kemiallisia menetelmiä on autettu erilaisilla hydrolyysikiihdyttimillä, sekä diatsoniumsuolakytkentäaineilla. Kiihdyttiminä on käytetty monia alkanoleja, sekä tiettyjä metallikomplek-15 seja, pyridiinijohdannaisia ja imidatsoleja. Diatsonium-kationit, joissa on sopivia eksogeenisia anioneja ioni-sesti niihin tai liittyneenä, ovat hyvin tunnettuja kyt-kentäaineina tällaisiin kemiallisiin menetelmiin, jolloin esterin hydrolyysissä muodostunut alkoholi (fenoli) on 20 kytketty diatsoniumsuolan kanssa atsovärin muodostamiseksi. Tunnetaan kuitenkin myös, että vääriä negatiivisia tai harhaanjohtavan alhaisia koetuloksia voi olla tuloksena häiriöstä diatsoniumsuolan kanssa, kun fenolit ja muut yhdisteet näytteessä reagoivat diatsoniumsuolan 25 kanssa.
Tämä keksintö koskee uutta testikoostumusta, laitetta ja menetelmää leukosyyttien, esteraasin tai prote-aasin läsnäolon määrittämiseksi testinäytteestä. Koostumukselle on tunnusomaista, että koostumus käsittää este-30 rin, joka muodostuu aromaattisesta fenolista tai pseudo- aromaattisesta fenolista ja haposta, joka pystyy kata-lyyttisesti hydrolysoitumaan leukosyyttien, esteraasin tai proteaasin läsnäollessa muodostaen fenolin, joka pystyy kytkeytymään diatso-zwitter-ionin kanssa, mainitun 35 esterin ollessa esim. 3-(N-tosyyli-l-alaninyylioksi)-5- » * » 7 85990 fenyylipyrroli tai -tiofeeni; ja diatsoniumsuolan, jonka rakenne on: jossa A' on anioni, kuten S03, ja R sama tai erilainen ja 10 on H, alempi alkyyli tai aryyli tai kumpikin R yhdessä muodostaa kondensoituneen rengassysteemin, ja R' on H, OH tai alempi alkyyli. Testilaite käsittää koostumuksen liitettynä kantajamatriisiin. Menetelmä käsittää laitteen saattamisen kosketukseen testinäytteen kanssa ja havait-15 tavan reaktion toteamiseen.
Tiettyjä tämän keksinnön kuvauksessa käytettyjä termejä on tässä kohdin mainittava sen varmistamiseksi, että lukija on tietoinen niiden merkityksistä. Näin ollen seuraavat määritelmät on tarkoitettu selkeyttämään tämän 20 keksinnön laajuutta ja mahdollistamaan sen formulointia ja käyttöä.
Ilmaisulla "aryyli" tarkoitetaan mitä tahansa aro-maattisuutta sisältävää rengassysteemiä. Ilmaisuun sisältyvät sellaiset 5- ja 6-jäseniset renkaat kuten pyrroli, 25 fenyyli ja pyridyyli, sekä kondensoituneet rengassystee- mit, kuten naftyyli. Näin ollen aromaattinen rengassys-teemi voi olla heterosyklinen tai homosyklinen, substitu-oitu tai substituoimaton, edellyttäen että substituentti-ryhmät (s') eivät vaikuta yhdistelmän kykyyn hydrolysoi-30 tua leukosyyttisolujen, esteraasin tai proteaasin läsnä-: ollessa. Sellaisten substituenttien valinta on laborato- - rion rutiinimääritys, joka on annettu tässä esityksessä.
Ilmaisu "alempi alkyyli" käytettynä tässä esityk-sessä, on alkyyliosuus, jossa on noin 1-6 hiiliatomia.
.··. 35 Alemman alkyylin merkitykseen sisältyvät metyyli, etyyli, β 65990 n-propyyli, isopropyyli, n-butyyli, sek-butyyli, tert-bu-tyyli ja kaikki pentyyli- ja heksyyli-isomeerit. Nämä voivat olla substituoimattomia tai ne voivat olla substi-tuoituja edellyttäen, että ne eivät häiritse yhdistelmän 5 tai testilaitteen kykyä havaita leukosyyttisoluja, este-raasia tai proteaasia.
Ilmaisu "kiihdytin" koskee mitä tahansa yhdistettä, joka nostaa tässä kuvattujen väriä tuottavien esterien hydrolyysinopeutta. Sellaisiin kuuluvat sellaiset 10 kemiallisesti erilaiset aineet, kuten pyridiini, imidat-soli ja niiden johdannaiset; metallikompleksit, joiden kaava on D„[ (CN)n(N0)p], jossa D on alkalimetalli, B on raskasmetalli-ioni, P on 0 tai 1, m on 2 - 5, n on 4 - 8, ja m on n:n ja B:n valenssin summa; ja alkoholit. Sopi-15 vissa alkoholeissa on 1 noin 15 hiiliatomia. Lineaariset alkoholit ovat edullisempia haaroittuneisiin alkoholeihin verrattuna, vaikkakin jälkimmäiset kuuluvat keksinnön laajuuteen.
"Kondensoituneilla rengassysteemeillä" tarkoite-20 taan kahta tai useampaa aromaattista rengasta, joilla on yhteinen hiiliatomipari. Esimerkiksi rakenteessa: n2+ 25 (Π) : kumpikin R voi yhdessä muodostaa kondensoituneen rengas- systeemin : 30 ·· y
@ör°H
35 SO," o 9 85990 jossa kumpikin R yhdessä muodostavat -(CH)4-. Vielä toinen esimerkki on: so3- 10 jossa kumpikin R yhdessä muodostaa ryhmän -(CH=CH-CH=N)-. Näin ollen kondensoitunut rengassysteemi on polynukleaarinen, aromaattinen ja voi olla heterosyk-linen tai homosyklinen.
Kuvaus "havaittava reaktio" tarkoittaa tässä muu-15 tosta tai sellaisen parametrin esiintymistä testilaite-systeemissä, joka voidaan nähdä, joko suoralla tarkkailulla tai instrumentaalisesti; ja joka on spesifisen ana-lyytin läsnäolon funktio vesipitoisessa testinäytteessä. Eräitä havaittavia reaktioita ovat muutos värissä tai vä-20 rin ilmeneminen, fluoresenssin, reflektanssin, pH:n, ke-miluminesenssin ja infrapunaspektrin ilmeneminen.
Termi "anionl" tässä käytettynä sisältää ryhmät, jotka ovat negatiivisesti varautuneita välillä noin 7 -10 olevissa pH-arvoissa ja jotka ovat sitoutuneet kova-25 lenttisesti renkaaseen, kuten on kuvattu rakenteessa (I). Anionimääritelinään kuuluvat sulfonyyli, karbonyyli ja fosfonyyli. Mukaan kuuluvat myös alemmat alkyyli- ja aryyliryhmät, jotka ovat kovalenttisesti substituoituja ryhmillä, jotka pystyvät varautumaan negatiivisesti, ja *’·**· 30 jotka substituoidut ryhmät ovat itse kovalenttisesti si- ; * toutuneet rakenteen (I) renkaaseen. Jälkimmäinen sisältää : sellaiset erilaiset muodot kuin n-heksyyli-6-sulfonaatti, fenyylikarbonaatti ja n-propyyli-3-fosfonaatti.
35 10 85990
Koostumus
Keksinnön mukainen koostumus sisältää esterin ja diatsoniumsuolan. Vaikka näiden aineosien valitsemisessa on laajalti varaa, kustakin on edullisia toteutuksia, 5 joilla saadaan maksimitulokset, so. selvästi havaittava reaktio, joka kehittyy lyhyessä ajassa. Tätä optimointia voidaan vielä edelleen edistää lisäämällä koostumukseen kiihdytintä.
Esteri 10 Sekä koostumus että keksinnön mukainen testilait- teisto sisältää pseudoaromaattisen tai aromaattisen fenolin ja hapon esteriä. Lisäksi esteri on sellainen, joka voidaan hydrolysoida katalyyttisesti leukosyyttien, este-raasin tai proteaasin läsnäollessa, jolloin saadaan feno-15 lia tai pseudofenolia, joka on sitten vapaa kytkeytymään diatso-kahtaisionin kanssa.
Eräisiin estereihin, jotka ovat sopivia käytettäviksi keksinnön yhteydessä, lukeutuvat indoksyyliasetaat-ti, indoksyylibutyraatti, indoksyylilauraatti, indoksyy-20 listearaatti, N-suojatun aminohapon tai peptidin indok-syyliesteri ja niiden tioindoksyylianalogit. Mukaan lukeutuu myös p-nitrofenyyli-N-tosyyli-L-alaninaatti, a-naftyyli ja alaninaatti. Vielä muita esimerkkejä esteristä ovat sellaiset, joiden rakenne on: 25
R* ""s-S °“A
,χτ 30 jossa A on esterin muodostavan hapon jäännös ilman karak- teristista hapanta -OH -ryhmäänsä, R on alempi alkyyli, aryyli, karboksyyli, karboksyyliesteri, amidi tai syaani-ryhmä, R* on H, alempi alkyyli tai aryyli ja X on 0, S tai NR*. Kuvaus "happojäännös" sisältää fosfori-, sulfoni-, 35 hiilihappo- ja karboksyylihappojäännöksen, so.
11 85990 9H 9 o oh —p=0» —S, —C ja — C—R*. H0-C*0
OH O OH
5 vastaavasti. Estereihin, jotka vastaavat rakennetta (V), lukeutuvat 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-fenyylipyrro-li, l-metyyli-3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-fenyyli-pyrroli, 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-(p-kloorifenyy-10 li)pyrroli Ja 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-fenyyli-tiofeeni.
Kiihdytin Tämän keksinnön mukainen koostumus voi sisältää esterin lisäksi erilaisia kiihdyttimiä, kuten sellaisia, 15 joita on määritetty aiemmin. Alkoholit on havaittu erityisen hyödyllisiksi tässä esitetyn esterien esteraasi-ja proteaasi-katalysoidun hydrolyysin nopeuttamiseksi. Alkoholit, joissa on 8 - 15 hiiliatomia, ovat edullisia tähän tarkoitukseen, kun taas dekanoli, undekanoli ja do-20 dekanoli ovat edullisia käytettäviksi testilaitteessa, pääasiallisesti niiden alhaisen haihtuvuuden takia verrattuna alkoholeihin, joilla on alhaisempi molekyylipai-no.
Diatsoniumsuola 25 Koostumus sisältää tiettyä diatsoniumsuolaa kyt- kentäaineena. Diatsoniumsuolan osallistumista koko reak-tiomalliin voidaan esittää seuraavalla esimerkillä: L': 30 **1—if°'A κ*Ίϊ—f
Il \\ analyytti ^ V J + hO-A R*V.-R* _^0H (VH) 1 J ♦ ArNsN -> ΓΊΓ R X R^N^N-N-Ar
. dD
i2 85990 jossa ArN*s N on diatsoniumsuola (I), ja A, R, R* ja X ovat edellä määriteltyjä. Reaktiotuote VII on atsoväriai-ne, joka voi antaa syvän, selvästi erottuvan värin.
Näin ollen kahtaisioni on diatsoniumsuola, jossa 5 diatsoniumryhmän vastaioni on kovalenttisesti sitoutunut rengassysteemiin. Esimerkkeihin sellaisista anioneista lukeutuvat sulfonyyli (S03‘), karbonyyli (C02*), fosfonyy-li (P03') ja muut. Kaavan (I) piiriin kuuluvat sellaiset yhdisteet kuin l-diatsonaftaleeni-4-sulfonaatti, 1-diat-10 so-2-naftoli-4-sulfonaatti, l-diatsofenyyli-3-karbonaatti ja monet muut. On havaittu edullisimmaksi käyttää 1-di-atso-2-naftoli-4-sulfonaattia.
Testilaitteisto
Yllä kuvattua koostumusta voidaan käyttää sellai-15 senaan leukosyyttien, esteraasin tai proteaasin määritykseen, tai se voidaan yhdistää kantajamatriisiin testime-kanismin muodostamiseksi, ja näin ollen saadaan väline nopeaan, luotettavaan analyytin läsnäolon arviointiin. Kantajamatriisi on tavallisesti, mutta ei välttämättä, 20 huokoinen aine, kuten suodatinpaperi. Muita alalla ha vaittuja kantajamatriisiaineiden muotoja ovat huopa, huokoiset keraamiset liuskat, ja kudotut tai puristetut lasikuidut (US-patentti n:o 3 846 247). Myös puun, kankaan, sienimateriaalin ja savimaisten aineiden (US-patentti n:o 25 3 552 928) käyttöä on ehdotettu. Vaihtoehtoisesti kanta jamatriisi voi olla eihuokoinen, kuten erilaiset polymee-riset kalvot, lasi jne. Kaikki tällaiset kantajamatrii-·] siaineet ovat edullisia käytettäväksi tässä keksinnössä, kuten muutkin. On havaittu, että suodatinpaperi on eri-: 30 tyisen sopiva.
Edullisessa menetelmässä laitteiston valmistamiseksi pala suodatinpaperia kastellaan puskurin vesiliuok-sella. Ensimmäinen kastamisliuos voi sisältää myös erilaisia prosessointilisäaineita, kuten detergenttiä, liis- , 35 tausainetta, kuten polyvinyylipyrrolidonia, ja muita inerttejä aineosia.
i3 85990
Impregnoitu suodatinpaperi kuivataan sitten ja kastellaan toisella kasteluliuoksella, asetonissa tai muussa esterin ei-vesiliuoksessa, ja haluttaessa kiihdyttimessä ja/tai diastoniumsuolan ei-vesiliuoksessa. Sitten 5 kahdesti impregnoitu paperi kuivataan toisen kerran, ja näin muodostuu testilaite, joka on herkkä leukosyyttien tai muiden analyyttien läsnäololle.
Kuivattu, reagenssia sisältävä kantajamatriisi voidaan panna taustamateriaalille, jos niin halutaan.
10 Näin ollen edullisessa toteutuksessa testilaitteesta, suodatinpaperikantaja-matriisi liitetään koostumukseen, kuten on kuvattu yllä, ja matriisi kiinnitetään yhdeltä sivulta pitkään palaseen läpinäkyvää polystyreenikalvoa. Matriisi kiinnitetään kalvoon millä tahansa sopivalla ta-15 valla, kuten kaksipuolisella liimanauhalla (Double Stick® saatavana yhtiöltä 3M), ja polystyreenikalvon toinen pää toimii kädensijana. Käytössä tällaista laitetta pidetään polystyreenifilmi-taustamateriaalin vapaasta päästä, ja matriisipää upotetaan testinäytteeseen (esim. virtsaan) 20 ja poistetaan nopeasti. Värinmuodostus tai muu havaittava reaktio havaitaan edeltä määrätyn ajan kuluttua ja verrataan referenssistandardiin, joka vastaa tiettyjen leukosyyttien tai muun analyytin konsentraatioiden reaktioita tai proteaasiaktiivisuutta. On havaittu, että noin 1-3 25 minuutin inkubointiaika on tavallisesti riittävä värin I"I kehittymiseen reagenssipitoisessa suodatinpaperissa.
Seuraavat esimerkit on annettu lukijan avustamiseksi edelleen tämän keksinnön toteutuksessa ja käytössä. Näin ollen edullisia toteutuksia kuvataan kokeellisin yk-: 30 sityiskohdin ja tulokset analysoidaan. Esimerkit on tar- koitettu vain kuvaaviksi, ja niiden ei ole millään tavalla tarkoitettu rajoitettavan tässä kuvatun ja vaaditun : keksinnön suojapiiriä.
Seuraavassa kokeellisessa osassa käytetään lyhen-• _ 35 nyksiä seuraavasti: 14 85990 g = gramma kg = kilogramma 1 = litra ml = millilitra 5 M = molaarinen mM = millimolaarinen N = normaalinen eq = ekvivalentteja mol = molekyylikaavan ilmoittama grammamäärä 10 (mooleja) mmol = molekyylikaavan ilmoittama grammamäärä x 10'3 (millimooleja) aq = vesipitoinen h = tunti 15 TLC = ohutkerroskromatografia
Infrapuna (IR) -spektrit saatiin Perkin Elmer Model 7108 tai 237 infrapunaspektrometrillä liuoksina CHCl3:ssa, ellei ole toisin ilmoitettu; polystyreenikal-von 1602 cm'1 aallonpituusaluetta käytettiin ulkoisena 20 kalibrointistandardina. Signaalit on raportoitu cnf^nä.
Protonimagneettiset resonanssispektrit (3H NMR) saatiin 89,55 MHztn taajuudella käyttäen JEOL FX-900-spektrometriä tai 60 MHz taajuudella käyttäen Varian T-60 spektrometriä; spektrit saatiin CDCl3-liuoksessa, 25 ellei toisin ole ilmoitettu. Kemialliset siirtymät on raportoitu sigmayksikköinä alakenttään sisäisestä standardista tetrametyylisilaanista.
^ Hiili-13 -magneettiset resonanssispektrit (13C NMR) saatiin 22,5 MHz;n kohdalla käyttäen JEOL : 30 FX-900 spektrometriä, jossa on Fourier-transformaatio ja täysi protonin leveän huipun häiriönpoisto; spektrit saatiin CDCI3-liuoksessa, ellei ole toisin ilmoitettu. Hii-lisiirtymät raportoidaan miljoonasosina alakenttään si-säisestä standardista tetrametyylisilaanista.
* . 35 is 6 5 990
Massaspektrit (MS) saatiin Hewlett-Packard 5985A-spektrometrillä, joka toimii elektroni-isku (EI) tai nopea-atomipommi tuksella (FAB). Korkean resoluution massa-spektrit saatiin AEI MS-902 -spektrometrillä.
5 Orgaaniset reagenssit saatiin Aldrich Chemical
Company'stä ja niitä käytettiin puhdistamatta, ellei ole toisin ilmoitettu. Epäorgaaniset reagenssit olivat ACS-reagenssiastetta Fisher Scientific Company'stä tai muulta suurelta tuottajalta. Reaktioliuottimet olivat ACS-rea-10 genssipuhtautta; tetrahydrofuraani (THF) oli HPLC-astetta J.T. Baker Chemical Company'stä. Suolavesi vastaa kyllästettyä natriumkloridin vesiliuosta.
Ohutkerroskromatografia (TLC) suoritettiin käyttäen silikageeli-60F-254 -levyjä E. Merckiltä. Pylväskro-15 matografia suoritettiin käyttäen E. Merckin Silica Gel 60 (70-230 mesh). Kaikki sulamispisteet ja kiehumispisteet on raportoitu korjaamattomina.
Eräiden pseudofenollestereiden valmistus
Seuraavat kokeet suoritettiin kuvaamaan sellaisten 20 esterien synteesiä, jotka ovat hyödyllisiä tässä keksinnössä. Vaikka nämä kokeet viittaavat tiettyihin lähtöaineisiin ja lopputuotteisiin, uskotaan, että menetelmät ovat sovellettavissa laajaan alueeseen tässä kuvattuja esterilajeja.
- 25 3-(N-toswli-L-alaninvwlioksi )-5-fenwliPvrrolin (4) synteesi 3-(N-tosyyli)-L-alaninyylioksi)-5-fenyylipyrrolin synteesiä kuvataan seuraavassa reaktiokaaviossa: 85990
/ C0CIH ^COOH
5 KHSO,, H2Q _ HC1 asetcni* NaHCO-
KOH
10 V
^C0°-K+ U) /Η-™** KOH, 2H,0 · <( jVcH' J]7° 0 N-CH?-COOH + \( )|
1= ^ ^coovt^p M
Ac20
Pyr Idiini 12CPC
Ψ- 20 „ , ^011 _-Ac --s'
NaOH/MeOH ,Χ^Ν,Αν S
. „ »> Or I 0" «, 25 ^ Ac + 30 : 0 II 0 _¢, O-C-CH-CIl- || «> ^fj a cl-c-i"-™3 (^Yf' II \« pyridilni · TTA /\ 35 ^ " 1,0 c 11 Ts 17 85990 N-tosyyli-L-alaniini L-alaniinia (100 g, 1,11 mol) liuotettiin 2,25 litraan 1 N natriumhydroksidia (aq), jäähdytettiin 5°C:seen ja sekoitettiin, kun p-tolueenisulfonyylikloridia (218 g, 1,11 mol) 5 liuotettuna 450 ml:aan tolueenia lisättiin hitaasti. Seosta sekoitettiin ympäristön lämpötilassa 20 tuntia. Kerrokset erotettiin, ja jäinen vesikerros tehtiin happamaksi pH 1:een väkevällä vetykloridihapolla. Valkea, kiinteä otsikon yhdiste otettiin talteen suodattamalla, pestiin vedellä ja kuivat-10 tiin. Saanto 178,5 g (66 %) , sp. 134-5°C. IR (CHC13) cm 1 1726, 1340, 1 165, 1095; 1H NMR (DMSO-Dg) ¢(1,20 (d, J = 7, 3H), 2.40 (s, 3H), 3,85 (p, J = 8, 1H), 6,4 (br S, 1H) (C02H), 7.41 (d, jab=8, 2H) ja 7,75 (d, JAB=8, 2H) (mallin keskus 7,58; AVAB = 20,49 Hz), 8,02 (br d, J = 8, 1H) (NH) .
15 N-tosyyli-L-alaninyylikloridi
Menetelmä A
Seosta, jossa oli N-tosyyli-L-alaniinia (12,4 g; 0,05 mol) ja tionyylikloridia (25 ml), lämmitettiin 90 minuuttia 55°C:ssa, ja konsentroitiin sitten pyörivässä haihdutti-20 messa 40°C:ssa. Punainen kiinteä jäännös liuotettiin 200 ml:aan kiehuvaa CCl^, väri poistettiin 20 g:11a uunissa kuivattua Norit^211 (American Norit Co., Inc.), suodatettiin ja jäädytettiin. Kermanvärinen kiinteä, otsikon mukainen tuote otettiin talteen suodattamalla, pestiin heksaanilla ja 25 kuivattiin. Saanto 8,48 g (65 %) , sp. 101-101,5°C, IR (CHCl^) cm“1 3360, 3260, 3025, 1775, 1605, 1350, 1170, 910; 1H NMR (CDC13)S 1,48 (d, J = 7, 3H), 2,43 (s, 3H), 4,33 (p, J = 8, 1H), 5,93 (br d, J = 8, 1H) (NH), 7,31 (d, JftB = 8, 2H) ja 7,76 (d, JAB = 8, 2H) (mallin keskiosa 7,53; AVAB = 26,83 Hz). 30 Analyysi, laskettu C^H^ClNO^S^le: C, 45,89 H, 4,62 N, 5,35 havaittu: C, 46,63 H, 4,90 N, 5,19
Menetelmä B
- Seosta, jossa oli N-tosyyli-L-alaniinia (3,1 g; 13 : : : mmol) ja tionyylikloridia (6 ml) lämmitettiin 90 min 50°C:ssa, 35 laimennettiin sitten 50 ml:11a kuivaa heksaania. Seosta sekoitettiin nopeasti, jäähdytettiin ja kiinteä tuote suodatettiin.
18 85990
Saanto 3,15 g (93 %), sp. 99-100°C. IR-spektri oli identtinen menetelmällä A valmistetun uudelleenkiteytetyn materiaalin spektrin kanssa.
2-hydroksi-3-(karboksimetyyliamino)-hydrokanelihapon 5 dikaliumsuoladihydraatti (1)
Sekoitettua lietettä, jossa oli 1,0 kg trans-kanelihapon happoa (6,75 mol) 4,5 l:ssa asetonia, käsiteltiin ensin NaHCO^illa (2,47 kg; 29,4 mol, 4,36 eq) ja sitten varovasti vedellä (4,5 1). Saatua paksua seosta käsiteltiin tipoittain 10 1,5-2,0 tunnin aikana liuoksella, jossa oli OXONE ® -mono- sulfaattiyhdistettä (3,78 kg; sisältää 1,825 eq KHSO^) 0,4 mM:ssa dinatriumetyleenidiamiini-tetraetikkahapon (EDTA) vesi-liuoksessa (14,5 1; valmistettu liuottamalla 2,17 g dinatrium-EDTA-dihydraattia 14,5 l:aan tislattua vettä). Tämän lisäyk-15 sen aikana reaktiolämpötila pidettiin välillä 24-27°C vesi-haudetta käyttämällä; reaktion pH havaittiin olevan noin 7,4. Kun lisäys oli saatu loppuun, seosta sekoitettiin vielä 0,5 tuntia, jäähdytettiin sitten noin 10°C:seen. Seos tehtiin happamaksi väkevällä HCl:lla (noin 1,2 1) kunnes pH oli 20 2, ja lämpötila pidettiin samalla noin 10°C:ssa, ja käsitel tiin sitten CH2Cl2:lla (5,05 1) ja sekoitettiin voimakkaasti 10 minuuttia.
Kun seoksen oli annettu laskeutua, vesipitoinen kerros dekantoitiin pois, ja orgaaninen kerros, joka sisälsi liuke-·;· 25 nemattomia suoloja, suodatettiin paperin läpi imun avulla.
Suodatetut kiinteät aineet pestiin CH2Cl2:lla (1,9 1) ja vesipitoinen kerros uutettiin tällä suodoksella. Suodatetut kiinteät aineet pestiin taas C^Cljslla (3,15 1) ja vesipitoinen kerros uutettiin tällä suodoksella. Yhdistetyt 30 C^C^-kerrokset uutettiin liuoksella, jossa oli KOH
(593,3 g) vedessä (6,31 1) - lievää lämmitystä noin 40°C:een vaaditaan usein kiinteän aineen liuottamiseksi, joka aine ! voi erottua emäsuuton aikana. CH2Cl2-kerros uutettiin sitten V ; liuoksella, jossa oli KOH (99 g) vedessä (1,51) ja yhdis- ____: 35 tetyt emäsuutteet käsiteltiin glysiinillä (481,7 g, 6,416 mol; 0,95 eq.); orgaaninen kerros heitettiin pois.
i9 85990
Liuoksen pH säädettiin 11,5 reen 25 %:lla KOHrn vesi-liuoksella ja lämmitettiin sitten kiehuvaksi. Noin 900 ml alhaalla kiehuvaa nestettä (asetonia ja vettä) tislattiin pois, kunnes höyryn lämpötila oli 99°C, minkä jälkeen seosta 5 refluksoitiin 2 tuntia. Jäähdytyksen jälkeen reaktioseos uutettiin CH2Cl2:lla (3,15 1), CH2Cl2-faasi heitettiin pois, ja vesifaasi haihdutettiin kuiviin alipaineessa 70°C hauteessa. Jäännöstä keitettiin 95 % EtOHrssa (8,83 1) 30 minuuttia, annettiin sitten jäähtyä hitaasti sekoittaen, jol-10 loin tuote erottuu hienoina kiteinä. Nämä suodatettiin, pestiin tuoreella 95 % EtOHrlla (1,26 1) ja kuivattiin 50-60°C uunissa, jolloin saatiin otsikon yhdistettä (1,77 kg; 74,6 %) valkeina kiteinä, joiden sp. = 120-2°C (korjaamaton).
IR (KBr) cm"1 3420 (br), 1590 (br), 1410, 1130, 710; 15 1H N MR (D20-TSP) <(3,1 (s, 2H) , 3,89 (d, JftB = 4, 1H) ja 4,52 (d, J^ = 4,1 H) (mallin keskus 4,21; = 18,83 Hz), 4,68 (s, 6H, vaihdettavat protonit) 7,4 (s, 5H); TLC Rf = 0,59 (EtOHrlM trietyyliammoniumbikarbonaatti, 7:3).
Anal, laskettu C1 ^ 5NC>7K2: lie: C, 37,59 H, 4,30 N, 3,99 20 Havaittu: C, 37,22 H, 4,24 N, 3,96 N-asetyyli-3-asetoksi-5-fenyylipyrroli (2)
Suspensiota, jossa oli 2-hydroksi-3-(karboksimetyyli-amino)-hydrok anelihapon dikaliumsuola-dihydraattia (1) (1,0 kg; 2,84 mol) pyridiinissä (3,0 1) käsiteltiin etikka-·· 25 hapon anhydridillä (4,0 1) ympäristön lämpötilassa, inertti- kaasukehässä. Seurauksena oli lievä eksoterminen reaktio, ja reaktiolämpötila nousi eksponentiaalisesti 60-70°C:seen 1,5-2,5 tunnin kuluessa. Kun reaktio alkoi jäähtyä, seosta lämmitettiin 120-123°C:seen 15 minuuttia, annettiin sitten 30 jäähtyä ympäristön lämpötilaan 1 tunnin aikana, jona aikana pyridiniumasetaatti erottui kiteinä. Seosta suodatettiin paperin läpi imun avulla, ja suolat pestiin EtOACrlla, kunnes ne olivat värittömiä; suodos haihdutettiin kuiviin va-' kuumissa.
____: 35 Tummanpunainen jäännös liuotettiin EtOACrlla (3,0 1), pestiin kolme kertää vedellä (1,0 1 kukin), kuivattiin 2o 85990
MgSO^rllä ja käsiteltiin Darco ®-G60:11a (Aldrich Chemical Co) (300 g). Kun oli sekoitettu 30 minuuttia, seos suodatettiin Celite® :n läpi (Fisher Scientifix) ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin punertavan-oranssia öl-5 jyä. Tämä öljy liuotettiin lämpimään 2-propanoliin (1,2 1), annettiin sitten jäähtyä hitaasti ympäristön lämpötilaan yön aikana, jolloin kiinteä aine erottui. Kiteinen tuote suodatettiin, pestiin 50 % 2-propanolin vesiliuoksella ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin otsikon yhdistettä (417 g; 10 60 %), sp. 58-60°C (korjaamaton). Annos otettiin Et20:hon, käsiteltiin Norit 211:11a, suodatettiin ja konsentroitiin alipaineessa; seisotettiin 0°C:ssa, jolloin erottui värittömiä pieniä neuloja. Ne suodatettiin, pestiin Et20/heksaa-nilla (1:1) ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin ana-15 lyyttinen näyte, jonka sp. = 60-62,5°C (korjaamaton).
IR (CHC13) cm"1 3020, 1760, 1730, 1595, 1378, 1320, 1220 (br) , 1030, 960, 903; 1H NMR (CDCl3) £2,23 (s, 3H) , 2,27 (2, 3H), 6,18 (d, J=2, 1H), 7,35 (s, 5H), 7,42 (d, J=2, 1H); TLC Rf = 0,56 (tolueeni:dioksaani 4:1).
20 Anal, laskettu C3N03:lie: C, 69,12; H, 5,38; N, 5,76 havaittu: C, 68,88; H, 5,25; N, 5,53.
3-hydroksi-5-fenyylipyrroli (3)
Hienoksi jauhetusta osasta N-asetyyli-3-asetoksi-5-fenyylipyrrolia (2) (36,8 g; 0,15 mol) poistettiin happi 25 sekoittamalla sitä virtaavassa argonissa 10 minuuttia, suspen-doitiin se sitten hapettomaan MeOH:iin (379 ml), jäähdytettiin -6°C:seen (-15°C metanoli (MeOH)/kuiva jää -hauteessa) inerttikaasukehässä ja käsiteltiin nopeasti jääkylmällä hapettomalla 2N NaOH-liuoksella (300 ml). Reaktiolämpötila nousi 30 välittömästi emäksen lisäämisen jälkeen 18°C:seen, ja 3 minuutin kuluttua reaktioseos tuli homogeeniseksi. Kun reaktio-seos jäähtyi, yhdiste (3) erottui hienoina kiteinä. 15 mi-:nuutin kuluttua lisättiin kylmää hapetonta 2M sitruunahappoa (150 ml), saatua seosta sekoitettiin 10 minuuttia ja suoda-35 tettiin sitten. Kiinteä aine pestiin läpikotaisin hapettomalla vedellä (200 ml) pitäen huolta siitä, että tuote joutui 21 85990 tekemisiin ilman kanssa mahdollisimman vähän, kuivattiin sitten vakuumissa yön yli, jolloin saatiin otsikon yhdistettä (22,3 g; 93,6 %) vaaleanpunaisina pieninä neuloina.
IR (KBr) cm~1 3400, 3110, 2900, 1600, 1580, 1555, 1480, 5 1268, 1180, 742, 640; 1H NMR (DMSO-D6) 56,1 (m, 1H), 6,3 (m, 1H), 7,0-7,7 (m, 5H), 8,0 (s, 1H), 10,4 (br s, 1H); TLC Rf = 0,20-0,28 (EtOH:CHCl3, 1:9).
Anal, laskettu C1()H9NO:lle: C, 75,45; H, 5,70; N, 8,80 havaittu: C, 75,30; H, 5,69; N, 8,67.
10 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-fenyylipyrroli (4)
Liuosta, jossa oli vedetöntä tetrahydrofuraania (THF, 450 ml), pyridiiniä (43,8 ml; 0,542 mol; 1,2 eq) ja tri-fluorietikkahappoa (85,0 ml; 1,10 mol; 2,4 eq) ja jota pidettiin 0°C:ssa inerttikaasukehässä, käsiteltiin yhdellä annok-15 sella 3-hydroksi-5-fenyylipyrrolia (3) (71,5 g; 0,45 mol; 1,0 eq) ja sen jälkeen välittömästi lisättiin tipoittaan 5-10 minuutin aikana liuosta, jossa oli juuri valmistettua N-tosyyli-L-alaninyylikloridia (141,0 g; 0,54 mol; 1,2 eq) vedettömässä THF:ssa (450 ml). Saatua seosta sekoitettiin 20 15 minuuttia 0°C:ssa. Sitten reaktio jäähdytettiin lisäämällä liuosta, jossa oli 1,OM sitruunahapon vesiliuosta (315 ml) ja EtOAc (1,35 1). Lyhyen sekoitusajan jälkeen faasit erotettiin ja orgaaninen kerros pestiin NaCl:n vesiliuoksella (360 ml; 0,18 g NaCl per ml vettä). Sitten orgaaninen kerros uu-25 tettiin kahdesti 5 % NaHC03:n vesiliuoksella (kumpikin 1,35 1) ja pestiin sitten vielä annoksella NaCl:n vesiliuosta (360 ml? 0,18 g NaCl per ml vettä). Punertavanruskeaa orgaanista kerrosta sekoitettiin ympäristön lämpötilassa 15 minuuttia MgSO^ (101 g) ja Darco-G60:n (143 g) kanssa, suodatettiin sitten 30 Celiten läpi ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa 37°C hauteesta, jolloin saatiin (4) punertavanvalkoisena kiinteänä aineena. Raaka tuote jauhettiin pulveriksi ja liuotettiin lämpimään (50°C) THF:iin (250 ml), sekoitettiin voimakkaasti ja laimennettiin n-heksaanilla (250 ml). Sekoitusta jatket-35 tiin 1 tunti ympäristön lämpötilassa, kun tuote kiteytyi.
Kiinteä aine suodatettiin, pestiin tolueenilla (noin 1,0 1), 22 85990 kunnes suodos oli väritöntä, kuivattiin vakuumissa yön yli, jolloin saatiin otsikon yhdistettä (112 g; 65 %) valkeana pulverina, sp. = 154,5 - 155°C.
IR (KC1) cm"1 3350, 3325, 1760, 1508, 1320, 1155, 770; 5 1H NMR (DMSO-d6)& 1,33 (d, J=7, 3H), 2,36 (2, 3H), 4,13 (p, J=8, 1H), 6,25 (m, 1H), 6,73 (m, 1H), 7,05-7,50 (m, 5H),
7,5-7,85 (m, 4H), 8,42 (d, J=8, 1H), 11,18 (br s, 1H); 13C NMR (DMSO-d6) ppm 18,335, 21,001, 51,370, 98,061, 108,336, 123,423, 126,024, 126,610, 128,560, 128,756, 129,601, 132,397, 137,600, 10 138,380, 142,737, 169,919; D = “70° (c = 1,11 MeOH); TLC
Rf = 0,45 (EtOAx:heksaani, 1:1); TLC Rf = 0,40 (tolueeni: dioksaani, 4,1)
Anal, laskettu C2()H20N2O4S:lle: C, 62,48; H, 5,24; N, 7,29 havaittu: C, 62,62; H, 5,27; N, 7,30.
15 3-(N-tosyylialaninyylioksi)-5-fenyylitiofeenin (9) synteesi
Suoritettiin sarja kokeita 3-hydroksi-5-fenyylitio-feenin valmistamiseksi pienimmillä modifikaatioilla raportoiduista kirjallisuuden menetelmistä, seuraavalla sivulla esi-20 tettynä. Saatu hydroksitiofeeni asyloitiin sitten N-tosyyli-L-alaninyylikloridillä, jolloin saatiin vastaavaa N-tosyyli-L-alaninaattiesteriä, saanto 46 % (ei-optimoitu menetelmä).
23 85990
/ COOC2"5 _γ O
, Or ~ Or1 w
a. Na2S
b. BrCII2COO!l 10 I p"-8'7 8 _^O-C-CH, ,_ /sjrT a=2° ^J72$~C00" „ 0rs ^ Oi to
NaOH
h2o
MeOH
20 9 ,, Cl-C-CH-CHj n X ^^ O-C.Ci.-CH3 , 2S fij <·> ~s^r~* O* H Ts- pyridiini 3-fenyyll-1,2-dltia-3-syklopenten-5-oni (5) Suspensiota, jossa oli 10 g etyylikinnamaattia 30 (56,82 mmol) ja 10 g rikkiä, lämmitettiin 250°C:ssa neljä tuntia 50 ml pullossa, jossa oli tislauspää ja vastaanottaja reaktion aikana valmistuneen etanolin poistamiseksi. Reaktio-seoksen annettiin sitten jäähtyä 100°C:seen ja lisättiin * * : 500 ml:aan refluksoituvaa etanolia. Saatu sakka suodatettiin ' - 35 ja hierrettiin peräkkäin 500 ml kanssa kiehuvaa asetonia ja kahdesti 500 ml annoksilla etanolia. Yhdistetyt päällä olevat 24 85990 liuokset konsentroitiin mustaksi kiinteäksi aineeksi, joka kiteytettiin metanolista tummanruskeiksi neuloiksi. Toinen uudelleenkiteytys metanolista käyttäen Noritia ja suodatus Celiten läpi antoi 2,023 g vaaleankeltaisia neuloja, sp.
5 113-115°C.
IR (KBr) cm-1 1650, 1550, 1390, 1350, 1130, 770; 1H N MR (60m Hz, CDC13)/ 6,92 (s, 1H9, 7,58 (m, 5H) ; TLC Rf = 0,5 (dikloorimetaani).
Anal, laskettu CgHgC^Sille: C, 55,64; H, 3,11 10 havaittu; C, 55,53; H, 3,47 cis-4-keto-6-fenyyli-3,7-ditia-5-noneenidihappo (6) Sulaa liuosta, jossa oli 35,48 g natriumsulfidi-nona-hydraattia (148 mmol) 94°C:ssa, käsiteltiin 6,65 g:11a 3-fe-nyyli-1,2-ditia-3-syklopenten-3-onia (5) (34,23 mmol) lisät- 15 tynä annoksittain viiden minuutin aikana. Viidentoista minuutin kuluttua seos lisättiin jääkylmään liuokseen, jossa oli 43,6 g bromietikkahappoa (314 mmol) 60 ml:ssa Η30, pH säädettynä arvoon 8,7 natriumkarbonaatilla. Saatua liuosta pidettiin 0°C;ssa, pH 8,7:ssa 45 minuuttia, ja suodatettiin sitten. 20 Päällä oleva liuos pidettiin 0°C:ssa ja tehtiin happameksi pH 3,7:ään 5N HCl-liuoksella. Saatua seosta sekoitettiin yön yli 5°C:ssa. Päällä oleva liuos dekantoitiin sitten, ja saatua öljyä hierrettiin eetterin kanssa, öljy haihdutettiin tolueenin kanssa, kunnes saatiin 6,98 g väritöntä vaahtoa 25 (65 %) . Tätä ainetta käytettiin puhdistamatta edelleen.
: Päällä olevasta eetteriliuoksesta saatiin analyyttinen näyte, joka konsentroitiin, haihdutettiin peräkkäin etikka- ____ hapon ja tolueenin kanssa ja hierrettiin eetterin kanssa, jolloin saatiin ruskeita kietiä, sp. 142,5-150°C.
30 IR (KBr) cm’1 1705, 1655; 1H NMR (60 MHz, DMSO-Dg) ^2,06 (s, CH^COjH epäpuhtaus) 3,30 (s, 2H), 3,77 (s, 2H), 5,67 (m, 2H) (OH) , 6,37 (s, 1H) , 7,43 (m, 5H) ; TLC Rf = 0,85 (kloroformi:metanoli:etikkahappo, 5:5:1).
Anal, laskettu ci3Hi2S2°5:^e: C, 50,00; H, 3,88 35 havaittu: C, 50,26; H, 3,98 25 85990 3-hydroksi-5-fenyylitiofeeniasetaatti (7)
Voimakkaasti sekoitettua suspensiota, jossa oli 3,40 g raakaa cis-4-keto-6-fenyyli-3,7-ditia-5-noneenidihappoa (6) (10,9 mmol), 3,40 g natriumasetaattia (41,5 mmol), ja 30 ml 5 etikkahapon anhydridiä, lämmitettiin refluksointilämpötilaan yhden tunnin ajan. Seoksen annettiin jäähtyä ja se suodatettiin sitten ja haihdutettiin, jolloin saatiin mustaa öljyä. Tämä jäännös liuotettiin 75 ml:aan etyyliasetaattia ja uutettiin kolmesti 50 ml annoksilla jääkylmää kylläistä natriumbi-10 karbonaattiliuosta. Orgaaninen kerros pestiin sitten suolavedellä, kuivattiin natriumsulfaatilla, suodatettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 2,826 g mustaa kiinteää ainetta. Raaka tuote puhdistettiin haihdutustislauksella 120-140°C:ssa ja 0,1 mm paineessa, jolloin saatiin 1,235 g vaaleanoranssia 15 öljyä, joka kiinteytyi seisoessaan (52 %).
IR cm"1 1700, 1745; 1H N MR (60 MHz, CDCl3) Cj2,23 (S, 3H), 7,03 (d, J=2Hz, 1H), 7,13 (d, J=2Hz, 1H); 7,23-7,73 (m, 5H); MS (EI, DIP) m/e 218 (M+, 12,6 %); TLC Rf = 0,48 (hek-saani:etyyliasetaatti, 5:1).
20 Anal, laskettu C12H1()S02.1/2 H20:lle: C, 63,41; H, 4,88 havaittu: C, 63,78; H, 4,86 3-hydroksi-5-fenyylitiofeeni (8)
Seosta, jossa oli 2,126 g 3-hydroksi-5-fenyylitiofee-niasetaattia (7) (9,74 mmol) ja 80 ml metanolia, argon- 25 kehässä, käsiteltiin 11 ml :11a 1N NaOH. 20 minuutin kuluttua reaktio jäähdytettiin lisäämällä 11 ml 1N HCl, haihdutettiin 25°C:ssa, 12 mm, noin 50 ml tilavuuteen, ja käsiteltiin 100 ml:lla etyyliasetaattia. Orgaaninen kerros erotettiin, pestiin suolavedellä, kuivattiin natriumsulfaatilla, suodatet-30 tiin ja haihdutettiin mustaksi kiinteäksi aineeksi. Tämä jäännös liuotettiin 75 ml:aan etyyliasetaattia ja kuivattiin MgSO^:lla. Suodatus ja haihdutus antoi mustaa kiinteää ainetta, jota hierrettiin neljä kertaa kuuman heksaanin kanssa, jolloin jäähdytettäessä saatiin kaikkiaan 837 g keltaista 35 kiinteää ainetta, sp. 74-75°C (49 %). Yhdistetyt emäliuokset konsentroitiin, jolloin saatiin 0,87 g kiinteää ainetta, joka 26 8 5 9 9 0 käsiteltiin kromatografisesti 100 g :11a Si02 eluoiden heksaa-ni:etyyliasetaatti (7:1) -liuotinseoksella. Uudelleenkitey-tyksen jälkeen saatiin vielä 380 ml tuotetta, sp. 73,5-74°C. (kirj. 1,2 75°C, 78°C).
5 IR cm-1 3380, 1635; 1H NMR (90 MHz, CDCl-j) ci3,81 (s, 2H), 6,57 (s, 1H), 7,2-7,7 (m, 5H)? MS (EI) m/e 176,0 (70,7 %); TLC Rf = 0,23 (heksaani:etyyliasetaatti, 1:5).
Anal, laskettu C10H8OS:lle C, 68,15; H, 4,57 havaittu C, 68,05; H, 4,70 10 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-fenyylitiofeeni (9)
Liuosta, jossa oli 440 mg 3-hydroksi-5-fenyylitiofee-nia (8) (2,5 mmol) 20 ml:ssa dikloorimetaania, ja 0,61 ml pyridiiniä (7,5 mmol) 0°C:ssa, argonkehässä, käsiteltiin liuoksella, jossa oli 1,314 g N-tosyyli-L-alaninyylikloridia 15 (5 mmol) 10 mlrssa dikloorimetaania, lisättynä tipoittain viiden minuutin aikana. Reaktion annettiin sekoittua 0,5 tuntia 0°C:ssa, ja kaadettiin sitten 100 ml:aan kloroformia. Sitten seos uutettiin peräkkäin 50 ml:n annoksilla 1N sitruunahappoa, vettä, jääkylmää natriumbikarbonaattiliuosta, vettä 20 ja suolavettä. Sitten seos kuivattiin natriumsulfaatilla, suodatettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 1,78 g ruskeaa öljyä. Kiteytysyritys tolueenista 1,78 g Norit-käsittelyn jälkeen epäonnistui. Jäännös käsiteltiin sitten kromatografi-sesti 200 g SiC>2 kolonnilla eluoiden dikloorimetaanilla 25 10 ml/min virtausnopeudella. Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja konsentroitiin, jolloin saatiin 951 mg punertavaa öljyä. Tuote kiteytettiin tolueenista. Peräkkäiset uudelleenkiteytykset tolueenista antoivat kaikkiaan 463 mg . . tuotetta vaaleankeltaisena kiinteänä aineena, (46 %), sp.
30 85-87°C.
IR (KC1) cm"1 1735, 1330, 1150; 1H NMR (90 MHz, CDClg) cfl, 53 (d, J=7 Hz, 3H) , 1,62 (s, 3H) , 4,23 (m, 1H) , 5,32 (d, V J=9Hz, 1H), 6,84 (d, J=1,4 Hz, 1H), 6,88 (d, J=1,4 Hz, 1H) , ; 7,23-7,83 (m, 9H); MS (FAB) m/e 402 (M + 1, 15 %); TLC Rf = 35 0,20 (heksaani-etyyliasetaatti, 4:1).
Anal, laskettu C2qH^ gNO^ S: lie: C, 59,83; H, 4,77; N, 3,59 “ havaittu: C, 59,60; H, 4,77; N, 3,43.
27 85990 1. P. Friedlander ja S. Kielbasinski, Chem. Ber. 45, 3389 (1912) 2. A.I. Kosak, R.J.F. Palchak, W.A. Steele ja C.M.
Selwitz, J. Amer. Chem. Soc. 76, 4450 (1954).
5 3-(N-tosyyll-L-alaninyylioksl)-1-metyyli-5-fenyyll- pyrrolin (13) synteesi
Suoritettiin sarja kokeita yhdistettä (I) vastaavan otsikon esterin valmistamiseksi, jossa A on N-tosyyli-L-alaninyyli, R on fenyyli, R* on H, X on NR' ja R' on CH3· 10 Reaktiosarja on seuraava:
.COOK
/ COOK
<| f 0«J
(f]f NH(CH,)CH2C00H n^-cook KOH/H-O * 2 ^ CHj
AC2O
20 Et3N
Y
_^OH
- fjo0 r· J M L, (2„ CF.C00H Cl-C-CH-CH, 3 I 3
pyridiini .N
30 THF H Ts * o
II
. . _^0-C-CH-CH- Λ ΓΊ A (n, <* ts 35 ILJJ 1
Cll3 28 8 5 9 9 0 2- hvdroksi-3-(N-metvvlikarboksimetvvliamino)-hydro- kanelihapon dikaliumsuola (10)
Seosta, jossa oli ^-fenyyliglysidihapon kaliumsuolaa (30 g; 0,15 mol) N-metyyliglysiiniä (13,2 g; 0,15 mol), tis-5 lattua vettä (119 ml) ja KOH-liuosta (9N; 22,3 ml) lämmitettiin refluksointilämpötilassa 3 tuntia, jolloin saatiin vaaleankeltainen liuos. Reaktioseos haihdutettiin kuiviin alipaineessa 70°C:ssa. Jäännös kiteytettiin sitten 95 % EtOHrsta (100 ml), jolloin saatiin valkeaa kiinteää ainetta, 10 joka kuivaamisen jälkeen yön yli alipaineessa, 110°C lämpötilassa, antoi 30,8 g valkeaa kiinteää ainetta (10) (saanto 63 %) .
IR (KC1) cm-1 3360 (br), 1580, 1405, 705? NMR (CD3OD) <$2,30 (s, 3H) , 2,98 (s, 2H) , 3,70 (d, J=3 Hz, 1H) , 15 4,48 (d, J=3 Hz, 1H), 4,92 (s, 1H), 7,40 (s, 5H); TLC Rf = 0,51 (EtOH:1 M trietyyliammoniumbikarbonaatti 7:3). (Tuotteella ei ollut sulamispistettä alle 270°C).
3- asetoksi-1-metyyli-5-fenyylipyrroli (11)
Seosta, jossa oli 2-hydroksi-3-(N-metyylikarboksi- 20 metyyliamino)hydrokanelihapon dikaliumsuolaa (10) (15,2 g, 46 mmol), etikkahapon anhydridiä (173 ml) ja trietyyliamiinia (308 ml) lämmitettiin 90°C:ssa 19 tuntia. Reaktioseos, joka muuttui väriltään syvänruskeaksi, suodatettiin ja kiinteä aine pestiin eetterillä. Suodos haihdutettiin alipaineessa, 25 jolloin saatiin syvänruskea jäännös, joka otettiin eetteriin (300 ml) ja veteen (200 ml). Kerrokset erotettiin ja eetteri-kerros pestiin toisella annoksella vettä (200 ml). Sitten eetteriliuos kuivattiin MgSO^rllä, suodatettiin ja konsentroitiin alipaineessa, jolloin saatiin 10,7 g ruskeaa 30 jäännöstä, joka puhdistettiin haihdutustislauksella (120- 135°C? 0,03 torr) ja kiteytys eetteristä antoi 3,0 g valkeita kiteitä (11) (saanto 30 %), sp. 64-65°C.
V : IR (CHC13) cm”1 2990, 1750, 1570, 1518, 1482, 1375, ; 1230 (br) , 1024, 910, 700; 1H NMR (CDC13) 2,20 (s, 3H) , 35 3,58 (s, 3H) , 6,10 (d, J=2 Hz, 1H) , 6,75 (d, J = 2 Hz), 7,35 (s, 5H); TLC Rf = 0,58 (heksaani:EtOAc 7:3).
29 85990
Anal, laskettu Cl3H13N02:lle: C, 72,54; H, 6,10; N, 6,44 havaittu: C, 72,57; H, 6,09; N, 6,51 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-1-metyyli-5-fenyyli-pyrroli (13) 5 Seokseen, jossa oli hapetonta metanolia (15,5 ml) ja 3-asetoksi-1-metyyli-5-fenyylipyrrolia (11) (1,3 g, 6,2 mmol), argonissa, lisättiin hapetonta NaOH (2N, 12,5 ml). Reaktio-seosta sekoitettiin jäähauteessa 15 minuuttia. Hapetonta sitruunahappoa (2M, 7 ml) lisättiin sitten, ja saatua seosta 10 sekoitettiin jäähauteessa 8 minuuttia. Reaktioseos konsentroitiin alipaineessa, sitten lisättiin 20 ml vettä, ja uutettiin kahdesti etyyliasetaatilla (EtOAc) (50 ml). EtOAc-kerrokset yhdistettiin, kuivattiin MgSO^slla, suodatettiin ja konsentroitiin alipaineessa, jolloin saatiin 3-hydroksi-15 1-metyyli-5-fenyylipyrrolia (12) orgaanisena jäännöksenä.
Kylmää liuosta, jossa oli vedetöntä THF (12,4 ml), pyridii-niä (0,6 ml, 7,4 mmol, 1,2 eq) ja trifluorietikkahappoa (1,2 ml, 15 mmol, 2,4 eq) lisättiin argonissa oranssiin jäännökseen, ja sen jälkeen välittömästi lisättiin liuosta, 20 jossa oli juuri valmistettua N-tosyyli-L-alaninyylikloridia (1,2 g, 7,4 mmol, 1,2 eq) vedettömässä THFrssa (12,4 ml). Saatua seosta sekoitettiin yksi tunti 0°C:ssa. Sitten reaktio jäähdytettiin lisäämällä sitruunahapon vesiliuosta (1M, 5 ml) ja EtOAc (30 ml). Lyhyen sekoituksen jälkeen kerrokset ero-25 tettiin, ja orgaaninen kerros pestiin peräkkäin kylläisellä NaCl-liuoksella, kahdesti 5 % NaHC03-liuoksella ja jälleen . . kylläisellä NaCl-liuoksella. Sitten EtOAc-uutos kuivattiin
MgSO^:lla, käsiteltiin Norit 211:11a, suodatettiin ja konsentroitiin alipaineessa, jolloin saatiin raakaa tuotetta 30 (13) oranssina jäännöksenä. Tämä liuotettiin heksaani:
EtOAc:iin (1:1) (5 ml) ja käsiteltiin kromatografisesti kolonnissa (Si02, 100 g) eluoimalla heksaani:EtOAc:11a (7:3), jolloin saatiin 1 g (13) paksuna vaaleanoranssina öljynä.
Osa tästä raa'asta tuotteesta puhdistettiin edelleen puoli-35 preparatiivisella HPLC:llä (kolonni, IBM-silika 1 cm x 25 cm; liikkuva faasi, heksaani:EtOAc 8:2; virtausnopeus 30 85990 4,0 ml/min; paine 0,2 psi, 0,014 bar), jolloin saatiin huna-janväristä paksua öljyä (13).
IR (kalvo) cm"1 3260, 2950, 1760, 1520, 1350, 1170, 770; 1H NMR (DMS0-dg) <$1,28 (d, J=7Hz, 3H), 2,36 (s, 3H), 5 3,58 (s, 3H), 5,85 (d, J=2 Hz, 1H), 6,15 (m, 1H), 6,74 (d, J=2 Hz, 1H), 7,30-7,80 (m, 9H), 8,37 (d, J=8 Hz, 1H); 13C NMR (DMSO-dg) S 18,205, 20,936, 34,917, 51,240, 100,598, 113,148, 126,544, 127,000, 128,105, 128,560, 129,601, 130,901, 132,202, 135,714, 138,315, 142,672, 169,724, 10 TLC Rf = 0,52 (tolueeni:dioksaani 4:1); korkean resoluution massaspektri, C21H22N2O4S vaatii m/e 398,1300, havaittu m/e 398,1297.
3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi-5-(p-kloorifenyyli)-pyrrolin (18) synteesi 15 Suoritettiin sarja kokeita otsikon esteriyhdisteen, joka vastaa yhdistettä (I), valmistamiseksi, jossa yhdisteessä A on N-tosyyli-L-alaninyyli, R on p-kloorifenyyli, R* on H, X on NR' ja R' on H. Reaktiosarja on seuraava: 31 85990
S' COOH ’ySCQOW
s jQr J0r C1 22-27° 10 Ψ _^0Ac HO Y COO' K+ „ f/? «SSs* jQr rc”v
Ac 121-2° Cl^/ H
(75) (25)
NaOH
CHjOH
20 H-0 V 2 0
n M
_ g __xO-C-CH,-CH,
Jj—I Cl-C-CH -ch3 Γ-f 4 - jOi f» .....
CF,COOH
(2 7) pyridiini 30 trans-/3 -(p-kloorlfenyylDglvsldihappo (14) . . »
Sekoitettuun lietteeseen, jossa oli p-kloorikaneli-happoa (68,5 g; 0,375 mol) 260 ml:ssa asetonia, lisättiin NaHCOj (137 g; 1,63 mol), minkä jälkeen lisättiin hitaasti 260 ml vettä. Tähän seokseen lisättiin 2,5 tunnin aikana 35 22-27°C lämpötilassa seosta, jossa oli OXONE® :a (211 g; 0,343 mol), 120 mg dinatrium-EDTA:a ja 805 ml vettä. Viiden 32 85990 tunnin kuluttua seos tehtiin happamaksi 70 ml:11a kylmää 12 N HC1, pH:n laskemiseksi noin arvoon 2,5, ja sitten se uutettiin 700 ml:11a etyyliasetaattia. Uute pestiin suolavedellä, kuivattiin MgSO^:llä, suodatettiin ja suodos haihdutettiin 5 kuiviin vakuumissa. Valkeat kiinteät aineet kiteytettiin etyyliasetaatista: sp. 121-5°C. (72,2 g; 97 % saanto).
1H NMR (CDCl3/DMSO-D6) / 7,3 (m, 4H), 4,05 (d, J=2, 1H), ja 3,4 (d, J=2, 1H) .
Anal, laskettu CgH^ClO^:lle: C, 54,43; H, 3,55; Cl, 17,85 10 havaittu: C, 54,53; H, 3,80; Cl, 17,91 2-hydroksi-3-(karboksimetyyliamino)-p-kloorihydro-kanelihapon dikaliumsuola-dihydraatti (15)
Liuokseen, jossa oli KOH (85 %) (46,7 g, 0,709 mol) ja 400 ml vettä, lisättiin glysiiniä (25,9 g; 0,345 mol) ja 15 sen jälkeen trans-y£-p-kloorifenyyliglysidihappoa (14) (72,2 g; 0,3635 mol). Tätä seosta lämmitettiin 100°C:ssa kaksi tuntia, jäähdytettiin huoneen lämpötilaan ja riittävästi KOH lisättiin pH:n nostamiseksi arvoon 12. Samea liuos uutettiin kolmesti etyyliasetaatilla, joka uute heitettiin 20 sitten pois; kirkas vesiliuos (noin 500 ml) haihdutettiin vakuumissa kuiviin käyttäen 70° vesihaudetta. Sitten kiinteät aineet liuotettiin noin 350 ml:aan kuumaa etanolia, suodatettiin ja suodosta jäähdytettiin jäähauteessa useita tunteja. Kiteytetyt kiinteät aineet kerättiin suodattamalla 25 ja pestiin pienellä määrällä kylmää etanolia: sp. 93-5°C, dekarboksylaatio 185°C:ssa (57,2 g; 41 %).
1H NMR (D20-TSP)S 7,4 (s, 4H), 4,7 (s, 6H, vaihdettavat protonit), 4,4 (d, J=4, 1H), 4,05 (d, J=4, 1H) ja 3,1 (s, 2H) .
30 Anal, laskettu C1 .jH^CINO^ .2H20:lle: C,34,24; H,3,66; N,3,63 havaittu: C,34,40; H,4,03; N,3,42 N-asetyyli-3-asetoksi-5-(p-kloorifenyyli)pyrroli (16) 2-hydroksi-3-(karboksimetyyliamino)-p-kloorihydro-kanelihapon dikaliumsuolan dihydraattiin (15) (10 g; 0,02591 35 mol) lisättiin etikkahapon anhydridiä (40 ml) ja pyridiiniä (30 ml). Tätä seosta lämmitettiin varovasti 35°C:seen, jossa 33 85990 kohdassa liuoksen lämpötila nousi eksotermisesti 67°C:een ja alkoi sitten laskea, jolloin vaadittiin jälleen lämmitystä. Seosta lämmitettiin 121-2°C:ssa (sisäinen lämpötila) yksi tunti ja jäähdytettiin sitten. Reaktioseokseen lisättiin 5 noin 30 ml etyyliasetaattia, joka saosti suurimman osan pyri-diiniasetaattisuolasta; tämä suola otettiin talteen suodattamalla ja pestiin pienellä määrällä etyyliasetaattia. Suodos haihdutettiin sitten vakuumissa öljyksi, ja lisättiin jää-vettä. Tuote uutettiin eetterillä, ja eetteriuutteet pestiin 10 peräkkäin kahdesti kylmällä laimealla sitruunahapon vesi-liuoksella, kylmällä vedellä, kolmesti kylmällä, laimealla NaHCO^rn vesiliuoksella, kylmällä vedellä ja suolavedellä, minkä jälkeen kuivattiin MgSO^slla ja suodatettiin. Suodos käsiteltiin 10 g:11a Darcoa, sekoitettiin 20 minuuttia ja 15 suodatettiin. Suodos haihdutettiin vakuumissa öljyksi, öljyyn lisättiin 25 ml 2-propanolia. Saadusta liuoksesta saatiin jäähdytettäessä ja raaputettaessa kalpeankeltaisia kiteitä: sp. 69-71°C (3,4 g; 47 %); TLC Rf = 0,61 (tolueeni:dioksaa-ni, 95:5) . Analyyttinen näyte uudelleenkiteytettiin 2-pro-20 panolista, mutta muutosta sulamispisteessä ei havaittu.
IR (KC1) cm ^ 1755 (C=0, esteri) ja 1730 (C=0, amidi); 1H NMR (CDC13) ^ 7,4 (m, 5H), 6,2 (d, J=2, 1H), 2,4 (s, 3H) ja 2,3 (s, 3H).
Anal, laskettu C14H12ClN03:lle: C, 60,55; H, 4,36; N, 5,04 25 havaittu: C, 60,65; H, 4,55; N, 5,07.
3-hydroksi-5-(p-kloorifenyyli)pyrroli (17) N-asetyyli-3-asetoksi-5-p-kloorifenyylipyrrolinäyt-teestä (16) (2,8; 0,01 mol) poistettiin happea kymmenen minuuttia ^-virralla. Sitten kiinteät aineet liuotettiin 30 hapettomaan metanoliin (30 ml), joka jäähdytettiin sitten -8°C:seen. Lisättiin kylmää hapetonta liuosta, jossa oli NaOH (1,6 g; 0,04 mol) 20 ml:ssa HjO kerralla, joka liuos lämmitettiin sitten lyhyesti 15°C:seen ja jäähdytettiin välittömästi -5°C:seen; 25 min kuluttua kirkasta liuosta 35 käsiteltiin kylmällä, hapettomalla liuoksella, jossa oli " sitruunahappoa (4,2 g; 0,02 mol) 15 ml:ssa H20, ja lämpötila 34 85990 nousi lyhyesti 5°C:seen. 0,5 tunnin sekoituksen jälkeen -5°C:ssa kiinteät aineet otettiin talteen suodattamalla ja pestiin kylmällä, hapettomalla H20:lla. Kalpeanvihreää tuotetta kuivattiin vakuumissa huoneen lämpötilassa P205:lla 5 useiden päivien ajan (1,3 g; 68 %) ; TLC Rf = 0,19 (CHClg:
EtOH, 9:1); IR (KCl) ei todistusta C=0-absorptiosta.
Anal, laskettu C10HgClNO.1/6H20: C, 61,08; H, 4,27; N, 7,12 havaittu: C, 61,36; H, 4,44; N, 6,85.
3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-(p-kloorifenyyli)- 10 pyrroli (18)_ THF:iin (15 ml), josta oli happi poistettu N2:lla lisättiin pyridiiniä (0,65 ml; 0,008 mol), trifluorietikka-happoa (1,27 ml; 0,0164 mol) ja 3-hydroksi-5-p-kloorifenyyli-pyrrolia (17) (1,3 g; 0,0065 mol). Liuos jäähdytettiin 15 0°C - -4°C:seen ja happi poistettiin N2:lla, jäähdytettiin (0°C - -4°C), N-tosyyli-L-alaninyylikloridin liuosta (2,1 g; 0,008 mol) 15 ml:ssa THF lisättiin 10 minuutin aikana. Kun seosta oli pidetty 0°C:ssa.yksi tunti, lisättiin jään ja 100 ml 1N sitruunahapon seosta. Tämä seos uutettiin etyyliasetaa-20 tiliä, ja uute pestiin kerran kylmällä suolavedellä, kahdesti kylmällä, laimealla NaHCOgilla ja kerran kylmällä suolavedellä, minkä jälkeen se kuivattiin MgSO^:llä ja suodatettiin. Suodos käsiteltiin 2 g :11a Darcoa ja sekoitettiin kymmenen minuuttia, suodatettiin, ja suodos konsentroitiin 25 vakuumissa punertavan ruskeaksi öljyksi. Toinen käsittely 1.3 g:lla Darcoa antoi vaalean punertavaa öljyä, öljy liuotettiin tolueeni:sykloheksaaniin (4:1) ja pantiin jääkaappiin yön yli. Vaalean lohenvärisiä kiteitä saatiin. (1,45 g; 53 %); sp. 113-5°C; TLC Rf = 0,47 (Et20); IR (KCl) cm“1 1740 (C=0, 30 esteri); 1H NMR (CDClg) ^8,4 (br s, 1H) , 7,8-7,2 (m, 8H) , 6,7 (m, 1H), 6,2 (m, 1H), 5,5 (d, J=9, 1H), 4,2 (p, J=8, 1H) , 2,4 (s, 3H) , 1,4 (d, 3H); MS (EI, DIP) m/e 418 (M+, 2.3 %) ja 420 (M+, 0,8 %) .
Anal, laskettu C2()H1 gClN^S:lie: C, 57, 34; H, 4,57; N, 6,69 35 havaittu: C, 57,53; H, 4,58; N, 6,67 35 85990
Erilaisten testilaitteiden valmistus ja käyttö Suoritettiin sarja kokeita tämän keksinnön mukaisten testilaitteiden valmistamiseksi, joissa laitteissa testattiin esterisubstraattien kykyä läpikäydä leukosyytti-kataly-5 soitu hydrolyysi, sitä seuraava kytkentä kahtaisionin (I) kanssa, so. reaktiokyky virtsassa olevien leukosyyttien havaitsemiseksi. Kukin laite käsitti pienen neliön suodatinpaperia, joka sisälsi koereagenssit, ja paperi oli kiinnitetty polystyreenikalvokaistaleen toiseen päähän. Suodatin-10 paperi impregnoitiin puskurilla, esterillä, kiihdyttimellä ja kahtaisioni-kytkentäaineella. Kunkin testatun laitteen havaittiin antavan positiivisen testin virtsan leukosyyteille .
1. Testilaite, jossa esteri on 3-(N-tosyyli-L-alaninvvli-15 oksi)-5-fenyylipyrroll (4)
Valmistettiin testilaite, joka on sensitiivinen virtsassa olevien leukosyyttien läsnäololla. Laite käsitti pienen suodatinpaperineliön kiinnitettynä pitkän polystyreenikalvokaistaleen toiseen päähän. Paperi impregnoitiin erilai-20 silla aineosilla, mukaan lukien väriä tuottavan esterin, kiihdyttimen ja diatsoniumsuolan. 12 tuumaa leveä (»30 cm) kaistale Eaton ja Dickman W 205 suodatinpaperia upotettiin vesiliuokseen, joka sisälsi seuraavia aineita: 0,4 M boraatti-NaOH puskuria, pH 9,0 25 2,0 % (W/v) polyvinyylipyrcolidonia K-30 0,2 % (w/v) Bioterg AS-40^ 0,25 M NaCl
Sitten paperia kuivattiin 7 minuuttia Overly Air Foil -pape-rinkuivaajassa 79-93°C (175-200°F) lämpötilassa ilman vir-30 tauspaineen ollessa (1 tuuma) 2,5 mm H20. Sitten kuivattu paperi upotettiin asetonilluokseen, joka sisälsi: 1,5 % (v/v) n-dekanolia
Vi 0,7 mM 1-diatso-2-naftoli-4-sulfonaattia ·:· 1,1 mM 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-fenyylipyrrolia.
‘ r 35 Tämän impregnoinnin jälkeen paperia kuivattiin 7 minuuttia Overly-uunissa 66°C (150°F) lämpötilassa paineessa 0,5 H20. Saatiin ei-valkoinen testipaperi.
36 85990
Palanen kuivattua, impregnoitua paperia leikattiin neliöksi, jonka sivut olivat 5 mm (0,2 tuumaa) ja kiinnitettiin pitkittäisen polystyreenikaistaleen, jonka mitat olivat 10 x 0,5 cm (4 x 0,2 tuumaa), toiseen päähän. Kiinnitys suo-5 ritettiin käyttäen Double Stick kaksipuolista tahnaa (3M Company).
2. Testilaite, jossa esteri on 3-(N-tosyyli-L-alaninyy-lioksi) -1-metyyli-5-fenyylipyrroli (13)
Valmistettiin testilaite, joka on herkkä virtsassa 10 olevien leukosyyttien läsnäololle, ja siinä käytettiin 1-metyyli-3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-fenyylipyrrolia esteri-indikaattorina ja kytkentäaine oli 1-diatso-naftalee-ni-4-sulfonaatti. Pala suodatinpaperia (Eaton and Dikeman Φϊ' 205) upotettiin ensimmäiseen kastovesilluokseen, jossa oli: 15 0,4 M boorihappoa 2,0 % (w/v) polyvinyylipyrrolidonia (K-30) 0,2 % (v/v) Bioterge AS-40 0,25 M NaCl
Ennen suodatinpaperin impregnointia liuos titrattiin NaOH:lla 20 pH 9,0:aan.
Toinen kastoliuos asetonissa sisälsi: 0,75 mM 1-diatso-2-naftoli-4-sulfonaattia 1,3 mM 1-metyyli-3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-fenyylipyrrolia 25 1,5 % (v/v) dodekanolia
Impregnoinnin ensimmäisen kestoliuoksen jälkeen paperi kuivattiin noin 5 minuuttia noin 80°C:ssa, kastettiin toiseen kastoiluokseen ja kuivattiin noin 5 minuuttia 70°C:ssa.
. . Kahdesti impregnoitu paperi kuivattiin sitten paine- 30 ilmauunissa 5 minuuttia 50°C:ssa.
Kuivattu paperi leikattiin sivultaan (0,2 tuuman) neliöksi ja kiinnitettiin polystyreenikalvon, mitoiltaan 0,5 cm x 8,25 cm (0,2 x 3,25 tuumaa), toiseen päähän. Kiinnitys suoritettiin käyttäen Double Stickiä, kaksipuolista 35 tahnaa 3M Companystä. Testilaite varastoitiin 100 kpl:n pullossa silikageelin ja molekyyliseulojen kanssa kuivauksen aikaansaamiseksi.
37 85990 3. Testilaite, jossa esteri on 3-(N-tosyyli-L-alaninyyIloksi) -5-(p-kloorifenyyli)pyrroli (18)
Testilaitteet valmistettiin samoin kuin edellä, mutta asetoniliuos sisälsi fenyylipyrrolin sijasta 1,3 mM 3-(N-5 tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-(p-kloorifenyyli)pyrrolia. Testilaitteiden arviointi
Edellä valmistetuista testilaitteista arvioitiin niiden kyky havaita virtsassa olevia leukosyyttejä.
Testinäytteet valmistettiin normaalista ihmisen virt-10 sasta. Yksi näyte toimi sokeana ja juuri otetusta verestä eristettyjä leukosyyttejä lisättiin kahteen lisävirtsanäyt-teeseen konsentraatioiden 0, 10 ja 75 leukosyyttiä/^ul aikaansaamiseksi vastaavasti.
Testilaitteet upotettiin nopeasti näytteeseen ja otet-15 tiin pois. Kaksi minuuttia myöhemmin laitteita tarkkailtiin spektrofotometrilla %-heijastuksen mittaamiseksi erilaisilla aallonpituuksilla 400-700 nm väliltä (nanometriä).
Tulokset osoittavat, että kaikki testilaitteet osoittivat selvästi havaittavia eroja valon heijastumisessa vas-20 täten erilaisia leukosyyttimääriä testinäytteissä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa.
Leukosyyttipitoisuus % heijastus 555 nm Koe n:o_(solua/1)_kohdalla_ 1* 0 25 10-12 2 0 67 10 64 75 60 3 0 61 30 10 51 75 42 ♦Visuaalinen tarkkailu: purppuranväri muodostui ' tasolla 10-12 solua/^ul; sokea näyte ei antanut värinmuutosta.
On selvää, etä monia muita keksinnön modifikaatioita ja 35 variaatioita kuin on tässä esitetty voidaan tehdä poikkeamatta keksinnön hengestä ja laajuudesta.
Claims (10)
- 38 85990
- 1. Koostumus analyytin määrittämiseksi testinäyt-teestä, Jolloin määritettävä analyytti tarkoittaa leuko-5 syyttejä, esteraasia ja proteaasia, tunnettu siitä, että koostumus käsittää esterin, joka muodostuu aromaattisesta fenolista tai pseudoaromaattisesta fenolista ja haposta, joka pystyy katalyyttisesti hydrolysoitumaan leukosyyttien, este-10 raasin tai proteaasin läsnäollessa muodostaen fenolin, joka pystyy kytkeytymään diatso-zwitter-ionin kanssa, mainitun esterin ollessa esim. 3-(N-tosyyli-l-alaninyyli-oksi)-5-fenyylipyrroli tai -tiofeeni, ja diatsoniumsuolan, jonka rakenne on: 15 n + & 20 jossa A' on anioni, kuten S03, ja R sama tai erilainen ja on H, alempi alkyyli tai aryyli tai kumpikin R yhdessä muodostaa kondensoituneen rengassysteemin, ja R1 on H, OH tai alempi alkyyli. .25 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että A" on 4-asemassa.
- 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että A* on S03.
- 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, :30 tunnettu siitä, että suola on l-diatso-2-naftoli- 4-sulfonaatti.
- 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että esteri on 3-(N-tosyyli-L-ala-ninyylioksi)-5-fenyylipyrroli. . 35 39 85990
- 6. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-5 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että koostumus sisältää lisäksi kiihdytintä.
- 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen koostumus, 5 tunnettu siitä, että kiihdytin on alkoholi, jossa on noin 8-15 hiiliatomia.
- 8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että kiihdytin on alkoholi, jossa on noin 8-15 hiiliatomia, ja diatsoniumsuola on 1-diatso- 10 2-naftoli-4-sulfonaatti.
- 9. Testilaite leukosyyttien, esteraasin tai prote-aasin läsnäolon määrittämiseksi, tunnettu siitä, että käsittää kantajamatrlisin liitettynä jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukaiseen koostumukseen.
- 10. Menetelmä leukosyyttien, esteraasin tai prote- aasin läsnäolon määrittämiseksi testinäytteestä, tunnettu siitä, että näyte saatetaan kosketukseen patenttivaatimuksen 9 mukaisen laitteen kanssa, ja havaittava reaktio todetaan. 20 40 85990
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US59761184 | 1984-04-06 | ||
US06/597,611 US4637979A (en) | 1984-04-06 | 1984-04-06 | Composition and test device for determining the presence of leukocytes containing a zwitterion coupling agent |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI851354A0 FI851354A0 (fi) | 1985-04-03 |
FI851354L FI851354L (fi) | 1985-10-07 |
FI85990B true FI85990B (fi) | 1992-03-13 |
FI85990C FI85990C (fi) | 1992-06-25 |
Family
ID=24392221
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI851354A FI85990C (fi) | 1984-04-06 | 1985-04-03 | Sammansaettning innehaollande zwitterjonkopplingsmedel och testanordning foer bestaemning av leukocyter. |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4637979A (fi) |
EP (1) | EP0158204B1 (fi) |
JP (1) | JPS60227698A (fi) |
AT (1) | ATE48157T1 (fi) |
AU (1) | AU554830B2 (fi) |
CA (1) | CA1228001A (fi) |
DE (1) | DE3574398D1 (fi) |
DK (1) | DK161028C (fi) |
ES (1) | ES8607565A1 (fi) |
FI (1) | FI85990C (fi) |
IE (1) | IE57745B1 (fi) |
IL (1) | IL74303A (fi) |
NO (1) | NO164201C (fi) |
ZA (1) | ZA851537B (fi) |
Families Citing this family (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3413078A1 (de) * | 1984-04-06 | 1985-10-24 | Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. | Chromogene aminosaeure- und peptidester, verfahren zu deren herstellung, verwendung dieser verbindungen in analysenverfahren sowie mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme |
DE3813503A1 (de) * | 1988-04-22 | 1989-11-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | Traegergebundenes mehrkomponentiges nachweissystem zur kolorimetrischen bestimmung esterolytisch oder/und proteolytisch aktiver inhaltsstoffe von koerperfluessigkeiten |
EP0661280A1 (en) * | 1993-12-29 | 1995-07-05 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Novel amino acid ester and reagent composition for detecting leucocytes or elastase in body liquid |
US5464739A (en) | 1994-08-22 | 1995-11-07 | Bayer Corporation | Composition method for determining the presence of leukocyte cells, esterase or protease in a test sample |
CA2161574A1 (en) | 1994-11-15 | 1996-05-16 | James Noffsinger | Methodology for colorimetrically determining the concentration of white blood cells in a biological fluid |
US6551791B1 (en) | 1995-12-21 | 2003-04-22 | University Of Florida | Rapid diagnostic method for distinguishing allergies and infections and nasal secretion collection unit |
US5910421A (en) * | 1995-12-21 | 1999-06-08 | University Of Florida | Rapid diagnostic method for distinguishing allergies and infections |
US5846754A (en) * | 1996-05-28 | 1998-12-08 | Bayer Corporation | Enzyme determination with protease inactivation |
DE19741447A1 (de) * | 1997-09-19 | 1999-03-25 | Dade Behring Marburg Gmbh | Verfahren und Nachweis zur Bestimmung enzymatischer Reaktionen in Urin |
FR2777018B1 (fr) * | 1998-04-02 | 2003-04-25 | Bio Merieux | Nouveau substrat chromogene ainsi que son procede d'utilisation |
US6365340B1 (en) | 1998-11-11 | 2002-04-02 | Ronald E. Wheeler | Detection of prostatitis |
US6528652B1 (en) * | 1999-01-21 | 2003-03-04 | Chronimed | Composition and device for detecting leukocytes in urine |
US6348324B1 (en) | 1999-01-21 | 2002-02-19 | Hypoguard America Limited | Composition and device for detecting leukocytes in urine |
WO2003070207A1 (en) * | 2002-02-25 | 2003-08-28 | Ciba Specialty Chemicals Holding Inc. | Method of colouring keratin-containing fibres |
US6709868B2 (en) | 2002-05-20 | 2004-03-23 | Portascience Inc. | Method and apparatus for measuring white blood cell count |
US8003399B2 (en) * | 2005-08-31 | 2011-08-23 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Nitrite detection technique |
US7504235B2 (en) * | 2005-08-31 | 2009-03-17 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Enzyme detection technique |
US7727206B2 (en) * | 2005-12-27 | 2010-06-01 | Gorres Geoffrey H | Device for monitoring a patient for a urinary tract infection |
US8758989B2 (en) * | 2006-04-06 | 2014-06-24 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Enzymatic detection techniques |
US8044257B2 (en) * | 2006-10-30 | 2011-10-25 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Absorbent article containing lateral flow assay device |
US7897360B2 (en) | 2006-12-15 | 2011-03-01 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Enzyme detection techniques |
US7935538B2 (en) * | 2006-12-15 | 2011-05-03 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Indicator immobilization on assay devices |
US20080269707A1 (en) * | 2007-04-30 | 2008-10-30 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Lateral Flow Device for Attachment to an Absorbent Article |
US8043272B2 (en) * | 2007-04-30 | 2011-10-25 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Collection and testing of infant urine using an absorbent article |
US9103796B2 (en) | 2007-12-14 | 2015-08-11 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Multi-layered devices for analyte detection |
EP3032258B1 (en) | 2008-12-30 | 2021-05-12 | Children's Medical Center Corporation | Method of predicting acute appendicitis |
US20100290948A1 (en) * | 2009-05-15 | 2010-11-18 | Xuedong Song | Absorbent articles capable of indicating the presence of urinary tract infections |
US11104933B1 (en) | 2016-03-22 | 2021-08-31 | Cleu Diagnostics, Llc | Compositions and methods for determining the presence of active leukocyte cells using an electrochemical assay |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3552928A (en) * | 1967-07-19 | 1971-01-05 | Miles Lab | Whole blood separation means and test system using same |
US3823130A (en) * | 1971-05-28 | 1974-07-09 | Polychrome Corp | Light sensitive esters of naphthoquinone-1,2-diazide-(2)-5-sulfonicacids with cyclohexylmethanol or secondary or tertiary alkanols of up to six carbon atoms |
US3846247A (en) * | 1972-09-27 | 1974-11-05 | Warner Lambert Co | Moisture barrier |
DE2836644A1 (de) * | 1978-08-22 | 1980-03-06 | Boehringer Mannheim Gmbh | Diagnostisches mittel zum nachweis von leukozyten in koerperfluessigkeiten und dafuer geeignete chromogene |
DE2854987A1 (de) * | 1978-12-20 | 1980-06-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Diagnostische mittel zum nachweis proteolytischer enzyme und dafuer geeignete chromogene |
DE2905531A1 (de) * | 1979-02-14 | 1981-01-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Diagnostisches mittel zum nachweis von leukozyten in koerperfluessigkeiten |
US4529704A (en) * | 1979-11-05 | 1985-07-16 | Miles Laboratories, Inc. | Device and method for preparation of a control solution for ketone determination. |
DE3017721A1 (de) * | 1980-05-09 | 1981-11-26 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme und dafuer geeignete substrate |
JPS6035117B2 (ja) * | 1980-10-28 | 1985-08-13 | 富士写真フイルム株式会社 | リパ−ゼ活性測定用試薬 |
JPS581920A (ja) * | 1981-06-27 | 1983-01-07 | 住友電気工業株式会社 | 金属被ケ−ブル及びその防食処理方法 |
US4499185A (en) * | 1982-05-17 | 1985-02-12 | Miles Laboratories, Inc. | Test for esterase activity in a liquid sample |
US4517301A (en) * | 1982-12-06 | 1985-05-14 | Miles Laboratories, Inc. | Ketone control test composition, method and test device |
US4543335A (en) * | 1982-12-20 | 1985-09-24 | Miles Laboratories, Inc. | Device and method for the quantitative determination of heparin in mammalian blood plasma |
US4532216A (en) * | 1982-12-27 | 1985-07-30 | Miles Laboratories, Inc. | Use of quaternary ammonium polyelectrolyte salts in test means, test device and method for determining the ionic strength or specific gravity of a liquid sample |
US4540520A (en) * | 1983-05-12 | 1985-09-10 | Miles Laboratories, Inc. | Compound useful in detecting ion and method of preparing it |
US4552697A (en) * | 1983-05-12 | 1985-11-12 | Miles Laboratories, Inc. | Compound useful in detecting ions and method of preparing it |
-
1984
- 1984-04-06 US US06/597,611 patent/US4637979A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-02-06 CA CA000473671A patent/CA1228001A/en not_active Expired
- 1985-02-11 IL IL74303A patent/IL74303A/xx unknown
- 1985-02-28 ZA ZA851537A patent/ZA851537B/xx unknown
- 1985-03-22 NO NO851169A patent/NO164201C/no unknown
- 1985-03-25 EP EP85103498A patent/EP0158204B1/en not_active Expired
- 1985-03-25 AT AT85103498T patent/ATE48157T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-03-25 AU AU40322/85A patent/AU554830B2/en not_active Ceased
- 1985-03-25 DE DE8585103498T patent/DE3574398D1/de not_active Expired
- 1985-03-29 ES ES541778A patent/ES8607565A1/es not_active Expired
- 1985-04-03 DK DK153885A patent/DK161028C/da not_active IP Right Cessation
- 1985-04-03 FI FI851354A patent/FI85990C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-04-04 IE IE870/85A patent/IE57745B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-04-05 JP JP60071262A patent/JPS60227698A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK161028B (da) | 1991-05-21 |
DK153885A (da) | 1985-10-07 |
CA1228001A (en) | 1987-10-13 |
US4637979A (en) | 1987-01-20 |
ATE48157T1 (de) | 1989-12-15 |
AU4032285A (en) | 1985-10-10 |
IL74303A0 (en) | 1985-05-31 |
AU554830B2 (en) | 1986-09-04 |
EP0158204A3 (en) | 1987-05-27 |
DE3574398D1 (en) | 1989-12-28 |
FI851354L (fi) | 1985-10-07 |
EP0158204A2 (en) | 1985-10-16 |
JPH0550278B2 (fi) | 1993-07-28 |
ES8607565A1 (es) | 1986-06-01 |
ZA851537B (en) | 1985-10-30 |
JPS60227698A (ja) | 1985-11-12 |
DK161028C (da) | 1991-10-28 |
IE57745B1 (en) | 1993-03-24 |
IL74303A (en) | 1989-06-30 |
NO164201B (no) | 1990-05-28 |
IE850870L (en) | 1985-10-06 |
ES541778A0 (es) | 1986-06-01 |
EP0158204B1 (en) | 1989-11-23 |
NO851169L (no) | 1985-10-07 |
NO164201C (no) | 1990-09-05 |
FI85990C (fi) | 1992-06-25 |
DK153885D0 (da) | 1985-04-03 |
FI851354A0 (fi) | 1985-04-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI85990B (fi) | Sammansaettning innehaollande zwitterjonkopplingsmedel och testanordning foer bestaemning av leukocyter. | |
US4657855A (en) | Composition and test device for determining the presence of leukocytes, esterase and protease in a test sample | |
FI81566C (fi) | Nya pyrrolylderivat foer bestaemning av hydrolytiska analyter i ett prov och foerfarande foer deras framstaellning. | |
JPS6145982B2 (fi) | ||
US4716222A (en) | Substrates for hydrolases | |
US4723020A (en) | Chromogenic amino acid esters and peptide esters | |
US4704460A (en) | Novel compounds for detecting the presence of hydrolytic analytes in a test sample | |
FI86204B (fi) | Analysfoerfarande och medel foer att paovisa esterolytiska och/eller proteolytiska enzym. | |
JPS631347B2 (fi) | ||
GB2134524A (en) | Fluorogenic esters of phosphoric acid | |
US4774340A (en) | Method for preparing 3-hydroxy pyrroles and esters thereof | |
US6503725B2 (en) | Composition and device for detecting leukocytes in urine | |
US6528652B1 (en) | Composition and device for detecting leukocytes in urine | |
EP0160980B1 (en) | Novel method for determining cholinesterase activity | |
JPH0650997B2 (ja) | コリンエステラ−ゼ活性の新規測定方法 | |
JP2002535342A (ja) | 尿中の白血球を検定するための組成物およびディバイス | |
JPS5925363A (ja) | チロシン誘導体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM | Patent lapsed | ||
MM | Patent lapsed |
Owner name: MILES INC |