FI81566C - Nya pyrrolylderivat foer bestaemning av hydrolytiska analyter i ett prov och foerfarande foer deras framstaellning. - Google Patents
Nya pyrrolylderivat foer bestaemning av hydrolytiska analyter i ett prov och foerfarande foer deras framstaellning. Download PDFInfo
- Publication number
- FI81566C FI81566C FI851356A FI851356A FI81566C FI 81566 C FI81566 C FI 81566C FI 851356 A FI851356 A FI 851356A FI 851356 A FI851356 A FI 851356A FI 81566 C FI81566 C FI 81566C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- mixture
- tosyl
- formula
- ester
- compound
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
- C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
- C07D207/36—Oxygen or sulfur atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D303/00—Compounds containing three-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
- C07D303/02—Compounds containing oxirane rings
- C07D303/48—Compounds containing oxirane rings with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms, e.g. ester or nitrile radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
- C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
- C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
- C07D333/26—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
- C07D333/30—Hetero atoms other than halogen
- C07D333/32—Oxygen atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D339/00—Heterocyclic compounds containing rings having two sulfur atoms as the only ring hetero atoms
- C07D339/02—Five-membered rings
- C07D339/04—Five-membered rings having the hetero atoms in positions 1 and 2, e.g. lipoic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Pyrrole Compounds (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Heterocyclic Compounds Containing Sulfur Atoms (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Magnetic Means (AREA)
- Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
- Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Description
1 8 ί S 6 6
Uusia pyrrolyyli johdannaisia hydrolyyttisten analyyttien määrittämiseksi näytteestä sekä menetelmä niiden valmistamiseksi
Keksinnön kohteena ovat uudet yhdisteet, jotka ovat 5 käyttökelpoisia määrättyjen analyyttiaineosien toteamiseksi testinäytteestä. Näihin analyytteihin kuuluvat leukosyytit, esteraasi ja proteaasi. Leukosyyttien toteaminen virtsasta on erityisen tärkeää lääkinnällisessä diagnostiikassa.
Epänormaalin suuri leukosyyttipitoisuus potilaan 10 virtsassa on mahdollisesti osoitus sellaisista sairaustiloista kuin munuais- tai virtsa- ja sukupuolielinten infektioista tai muista toimintahäiriöistä. Siten tarkat tiedot virtsan leukosyyttimäärästä saattavat lääkärille merkitä verrattoman arvokasta apua tällaisten sairaustilojen diagnostiikassa ja 15 hoidossa.
Lääketieteessä on perinteisesti käytetty visuaalisia määritysmenetelmiä leukosyyttipopulaation laskemiseksi virtsa-sakasta tai linkoamattomasta virtsasta. Tällaiset menetelmät edellyttävät kalliita välineitä, kuten linkoa ja mikroskooppia, 20 ja kuluttavat kohtuuttomasti lääkärin aikaa. Perinteisten menetelmien lisähaittana on, että niillä voidaan määrittää vain vahingoittumattomia soluja. Virtsasysteemin olosuhteet saattavat olla sellaiset, että tapahtuu huomattavaa leukosyyttien liukenemista. On esim. tunnettua, että virtsassa, jonka pH 25 on epänormaalin korkea, saattaa leukosyyttien puoliintumisaika olla vain 60 minuuttia. Koska liuenneet solut eivät näy visuaalisessa tarkastelussa, seurauksena voi olla virheellisesti liian pieni ja virheellisesti negatiivinen arvo.
Leukosyyttien kahdesta mikroskooppisesta määritys-30 menetelmästä eli virtsasakkaa ja linkoamatonta, homogenoitua virtsaa käyttävästä menetelmästä, on edellinen selvästi suositumpi. Joskin jälkimmäisen menetelmän voidaan katsoa antavan luotettavia tuloksia, virtsasakan tutkiminen on ylivoimaisesti yleisin tapa. Tässä menetelmässä virtsanäyte lingo-35 taan ja sakka eristetään ja tutkitaan mikroskooppisesti siten, 2 81566 että analyysin suorittaja laskee näkökentässä näkyvät leukosyytit. Sakassa olevat virtsan muut komponentit, kuten epiteelisolut ja suolahiukkaset hankaloittavat kuitenkin tätä tehtävää. Koska sakan aineosien määrä vaihtelee ja 5 haittaavia tekijöitä on muitakin, mm. näytteen epähomogee-nisuus ja mikroskooppien erilainen erotuskyky, voi lopputulos olla huomattavan virheellinen.
Niinpä on ilmeistä, että nopea ja helppo menetelmä leukosyyttien määrittämiseksi eli menetelmä, joka eliminoi 10 aikaavievät tekniikat ja kalliit välineet ja reagoi tarkasti esteraasiin, proteaasiin ja leukosyyttisoluihin, sekä vahingoittumattomiin että liuenneisiin, merkitsisi tekniikan tasolla todellista edistysaskelta. Käsiteltävänä oleva keksintö tarjoaa tällaisen edistysaskeleen. Lisäksi se ei perus-15 tu leukosyyttien näkemiseen, vaan niiden entsymaattiseen aktiivisuuteen ja siten siihen ei olennaisesti liity edellä kuvattuja epätarkkuuksia.
Tekniikan tasolla on lukuisia viitteitä, joissa on julkistettu määrättyjen esterien käyttö, jotka pilkkoutues-20 saan entsymaattisesti synnyttävät värin tai muun todettavissa olevan ilmiön. Niinpä GB-patentissa 1 128 371 on julkistettu indoksyyli- ja tioindoksyyliesterien käyttö vä-rinsynnyttäjinä, jotka ovat käyttökelpoisia hydrolyyttisten entsyymien määrittämiseksi kehonnesteistä. Esterin pilkkou-25 tuessa entsymaattisesti syntyy vapaata indoksyyliä, joka sitten hapettuu dimeeriseksi tuotteeksi indigoksi, joka on helposti todettavissa oleva sininen väriaine. Mainitaan, että tällainen aktiivisuus on koliiniesteraasilla muiden entsyymien ohella. Tässä julkaisussa mainitaan myös, että esteri-30 substraatin indoksyyliosan lisäksi valitaan happoradikaali erityisesti silmälläpitäen määritettävää entsyymiä. Todetaan, että happoradikaalina voi olla esim. asetaatti tai lauraatti tai stearaatti määritettäessä esteraasi tai vastaavasti li-paasi. Määritettäessä sellaisia entsyymejä kuin fosfataasi 35 tai sulfataasi voi happoradikaali olla epäorgaaninen. Niinpä li 3 81566 voidaan katsoa, että GB-patentissa kuvataan värinsynnyttä-jäentsyymien käyttöä substraatteina esterolyyttisten entsyymien toteamiseksi, joissa estereissä indoksyyli tai tioindoksyyli muodostavat esterin alkoholiosan ja asyyli-5 osa valitaan vastaamaan määritettävää entsyymiä.
Asyyliradikaalin huolellisen valinnan merkitys käy selvimmin ilmi kahdesta viitteestä, joissa osoitetaan este-raasispesifisyys esterien suhteen, joissa asyyliradikaali-na on N-suojattu aminohappo tai peptidi. Niinpä Janoff 10 et ai., Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 136:1045-1049 (1971), ovat osoittaneet, että alaniiniesterit ovat ihmisen leukosyyteistä saadun esteraasin spesifisiä substraatteja. Tässä viitteessä mainitaan erityisesti, että ihmisen leukosyytti-jyväsistä saatu uute pystyy hydrolysoimaan N-asetyyli-L-15 alanyyli-L-alanyyli-L-alaniini-metyyliesterin. Lisäksi L-alaniini-p-nitrofenoliesteri hydrolysoitui samoin p-nitro-fenolin keltaiseksi värimuodoksi.
Samalla tavoin Sweetman et ai., Jour. Hist. Soc. 22:327-338, esittävät 1-naftyyli-N-asetyyli-DL-alaniinin 20 ja 1-naftyylibutyraatin käytön esteraasin toteamiseksi, samoin kuin 1-naftyyli-N-asetyyli-L-alanyyli-L-alaniinin käytön.
US-patentti 4 278 763 (myönnetty Boehringer Mannheim GmbH:lie) yhdistää nämä tiedot päätymällä amino-25 happojen tai peptidien indoksyyli- tai tioindoksyylieste-reihin, eli esitetään lisäesimerkki leukosyyttisen este-raastiaktiivisuuden perinteisestä värinsynnyttäjäsubstraa-tista. Lisäksi Boehringerin julkaisussa esitetään proteaasien ja esteraasien proteolyyttinen vastaavuus.
4 81566
Mainittu US-patentti kohdistuu yhdisteeseen, jolla
on yleinen kaava D
,1
r 1 x O-A-B
2Π f 5 ,^*sN ^ R4 jossa R^, R2, R^ ja r4, jotka voivat olla samanlaisia tai erilaisia, merkitsevät vetyä, halogeeniatomeja, alempi al-10 kyyli-, alempi alkoksi-, aryyli-, aralkyyli-, aralkoksi-, hydroksyyli-, karboksi-, karboksi-alempi alkoksi-, typpi-tai alempi asyyliaminoryhmiä, jolloin kaksi vierekkäistä substituenttia voi myös edustaa mahdollisesti halogenoitua fuusioitua bentseenirengasta, X on rikkiatomi tai mahdolli-15 sesti alempi alkyyli-, aryyli-, aralkyyli- tai asyyliryhmäl-lä substituoitu iminoryhmä, A on aminohappo- tai peptidi-ryhmä ja B on peptidikemiassa tavanomainen typpisuojaryhmä tai siitä johdettu.
On merkistevää, että kirjallisuus /Momose et ai.; 20 Chem. Pharm. Bull. 27:1148 (1979)^7 kuvaa 3-hydroksi-5-metyy-lipyrrolin epästabilisuutta. Tämä huomioiden oli yllättävää, että keksijät pystyivät valmistamaan ja eristämään 3-hydrok-si-5-fenyylipyrrolia (esillä olevan hakemuksen yhdiste III) 93,6 %:n saannolla stabiilina kiintoaineena. Verrattuna 25 US-patentin 4 278 763 mukaisiin indoksyyliyhdisteisiin, vaatimuksen kohteena olevat yhdisteet ovat edullisempia sta-bilisuutensa suhteen, ja tämä stabilisuusetu johtaan vaatimusten kohteena olevien yhdisteiden parempaan toimintakykyyn esitetyssä käytännössä.
30 Tässä kuvattua pyrrolin kytkemistä diatsoniumsuoloi- hin ei ole aikaisemmin esitetty. Huomattakoon myös, että asylaatiomenettely ei ilmene tekniikan tasosta. Fenoleilla toimivat asylaatio-olosuhteet johtavat näillä pyrroleilla N-asyylin, O-asyylin ja Ν,Ο-asyylin seoksiin. Olosuhteet, 35 jotka toimivat indoksyyleillä, eivät toimi pyrroleilla.
Il . p 1 c 5 β
5 w I W V W
Esterien hydrolyysireaktiot voidaan tunnetusti aktivoida monilla nukleof Hiisillä aineilla, mm. alkoholeilla. Niinpä esteraasin aiheuttaman fenyyliasetaatin ja p-nitro-fenyyliasetaatin hydrolysoitumisen nopeus kasvaa 2,5 5,5- 5 kertaiseksi metanolin ja butanolin lisäyksen jälkeen; Green-zaid ja Jencks, Biochemistry, 10(7),1210-1227 (1971). Lisäksi tämä vaikutus paranee n-alkyyliryhmän pituuden funktiona; Wynne ja Shalatin, Eur. J. Biochem., 31, 554-560 (1972) .
10 Tämä alkoholien aktivoiva vaikutus on erityisesti havaittu aminohappoestereillä. Metanoli aktivoi (nopeuttaa) p-nitrofenyyli-N-asetyyli-L-alaninaatin hydrolyysiä; Fastrez ja Fersht, Biochemistry, 12(11), 2025-2034 (1973). Suurimo-lekyyliset alkoholit nopeuttavat p-nitrofenyyli-tert-BOC-L-15 tyrosinaatin esteraasin indusoimaa hydrolyysiäj Ashe ja Zimmer, Biochem. and Biophys. Res. Comm. 75(1), 194-199 (1977). US-patentissa 4 299 917 kuvataan muita tunnettuja esterihydrolyysin aktivaattoreita, esim. määrättyjä metal-likomplekseja, pyramiinijohdannaisia ja imidatsoleja.
20 Tunnetusti käytetään myös määrättyjä diatsoniumsuo- loja fenolien ja pseudofenolien kytkemiseksi atsoväriaineik-si, Martinet ja Dornier, Compt. Rend., 170, 592 (1920).
Tätä tekniikkaa käytetään esteraasianalytiikassa, jossa in-doksyyliasetaatti hydrolysoidaan esteraasin avulla atsovä-25 riaineeksi; Holt ja Hicks, J. Cell. Biol., 29, 361-366 (1966); Gossrau, Histochemistry, 57, 323—342 (1978); DE-hakemusjulkaisu 3 117 721, jätetty 9.5.1980.
Väriaineteollisuus, jota ei mitenkään voida yhdistää lääketieteellisiin diagnosointimenetelmiin, mutta josta 30 kuitenkin on jo kauan ammennettu kokeelliseen orgaaniseen kemiaan liittyviä menetelmiä, tarjoaa määrättyihin aminohappoihin ja niiden syklisointireaktioihin liittyviä osviittoja. Niinpä on tunnettua valmistaa pyrroleja lisäämällä glysiiniä y3-fenyyliglysidiinihapon suoloihin ja käsittele-35 mällä sitten kuumalla asetanhydridillä; Madelung ja Obermann, Ber., 63, 2870 (1930).
6 81566
Esillä oleva keksintö tarjoaa uuden yhdisteen, jota voidaan käyttää leukosyyttien, esteraasin ja/tai proteaasin määrittämiseksi testinäytteestä. Keksinnön kohteena on myös menetelmä yhdisteen valmistamiseksi. Yhdisteellä on kaava 5
R* 0-A
X"jf i 1 n · R’ 10 jossa A on -COCH, tai -COCH-CH., 3 I 3
N
/ \ H Ts 15 jossa T on tosyyli, R on alempi alkyyli, jossa on 1 - 6 hiiliatomia, fenyyli tai kloorifenyyli, R* on H tai alempi alkyyli, jossa on 1 - 6 hiiliatomia, ja R' on H tai alempi alkyyli, jossa on 1 - 6 hiiliatomia.
20 Keksinnön mukaiselle menetelmälle yhdisteen valmista miseksi on tunnusomaista, että 1) annetaan vesiseoksen, jossa on ketonia, alkalime-tallimonopersulfaattia ja yhdistettä, jolla on kaava
R*n.— COOH
25 I
R S
jossa R ja R* ovat edellä määritellyt, reagoida sellaisen alkalimetattibikarbonaattimäärän läsnäollessa, että seoksen pH säilyy arvossa vähintään 7, jolloin muodostuu ensimmäi-30 nen reaktioseos, 2) lisätään ensimmäiseen seokseen yhdistettä HOOC-CH2NHR' toisen reaktioseoksen muodostamiseksi, 3) poistetaan vesi toisesta seoksesta, jolloin saadaan olennaisesti kuiva toinen seos, 35 4) lisätään etikkahappoanhydridiä kuivaan toiseen seokseen orgaanisen emäksen läsnäollessa, jolloin saadaan kolmas reaktiosoes, ja haluttaessa eristetään tästä seoksesta kaavan II mukainen esteri, jossa B on -COCH^, ja li 7 81566 5) kaavan II mukaisen esterin valmistamiseksi, jossa B on -COCH-CH., I 3 /Ns H Ts 5 hydrolysoidaan kohdassa 4) muodostunut seos tai siitä eristetty kaavan II mukainen esteri, jolloin saadaan reaktioseos, joka sisältää 3-hydroksipyrrolia, jolla on kaava "TT” 10 111 R i R' jossa R, R' ja R* ovat edellä määritellyt, 6) eristetään 3-hydroksipyrroli; lisätään happo-15 halogenidi, jolla on kaava Hal-COCH-CH^
N
/ \ ΙΓ Ts jossa Hai on halogeeni ja Ts on tosyyli, 3-hydroksipyrro-liin orgaanisen hapon läsnäollessa, jolloin saadaan tuote-20 seos, joka sisältää kaavan II mukaista esteriä, jossa B on -COCH-CH- i 3
A
H Ts jossa Ts on tosyyli, ja saadaan tuoteseos, ja eristetään 25 kaavan II mukainen esteri tuoteseoksesta.
Alempi alkyyli voi olla substituoimaton tai substi-tuoitu, mikäli tällainen substituenttiryhmä(t) ei haittaa koostumuksen tai testivälineen toimivuutta tai funktionaali-suutta leukosyyttisolujen, esteraasin tai proteaasin määrit-30 tämisessä. Tällaisten substituenttien valinta on käsiteltävänä olevassa hakemuksessa selvyytenä pidettävää laborato-riorutiinia.
Tämän keksinnön mukainen yhdiste käsittää laajan joukon estereitä, joiden alkoholinen (fenolinen) osa ja 35 asyyliosa voidaan valita vastaamaan kulloisiakin tarpeita.
Niinpä alkoholiosa voidaan sovittaa antamaan määrätty, haluttu reaktio, eism. määrätty väri tai valoabsorbanssi, ja asyy-liryhmä voidaan valita todettavan analyytin mukaan.
8 81 5 66
Esterin alkoholiosa on siinä mielessä pseudofenoli, että alkoholiosassa on heteroatomi, jonka elektronipari voi delokalisoitua ja aiheuttaa aromaattisuutta renkaan kaksois-sidosten tapaan, Heteroatornina X on typpi. Typpi voi olla 5 substituoimaton, ts. NH, tai substituoitu alempi-alkyyli-ryhmällä. Tämän aromaattisen luonteensa ansiosta yhdiste kytkeytyy helposti diatsoniumsuolaan atsoväriaineeksi esterin hydrolysoitumisen jälkeen.
On havaittu, että erilaiset substituentit renkaan 10 5-asemassa parantavat värinmuodostusta ja varastointikestä-vyyttä. Leukosyyttien, esteraasin tai proteaasin määrittämisessä suositeltavia ovat esterit, joissa R on fenyyli tai p-kloorifenyyli.
Asyyliosan A valinnan sanelee määritettävä kohde. Ha-15 luttaessa määrittää testinäytteestä esteraasi- tai proteaa-siaktiivisuus, esim. laskea virtsan leukosyytit, A on edullisesti N-tosyyli-L-alaniinitähde.
Keksintö käsittää myös uuden menetelmän kaavan II mukaisten pyrroliesterien syntetisoimiseksi. Menetelmän ensim-20 mäisessä vaiheessa muodostetaan kaavan III mukainen 3-hydrok-sipyrroli. Tämä tapahtuu monivaihesynteesinä, jossa lähtöaineena on kaavan IV mukainen yhdiste. Tämän yhdisteen annetaan reagoida asetonin tai muun ketonin läsnäollessa epoksi-diyhdisteeksi, jolla on kaava
25 R*'V"'C00H
0 V
Epoksidointi suoritetaan mieluiten käyttäen alkali-30 metallimonopersulfaattia, esim. KHSO,-:tä, joka on saatavis- (r) ^ sa kauppanimellä Oxone^ (DuPont Company). On havaittu, että pH:n säätö tässä vaiheessa /1, 2j helpottuu dramaattisesti, jos reaktio suoritetaan alkalimetallibikarbonaatin, esim. NAHC03:n läsnäollessa, eli pH:ssa vähintään 7. Reaktioseos 35 pidetään mieluiten lämpötilassa n. 20 - 30°C, joskaan tämä lämpötila-alue ei ole kriittinen. Hapottamalla muodostunut reaktioseos ja lisäämällä sitten orgaanista liuotinta, kuten metyleenikloridia, saadaan epoksidi uutettua orgaaniseen faasiin.
Il 9 81 5 66 Tämän jälkeen orgaaninen faasi pestään emäs/vesiliuok-sella. Tämä vaihe tekee epoksidin vesiliukoiseksi ja epoksi-di siirtyy vesifaasiin. vesifaasi eristetään ja lisätään glysiiniä, jolloin muodostuu reaktioseos, joka sisältää kak-5 soissuolaa R*
HO-C-COO
R-C-N"^ 2 COO VI
I I
H R' 10
On havaittu, että tämä vaihe sujuu parhaiten, kun emäs/vesiliuoksen pH on n. 10,5 - 12, suositeltavasti noin 11,5. Tämän vaiheen lämpötila kohotetaan mieluiten noin 100°C:seen ja poistetaan olennainen määrä matalalla kiehu-15 vaa nestettä (asetonia ja vettä). Kun höyryn lämpötila saavuttaa 100°C, palautuslämpötilaa ylläpidetään kuumentamalla tasan tai likimäärin 100°C:ssa. Kun on jäähdytetty, pesty orgaanisella liuottimena, kuten CH2Cl2:lla ja haihdutettu kuiviin (jäljellä olevan veden poisto), eristetään yhdiste 20 (VI) jäännöksestä keittämällä liuottimessa, kuten etanolissa ja annetaan kiteiden saostua.
Tämän jälkeen yhdistettä (VI) käsitellään karboksyyli-happoanhydridillä ja saadaan 25 R* O-Ac R* O-Ac ΤΪ Ti
n „ An> VII
I R I
Ac R" 30 1) J. O. Edwards et ai.; Photochem. Photobiol., 30, 63 (1979) 2) R. Curci et ai., J. Org. Chem., 45, 4758 (1980) 10 81 566 jossa "R" on alempi alkyyli. Ac on asetaatti, kun anhyd-ridinä käytetään asetanhydridiä. Tässä vaiheessa toimitaan aluksi ympäristön lämpötilassa ja lopuksi kuumennetaan n.
90 - n. 140°C:ssa. Tämän vaiheen avainkohtana on orgaanisen 5 emäksen, kuten pyridiini läsnäolo. Mieluiten yhdiste (VI) suspendoidaan emäkseen ja sitten lisätään happoanhydridi.
Näin muodostunut, yhdistettä (VII) sisältävä reaktio-seos voidaan haihduttaa kuiviin jäljelle jääneen anhydridin ja liuottimen poistamiseksi ja tuote (VII) otetaan talteen.
10 Yhdisteen (VII) hydrolyysi johtaa yhdisteeseen
R*v._.OH
JO viir 15 R'
Hydrolyysi suoritetaan mieluiten seoksessa, jossa on alkoholia; kuten metanolia ja emäksen vesiliuosta, kuten 2 N NaOH-liuosta. On suositeltavaa sekoittaa yhdiste (VII), alkoholi ja emäksen vesiliuos matalassa lämpötilassa, esim.
20 n. -15 - n. 10°C:ssa. Tässä lämpötilassa yhdiste (VIII) yleensä saostuu liuoksesta ja yhdiste eristetään esim. suodattamalla ja puhdistetaan.
Toisessa menetelmävaiheessa yhdiste (VIII) esteröi-dään tuotteeksi
25 R%_/0-B
JTjJ
R* 30 jossa B on -COCH, tai -C0CH-CHo 3 l 3 H-N-Ts
Yhdiste (VIII) lisätään vedettömään liuottimeen, esim. tetra-hydrofuraaniin (THF), dietyylieetteriin tai vastaavaan, joka 35 sisältää orgaanista emästä, kuten pyridiiniä ja orgaanista li
/-ι Λ S S
11 ö 1 DOO
happoa, kuten trifluorietikkahappoa, oksaalihappoa, sitruuna-happoa, etikkahappoa tai muuta karboksyylihappoa. Tässä vaiheessa suoriteltavia ovat pyridiini ja trifluorietikkahappo. Tämän jälkeen lisätään hitaasti happohalogenidia, jolla on 5 kaava Hal-COCH-CH3, jossa Hai on halogeeni ja Ts on tosyyli.
N
/ N
H Ts,
Reaktion mentyä loppuun se keskeytetään lisäämällä vettä, joka valinnaisesti sisältää puskuria, kuten sitruunahappoa ja 10 etyyliasetaattia ja tuote (IX) otetaan talteen.
Seuraavien esimerkkien tehtävänä on auttaa toteuttamaan ja käyttämään käsiteltävänä olevaa keksintöä. Niinpä kokeellisten toteuttamismuotojen hyväksikäytön tukena on käytännön yksityiskohtia ja analyysituloksia. Esimerkit 15 pelkästään valaisevat tässä kuvattua keksintöä ja siihen liittyviä patenttivaatimuksia niitä rajoittamatta.
Seuraavassa kokeellisessa osassa on käytetty lyhenteitä: g = gramma kg = kilogramma 20 1 = litra ml = millilitra M = moolinen mM = millimoolinen N = normaalinen 25 ekv = ekvivalentti mol = grammamolekyylipaino (mooli) mmol = grammamolekyylipaino x 10 ^ (millimooli) aq = vedellinen h = tunti 30 TLC = ohutkerroskromatografia
Infrapuna(IR)spektrit ajettiin infrapunaspektrometrillä Perkin-Elmer malli 71 OB tai 237 CHCl,-liuoksina, jollei muuta ilmoiteta. Polystyreenikalvon kaistaa 1602 cm käytettiin ulkoisena kalibrointistandardina. Signaalit on 35 ilmaistu cm .
Protonimagneettiset resonanssispektrit ( H-NMR) ajettiin kohdassa 89,55 MHz spektrometrillä Jeol FX-900 tai 12 81 566 kohdassa 60 MHz spektrometrillä Varian T-60. Jollei muuta ilmoiteta, ajettiin spektrit CDCl-j-liuoksina. Kemialliset siirtymät on ilmoitettu miljoonasosina kentässä alaspäin sisäisestä standardista tetrametyylisilaanista laskettuna.
5 Hiili-13 magneettiset resonanssispektrit (13c-NMR) ajettiin kohdassa 22,5 MHz spektrometrillä Jeol FX-900 käyttäen Fourier-transformaatiota ja täyttä protonileveäkais-takohinan irtautumista. Jollei muuta ilmoiteta, ajettiin spektrit CDCl-j-liuoksina. Hiilen siirtymät on ilmoitettu mil-10 joonasosina kentässä alaspäin sisäisestä standardista tetra-metyylisilaanista laskettuna.
Massaspektrit (MS) saatiin spektrometrillä Hewlett-Packard 5985A, jonka toimintatapa oli joko elektronitörmäys (El) tai nopea-atomipommitus (FAB). Suuren erotuskyvyn mas-15 saspektrit saatiin spektrometrillä AEI MS-902.
Orgaanisten reagenssien valmistaja oli Aldrich Chemical Company ja ne käytettiin puhdistamatta, jollei muuta ilmoiteta. Epäorgaanisina reagensseina käytettiin Fisher Scientific Company'n ACS-laatuisia tai muiden tunnettujen val-20 mistajien reagensseja. Reaktioliuottimet olivat ACS-reagens-silaatua; tetrahydrofuraani (THF) oli J. T. Baker Chemical Company'n HPLC-laatua. Keittosuolaliuoksella tarkoitetaan natriumkloridin kyllästettyä vesiliuosta.
Ohutkerroskromatografia suoritettiin E. Merck'in sili-25 kageelilevyillä 60F-254. Pylväskromatografia suoritettiin E. Merck'in silikageeli 60:llä (70-230 meshiä). Kaikki ilmoitetut sulamispisteet ja kiehumispisteet ovat korjaamattomia.
Yhdisteen synteesi 3-(N-tosvvli-L-alaninvvlioksi)-5-fenvvlipyrrolin (4) 30 synteesi
Yhdiste (4) syntetisoitiin seuraavan reaktiokaavion mukaisesti
II
13 81 566
COOH COOH
/ < KHS05, H20 HC1 asetoni, NaHCÖ^
I KOH/EtO
COO~K+ ho i .. . <ζΓ \ glysuni - ch-coo"k+ koh i"0. <oVc.{ (of NHCH2COO k iUU c
Ac20 pyridiini 120°C i1
— m. OH
^ O-Ac y
(21 O I Ma°H, »eOH/H2Q, I (J I H
Ac 0®C * (3) + 0 I) O-C-CH-CH, 0 _/ > 3 ii j A h'N'Ts (4) fOl H M-IBS--
pyridiini, TFA
0°C
14 81 566 N-tosyyli-L-alaniini
Liuotettiin 100 g (1,11 mol) L-alaniinia 2,25 litraan 1 N natriumhydroksidia (aq) ja jäähdyttäen 5°C:ssa ja sekoittaen lisättiin hitaasti liuos, jossa oli 218 g 5 (1,11 mol) p-tolueenisulfonyylikloridia 450 ml:ssa toluee- nia. Seosta sekoitettiin ympäristön lämpötilassa 20 tuntia. Kerrokset erotettiin toisistaan ja jäähdytetty vesikerros hapotettiin pH-arvoon 1 väkevällä kloorivetyhapolla. Valkoinen kiinteä otsikkoyhdiste eristettiin suodattamalla, pes-10 tiin vedellä ja kuivattiin. Saanto 178,5 g (66 %), sp.
134-135°C. IR (CHC13) cm"1 1726, 1340, 1165, 1095; 1H-NMR (DMS0-D6) <Sl,20 (d, J = 7,3 H), 2,40 (s, 3H) , 3,85 (p, J = 8,1 H), 6,4 (leveä d, 1H) (C02H), 7,41 (d, J = 8,2H) ja 7,75 (d, J = 8,2H) £kuviokeskus: 7,58; = 20,49 Hz7,
i\D
15 8,03 (leveä d, J = 8,1H) (NH).
N-tosyyli-L-alaninyylikloridi
Menetelmä A
Seosta, jossa oli 12,4 g (0,05 mol) N-tosyyli-L-alaniinia ja 25 ml tionyylikloridia, kuumennettiin 90 mi-20 nuuttia 55°C:ssa ja konsentroitiin sitten kiertohaihdutti-messa 40°C:ssa. Jäljelle jäänyt punainen kiintoaine liuotettiin 200 ml;aan kiehuvaa hiilitetrakloridia, väri poistettiin 20 g:lla lämpökaapissa kuivattua Norit® 211:ta (American Norit Co., Inc.), suodatettiin ja jäähdytettiin.
25 Kermanvärinen kiinteä otsikkoyhdiste eristettiin suodattamalla, pestiin heksaanilla ja kuivattiin. Saanto 8,48 g (65 %), sp. 101-101,5°C; IR (CHC13) cm"1 3360, 3260, 3025, 1775, 1605, 1350, 1170, 910; 1 H-NMR (CDCl-j) S 1,48 (d, J = 7,3H), 2,43 (s,3H), 4,33 (p, J = 8, 1H), 5,93 (leveä d, 30 J = 8, 1 H), 7,31 (d, J = 8, 2H) ja 7,76 (d, JÄn = 8, 2H)
nD nD
/Kuviokeskus: 7,53; Δν = 26,83 Hz} .
nD
Analyysi c-j oH-| 2C1"N03S Laskettu: C 45,89 H 4,62 N 5,35 Saatu; C 46,63 H 4,90 N 5,19
II
15 81 566
Menetelmä B
Seosta, jossa oli 3,1 g (13 mmol) N-tosyyli-L-alaniinia ja 6 ml tionyylikloridia, kuumennettiin 90 minuuttia 50°C:ssa ja laimennettiin sitten 50 ml s 11a kuivaa 5 heksaania. Seosta sekoitettiin lyhyen ajan, jäähdytettiin ja kiintoaine eristettiin suodattamalla. Saanto 3,15 g (93 %), sp. 99-100°C. IR-spektri oli sama kuin menetelmän A mukaan valmistetulla, uudelleenkiteytetyllä aineksella.
2-hydroksi-3-(karboksimetyyliamino)hydrokanelihapon 10 dikaliumsuoladihydraatti (1)
Sekoitettua suspensiota, jossa oli 1,0 kg (7,75 mol) transkanelihappoa 4,5 litrassa asetonia, käsiteltiin ensin 2,47 kg:lla (29,4 mol, 4,36 ekv) NaHCC>3:a ja sitten varovasti 4,5 litralla vettä. Muodostunutta sakeaa seosta käsi-15 teitiin tiputtaen 1,5 - 2,0 tunnin aikana liuoksella, jossa oli 3,78 kg (jossa 1,825 ekvivalenttia KHSO^stä) Oxone-monopersulfaattiyhdistettä 0,4 millimoolissa dinatrium-etyleenidiamiinitetraetikkahapon (EDTA) vesiliuoksessa (14,5 litraa, valmistettu liuottamalla 2,17 g dinatrium-20 EDTA-dihydraattia 14,5 litraan tislattua vettä). Tämän lisäyksen aikana reaktiolämpötila ylläpidettiin 24-27°C:ssa vesihauteen avulla. Havaittiin, että reaktio-pH oli n. 7,4. Lisäyksen päätyttyä seosta sekoitettiin vielä 0,5 tuntia ja jäähdytettiin sitten 10°C:seen. Reaktioseos hapotettiin 25 n. 1,2 litralla väkevää HCl:ää pH-arvoon 2 samalla ylläpitäen lämpötila n. 10°C:ssa, sitten reaktioseosta käsiteltiin 5,05 litralla CH2Cl2:ta ja sekoitettiin voimakkaasti 10 minuuttia .
Seoksen annettiin laskeutua, vesikerros poistettiin 30 dekantoimalla ja asetettiin syrjään ja orgaaninen kerros, joka sisälsi liuekenematta jääneitä suoloja, ja imusuodatet-tiin paperin läpi. Suodattamalla eristetty kiintoaines pestiin uudelleen 3,15 litralla C^C^ita ja vesikerros uutettiin tällä suodoksella. Yhdistetyt CH2Cl2~kerrokset uutet-35 tiin liuoksella, jossa oli 593,3 g KOHrta 6,31 litrassa ie 81566 vettä. Usein joudutaan lämmittämään varovasti 40°C:seen emäsuuton aikana saostuneen kiintoaineen liuottamiseksi.
Sitten CH2Cl2~kerros uutettiin liuoksella, jossa oli 99 g KOHrta 1,5 litrassa vettä, ja yhdistettyjä emäsuutteita 5 käsiteltiin 481,7 g:lla (6/416 mol, 0,95 ekv) glysiiniä. Orgaaninen kerros hylättiin.
Vesiliuoksen pH säädettiin arvoon 11,5 25-%:isella KOH-vesiliuoksella ja kuumennettiin sitten kiehuvaksi. Poistettiin tislaamalla n. 900 ml matalalla kiehuvaa nestettä 10 (asetonia ja vettä), kunnes höyryn lämpötila oli 99°C, ja sitten seosta kuumennettiin palautuslämpötilassa kaksi tuntia. Jäähtymisen jälkeen reaktioseos uutettiin 3,15 litralla CH2Cl2:ta, CH2Cl2-faasi hylättiin ja vesifaasi haihdutettiin kuiviin vakuumissa 70°C:n hauteessa. Jäännöstä keitettiin 15 8,83 litrassa 95-%:ista etanolia (EtOH) 30 minuuttia ja an
nettiin sitten jäähtyä hitaasti samalla sekoittaen, jolloin tuote saostui hienoina kiteinä. Kiteet eristettiin suodattamalla, pestiin 1,26 litralla tuoretta 95“%:ista EtOH:ta, kuivattiin 50 - 60°C:n lämpökaapissa ja saatiin 1,77 kg 20 (74,6 %) otsikkoyhdistettä valkoisina kiteinä, sp. 120-122°C
(korjaamaton).
IR (KBr) cm-1 3420 (leveä), 1590 (leveä). 1410, 1130, 710; 1H-NMR (D20-TSP) ξ 3,1 (s,2H), 3,89 (d, JftB = 4, 1H) ja 4,52 (d, JM = 4, 1H) /kuviokeskus: 4,21; ΔνΑβ = 18,83 Hz/, 25 4,68 (s, 6H, vaihtuvia protoneja), 7,4 (s, 5H); TLC R^ = 0,59 (EtOH: 1 M trietyyliammoniumbikarbonaatti, 7:3).
Analyysi C^H^NO^K^^
Laskettu: C 37,59 H 4,30 N 3,99
Saatu: C 37,22 H 4,24 N 3,96 30 N-asetyyli-3-asetoksi-5-fenyylipyrroli (2)
Suspensiota, jossa oli 1,0 kg (2,84 mol) 2-hydroksi- 3-(karboksi-metyyliamino)hydrokanelihapon dikaliumsuoladi-hydraattia (1) 3,0 litrassa pyridiiniä, käsiteltiin 4,0 litralla asetanhydridiä ympäristön lämpötilassa ja inertissä kaa-35 sukehässä. Syntyi lievästi eksoterminen reaktio ja lämpötila
II
17 81 566 kohosi eksponentiaalisti 60-70°C:seen 1,5-2,5 tunnin aikana.
Kun reaktioseos alkoi jäähtyä reaktion jatkuessa, kuumennettiin 15 minuuttia 120-123°C:ssa ja sitten annettiin jäähtyä ympäristön lämpötilaan tunnin aikana, jona aikana pyridinium-5 asetaatti saostui kiteisenä. Seos imusuodatettiin paperin läpi ja suolat pestiin etyyliasetaatilla (EtOAc) värittömiksi. Suodos haihdutettiin kuiviin vakuumissa.
Tummanpunainen jäännös liuotettiin 3,0 litraan EtOAc:ta, pestiin kolmasti 1,0 litralla vettä, kuivattiin magnesiumsul-10 faatin päällä ja käsiteltiin 300 g:lla Darcc^G60:ta (ICI
Americas, Inc.). Kun oli sekoitettu 30 minuuttia, seos suodatettiin Celiteri^ (Johns-Mannville) läpi, haihdutettiin kuiviin vakuumissa ja saatiin punertavan organssinvärinen öljy. öljy liuotettiin 1,2 litraan lämmintä 2-propanolia ja sitten 15 annettiin hitaasti jäähtyä ympäristön lämpötilaan yli yön, jona aikana saostui kiintoaine. Kiteinen tuote eristettiin suodattamalla, pestiin 2-propanolin 50 %:isella vesiliuoksella, kuivattiin ja saatiin 417 g (60 %) otsikkoyhdistettä, sp. 58-60°C (korjaamaton). Osyi tästä otettiin dietyylieetteriin 20 (Et20), käsiteltiin Norir^211:llä, suodatettiin ja konsent roitiin vakuumissa. Seisotettaessa 0°C:ssa erottui värittömiä, ohuita neulasia. Nämä eristettiin suodattamalla, pestiin Et20-heksaanilla (1:1), kuivattiin vakuumissa ja saatiin analyyttinen näyte, sp. 60-62,5°C (korjaamaton).
25 IR (CHC1-) -1 3020, 1760, 1730, 1595, 1378, 1320, 1220 «3 cm λ (leveä), 1030, 960, 903; 'h-NMR (CDC13) &2,23 (s, 3H) , 2,27 (s, 3H) 6,18 (d, J = 2, 1H), 7,35 (s, 5H), 7,42 (J = 2, 1H); TLC R^ = 0,56 (tolueeni-dioksaani 4:1).
Analyysi C14H1;}N03 30 Laskettu: C 69,12 H 5,38 N 5,76 Saatu: C 68,88 H 5,25 N 5,53 18 81 566 3-hydroksi-5-fenyylipyrroli (3)
Hienonnetusta osasta N-asetyyli-3-asetoksi-5-fenyylipyrrolia (2) (36,8 g, 0,15 mol) poistettiin happi sekoittamalla argonvirrassa 10 minuuttia ja suspendoitiin 5 sitten 379 ml:aan hapettomaksi tehtyä metanolia (MeOH), joka oli jäähdytetty -6°C:seen (-15°C:n metanoli(MeOH)-kuivajäähauteessa) inertissä kaasukehässä, ja käsiteltiin nopeasti 300 ml:11a jääkylmää, hapettomaksi tehtyä 2 N NaOH-liuosta. Välittömästi lisäyksen jälkeen lämpötila kohosi 10 18°C:seen ja noin kolmen minuutin kuluttua reaktioseos tuli homogeeniseksi. Reaktioseoksen jäähtyessä yhdiste 3 saostui hienoina kiteinä. Viidentoista minuutin kuluttua lisättiin 150 ml kylmää, hapettomaksi tehtyä 2 M sitruunahappoliuosta, muodostunutta seosta sekoitettiin 10 minuuttia ja suodatet-15 tiin sitten. Kiintoaine pestiin perusteellisesti 200 ml:11a hapettomaksi tehtyä vettä ilmalta suojaten, kuivattiin va-kuumissa yli yön ja saatiin 22,3 g otsikkoyhdistettä (93,6 %) vaaleanpunertavina pieninä neulasina.
IR (KBr) cm”1 3400, 3110, 2900, 1600, 1580, 1555, 1480, 20 1268, 1180, 742, 640; 1H-NMR (DMSO-D6) 5 6,1 (m, 1H), 6,3 (m, 1H), 7,0-7,7 (m, 5H), 8,0 (s, 1H), 10,4 (leveä s, 1H); TLC Rf = 0,20 - 0,28 (EtOH-CHCl3 1:9).
Analyysi C^H^NO Laskettu: C 75,45 H 5,70 N 8,80 25 Saatu: C 75,30 H 5,69 N 8,67 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-fenyylipyrroli (4) Liuosta, jossa oli 450 ml vedetöntä tetrahydrofuraa-nia (THF), 43,8 ml (0,542 mol, 1,2 ekv) pyridiiniä ja 85,0 ml (1,10 mol, 2,4 ekv) trifluorietikkahappoa ja jota pidettiin 30 0°C:ssa ja inertissä kaasukehässä, käsiteltiin yhtenä annoksena 71,5 g:lla (0,45 mol, 1,0 ekv) 3-hydroksi-5-fenyyli-pyrrolia (3) ja sitten lisättiin välittömästi tiputtaen 5-10 minuutin aikana liuos, jossa oli 141,0 g (0,54 mol, 1,2 ekv) vasta valmistettua N-tosyyli-L-alaninyylikloridia 35 450 ml:ssa vedetöntä THF:ää. Muodostunutta seosta sekoitettiin
II
ie 81566 15 minuuttia 0°C:ssa. Sitten reaktio keskeytettiin lisäämällä liuos, jossa oli 315 ml 1,0 M sitruunahappovesiliuos-ta ja 1,35 litraa EtOAc:tä. Lyhyen sekoittamisen jälkeen faasit erotettiin toisistaan ja orgaaninen faasi pestiin 5 360 ml:11a NaCl-vesiliuosta (0,18 g NaCl/ml vettä). Tämän jälkeen orgaaninen kerros uutettiin kahdesti 5 %:isella NaHCO^-vesiliuoksella (1,35 1 kummallakin kerralla) ja sitten pestiin 360 ml:n lisäannoksella NaCl-vesiliuosta (0,18 g NaCl/ml vettä). Punertavan ruskeata orgaanista kerrosta se-10 koitettiin ympäristön lämpötilassa 15 minuuttia 101 g:n mag- /p\ nesiumsulfaattia ja 143 g:n Darco'4^ G60: tä kanssa, sitten suodatettiin Celiten läpi ja haihdutettiin kuiviin vakuumis-sa 37°C:n hauteessa ja saatiin yhdiste (4) vaaleanpunaisen valkoisena kiintoaineena. Epäpuhdas tuote jauhettiin 15 hienoksi ja liuotettiin 250 ml:aan lämmintä (50°C) THF:ää, sekoitettiin voimakkaasti ja laimennettiin 250 ml :11a n-heksaania. Sekoitusta jatkettiin tunti ympäristön lämpötilassa tuotteen kiteytyessä. Kiintoaine eristettiin suodattamalla, pestiin n. 1 litralla tolueenia suodoksen värittömyyteen 20 saakka, kuivattiin sitten yli yön ja saatiin 112 g (65 %) otsikkoyhdistettä valkoisena jauheena, sp. 154,5 - 155°C.
IR (KC1) cm"1 3350, 3325, 1760, 1508, 1320, 1155, 770; 1H-NMR (DMSO-d6) $ 1,33 (d, J = 7, 3H), 2,36 (s, 3H), 4,13 (p, J = 8, 1H), 6,25 (m, 1H), 6,73 (m, 1H), 7,05-7,50 (m, 25 5H), 7,5-7,85 (m, 4H), 8,42 (d, J = 8, 1H), 11,18 (leveä s, 1H); 13C-NMR (DMSO-d6) 5 18,335, 21,001, 51,370, 98,061, 108,336, 123,423, 126,024, 126,610, 128,560, 128,756, 129,601, 132,397, 137,600, 138,380, 142,737 ja 169,919.
&7d = -70° (c = 1,11, MeOH); TLC Rf = 0,45 (EtOHAc-hek-30 saani, 1:1); TLC Rf = 0,40 (tolueeni-dioksaani, 4:1)
Analyysi C20H2()N2O4S
Laskettu: C 62,48 H 5,24 N 7,29
Saatu: C 62,62 H 5,27 N 7,30 20 81 566 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-l-metyyli-5-fenyy-lipyrrolin (13) synteesi
Suoritettiin sarja kokeita yhdistettä (I) vastaavan otsikkoesterin valmistamiseksi, jossa A on N-tosyyli-L-alaninyyli, R on fenyyli, R* on H, X on NR' ja R' on CH^. Reaktiosekvenssi on seuraava:
/COOK
H0 vcook
NH(CH7)CH9COOH I
k r>VT N ^C00K
koh/h2o w KjJ I
''j (10)
Ac2°
Et3N i f _^ OH _^0>γ*0Η3 roJ. (oJT ° CH3 2 CH3 (12) dl)
O
n cf3cooh ci-c-ch-ch3 pyridiini THF H Ts * o
II
_^0-C-CH-CH3
\ il N
___ l· J s \ /\AN/ H Ts
fOJ I
CH, J (13)
II
2i 81566 2-hydroksi-3-(N-metyylikarboksimetyyliamino)hydrokaneliha-pon dikaliumsuola (10)
Seosta, jossa oli 30 g (0,15 mol) /3-fenyyliglysi-diinihapon kaliumsuolaa, 13,2 g (0,15 mol) N-metyyligly-5 siiniä, 119 ml vettä ja 22,3 ml 9 N KOH-liuosta, kuumennettiin palautuslämpötilassa kolme tuntia ja saatiin vaaleankeltainen liuos. Reaktioseos haihdutettiin kuiviin vakuumis-sa 70°C:ssa. Sitten jäännös kiteytettiin 100 ml:sta 95-%:ista EtOH:ta ja saatiin valkoinen kiintoaine, joka kui-10 vattiin yli yön vakuumissa ja 110°C:ssa ja saatiin 30,8 g valkoista kiintoainetta (10) (saanto 63 %).
IR (KC1) cm-1 3360 (leveä), 1580, 1405, 705; 1H-NMR (CD3OD) ί 2,30 (s, 3H), 2,98 (s, 2H), 3,70 (d, J = 3 Hz, 1H), 4,48 (d, J = 3 Hz, 1H), 4,92 (s, 1H), 7,40 (s, 5H); TLC Rf = 0,51 15 (EtOH-1 M trietyyliammoniumbikarbonaatti 7:3). (Tuotteen alin sulamispiste oli 270°C).
3-asetoksi-1-metyyli-5-fenyylipyrroli (11)
Seosta, jossa oli 15,2 g (46 mmol) 2-hydroksi-3-(N-metyylikarboksimetyyliamino)hydrokanelihapon dikalium-20 suolaa (10), 173 ml asetanhydridiä ja 308 ml trietyyliamii-nia, kuumennettiin 90°C:ssa 19 tuntia. Reaktioseos, jonka väri muuttui tummanruskeaksi, eristettiin suodattamalla ja kiintoaine pestiin eetterillä. Suodos haihdutettiin vakuumissa ja saatiin tummanruskea jäännös, joka otettiin 300 25 ml:aan eetteriä ja 200 ml:aan vettä. Kerrokset erotettiin toisistaan ja eetterikerros pestiin toisella 200 ml:n vesi-annoksella. Sitten eetteriliuos kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä, suodatettiin, konsentroitiin vakuumissa ja saatiin 10,7 g ruskeata jäännöstä, josta kuulaputkitislauksen 30 ja eetteristä uudelleenkiteyttämisen jälkeen saatiin 3,0 g valkoisia kiteitä (11); (saanto 30 %) , sp. 64-65°C.
IR (CHC13) cm-1 2990, 1750, 1570, 1518, 1482, 1375, 1240 (leveä), 1024, 910, 700; 1H-NMR (CDCl3) <$ 2,20 (s, 3H), 3,58 (s, 3H), 6,10 (d, J = 2 Hz, 1H), 6,75 (d, J = 2 Hz, 35 1 H), 7,35 (s, 5H); TLC Rf = 0,58 (heksaani-EtOAc 7:3).
Analyysi C^H^NC^
Laskettu: C 72,54 H 6,10 N 6,44 Saatu: C 72,57 H 6,09 N 6,51 22 81 566 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-1-metyyli-5-fenyyli-pyrroli (13)
Seokseen, jossa oli 15,5 ml hapettomaksi tehtyä metanolia ja 1,3 g (6,2 mmol) 3-asetoksi-1-metyyli-5-fe-5 nyylipyrrolia (11) argonsuojassa, lisättiin 12,5 ml hapettomaksi tehtyä 2N NaOH-liuosta. Reaktioseosta sekoitettiin jäähauteessa 15 minuuttia. Sitten lisättiin 7 ml hapettomaksi tehtyä 2 M sitruunahappoliuosta ja muodostunutta seosta sekoitettiin jäähauteessa 8 minuuttia. Reaktioseos konsentroi-10 tiin vakuumissa, lisättiin 20 ml vettä ja uutettiin kahdesti 50 ml:lla etyyliasetaattia (EtOAc). EtOAc-kerrokset yhdistettiin, kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä, suodatettiin, konsentroitiin vakuumissa ja saatiin 3-hydroksi-1-metyyli-5-fenyylipyrroli (12) oranssinvärisenä jäännöksenä. Oranssin-15 väriseen jäännökseen lisättiin argonsuojassa kylmä liuos, jossa oli 12,4 ml THF:ää, 0,6 ml (7,4 mmol, 1,2 ekv) pyri-diiniä ja 1,2 ml (15 mmol, 2,4 ekv) trifluorietikkahappoa ja sitten lisättiin välittömästi liuos, jossa oli 1,2 g (7, 4 mmol, 1,2 ekv) vasta valmistettua N-tosyyli-L-alaninyy-20 likloridia 12,4 ml:ssa vedetöntä THF:ää. Muodostunutta seosta sekoitettiin tunti 0°C:ssa. Sitten reaktio keskeytettiin lisäämällä 5 ml 1 M sitruunahappo'-vesiliuosta ja 30 ml EtOAc:ta. Lyhyen sekoittamisen jälkeen kerrokset erotettiin toisistaan ja orgaaninen kerros pestiin peräkkäin kyllästetyllä NaCl-25 liuoksella, kahdesti 5“%:isella NaHCO^-liuoksella ja uudelleen kyllästetyllä NaCl-liuoksella. Sitten EtOAc-uute kuivat-tiin magnesiumsulfaatin päällä, käsiteltiin Norit 211:llä, suodatettiin, konsetroitiin vakuumissa ja saatiin epäpuhdas tuote (13) oranssinvärisenä jäännöksenä. Tämä liuotettiin 30 5 ml:aan heksaani-EtOAc:tä (1:1) ja kromatografoitiin pyl väässä (100 g Si02:ta) eluoiden heksaani-EtOAc:llä (7:3) ja saatiin 1 g yhdistettä (13) sakeana, vaalean oranssinvärisenä öljynä. Osa tästä epäpuhtaasta tuotteesta puhdistettiin edelleen puolipreparatiivisella HPLC:llä (pylväs: IBM-silika 35 1 cm x 25 cm, liikkuva faasi: heksaani-EtOAc 8:2, virtausno- 2 peus:4,0 ml/min, paine:0,014 kg/cm ) ja saatiin hunajanväri-nen, sakea öljy (13).
Il 23 81 566 IR (kalvo) cm”1 3260, 2950, 1760, 1520, 1350, 1170, 770; 1H-NMR (DMSO-dg) £ 1,28 (d, J = 7 Hz, 3 H), 2,36 (s, 3H), 3, 58 (s, 3H), 5,85 (d, J = 2 Hz, 1H), 6,15 (m, 1H), 6,74 (d, J = 2 Hz, 1 H), 7,30-7,80 (m, 9H), 8,37 (d, J = 8 Hz, 5 1H); 13C-NMR (DMSO-dg) ppm 8,205, 20,936, 34,917, 51,240, 100,598, 113,148, 126,544, 127,000, 128,105, 128,560, 129,601, 130,901, 132,202, 135,714, 138,315, 142,672, 169,724; TLC Rf = 0,52 (tolueeni-dioksaani 4:1); suuren erotuskyvyn massaspektri, C21H22N204S:lle laskettu 10 m/e 398,1300, saatu m/e 398,1297.
3-(N-tosvvli-L-alaninyylioksi)-5-(p-kloorifenyyli)-pyrrolin (18) synteesi
Suoritettiin sarja kokeita yhdistettä (I) vastaavan otsikkoesteriyhdisteen valmistamiseksi, jossa A on N-tosyyli-15 L-alaninyyli, R on p-kloorifenyyli, R* on H, X on NR' ja R' on H. Reaktiosekvenssi oli seuraava: 24 81 566
COO H
^ COOH
fQJ H2°' KHSOg HC1 p fOj
Cl asetoni, NaHcS, 3 Cl (14) 100°C KHO, H20 glysiini pH = 11,5-12,0 s' °AC HO^. COO_K+
Xl T ^ . +
Aco0 X^X^N^^COO K · H o J& L ioJ i
Cl 121-122° Cl'V (15) (16)
NaOH
CH-.OH
„20 1 f
O
OH 11 rn 0-C-CH--CH., ,-S o _/ » 2 3 JTjj C1-C-CH2-CH3 i| i >N\ j§n A, ίοΛ" CF3COOH Cl (17) pyridiini (18>
THF
II
25 81 566
Trans-fb -(p-kloorifenyyli)glysidiinihappo (14) Sekoitettuun suspensioon, jossa oli 68,5 g (0,375 mol) p-kloori-kanelihappoa 260 ml:ssa asetonia, lisättiin 137 g (1,63 mol) NaHCO^sa ja sitten lisättiin hitaasti 260 ml 5 vettä. Tähän seokseen lisättiin 2,5 tunnin aikana 22-27°C:ssa seos, jossa oli 211 g (0,343 mol) Oxone:a,120 mg dinatrium-EDTAiaa ja 805 ml vettä. Viiden tunnin kuluttua seos hapotet-tiin 70 ml:lla kylmää 12 N HCl:ää pH:n laskemiseksi arvoon n. 2,5 ja sitten seos uutettiin 700 ml:11a etyyliasetaattia.
10 Uute pestiin keittosuolaliuoksella, kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä, suodatettiin ja suodos haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Valkoinen kiintoaine kiteytettiin etyyliasetaatista, sp. 121-125°C (72,2 g, saanto 97 %). 1H-NMR (CDC13/ DMSO-D6) $ 7,3 (m, 4H), 4,05 (d, J = 2, 1H) ja 3,4 (d, 15 J = 2, 1H).
Analyysi CgH^ClO^
Laskettu: C 54,43 H 3,55 Cl 17,85 Saatu: C 54,53 H 3,80 Cl 17,91 2-hydroksi-3-(karboksimetyyllamino)-p-kloorihydro-20 kanelihapon dikaliumsuoladihydraatti (15)
Liuokseen, jossa oli 46,7 g (0,709 mol) 85 %:ista KOH:ta ja 400 ml vettä, lisättiin 25,9 g (0,345 mol) glysii-niä ja sitten 72,2 g (0,3635 mol) trans-yä-p-kloorifenyyli-glysidiinihappoa (14). Tätä seosta kuumennettiin kaksi tuntia 25 100°C:ssa, jäähdytettiin huoneen lämpötilaan ja lisättiin niin paljon KOH:ta, että pH kohosi arvoon 12. Samea liuos uutettiin kolmesti etyyliasetaatilla ja uute hylättiin. Kirkas vesiliuos (n. 500 ml) haihdutettiin kuiviin vakuumissa 70°C:n vesihauteella. Sitten kiintoaineet liuotettiin n.
30 350 ml saan kuumaa etanolia, suodatettiin ja suodosta jäähdy tettiin useita tunteja jäähauteessa. Kiteytynyt kiintoaines eristettiin suodattamalla ja pestiin pienellä määrällä kylmää etanolia, sp. 93-95°C, dekarboksyloitui 185°C:ssa (57,2 g, 41 %) .
26 81 566 1H-NMR (D20-TSP) 5 7,4 (s, 4H), 4,4 (d, J = 4, 1H), 4,05 (d, J = 4, 1H), ja 3,1 (s, 2H) .
Analyysi C1,|H.jqC1N0,.K2.2H20 Laskettu: C 34,24 H 3,66 N 3,63 5 Saatu: C 34,40 H 4,03 N 3,42 N-asetyyli-3-asetoksi-5-(p-kloorifenyyli)pyrroli (16) 10 g:aan (0,02591 mol) 2-hydroksi-3-(karboksimetyyli-amino)-p-kloorihydrokanelihapon dikaliumsuoladihydraattia (15) lisättiin 40 ml asetanhydridiä ja 30 ml pyridiiniä. Seos 10 kuumennettiin varovasti 35°C:seen, josta liuos lämpeni 67°C:seen eksotermiseksi ja alkoi sitten jäähtyä, jolloin kuumennusta jatkettiin. Seosta kuumennettiin tunti 121-122°C:ssa (sisälämpötila) ja sitten seos jäähdytettiin. Reaktioseokseen lisättiin n. 30 ml etyyliasetaattia, joka saosti suurimman 15 osan pyridiniumasetaattisuolasta. Tämä suola eristettiin suodattamalla ja pestiin pienellä määrällä etyyliasetaattia. Sitten suodos haihdutettiin vakuumissa öljyksi ja lisättiin jäävettä. Tuote uutettiin eetterillä ja eetteriuutteet pestiin peräkkäin kahdesti kylmällä, laimealla sitruunahappo-20 vesiliuoksella, kylmällä vedellä, kolmasti kylmällä, laimealla NaHC03-vesiliuoksella, kylmällä vedellä ja keittosuola-liuoksella, kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä ja suodatettiin. Suodosta käsiteltiin 10 g:llaDarco:a, sekoitettiin 20 minuuttia ja suodatettiin. Suodos haihdutettiin vakuumissa 25 öljyksi, öljyyn lisättiin 25 ml 2-propanolia. Muodostuneesta liuoksesta saatiin jäähdyttämällä ja raaputtamalla vaaleankeltaisia kiteitä, sp. 69-71°C (3,4 g, 47 %); TLC Rf - 0,61 (tolueeni-dioksaani 95:5). Analyyttinen näyte saatiin kiteyttämällä uudelleen 2-propanolista, mutta sulamispiste 30 ei muuttunut.
-1 1 IR (KC1) cm 1755 (C=0, esteri) ja 1730 (C=0, amidi); H- NMR (CDC13) <f>7,4 (m, 5H) , 6,2 (d, J = 2, 1H) , 2,4 (s, 3H) ja 2,3 (s, 3H) .
Analyysi C14H12C^N03 35 Laskettu: C 60,55 H 4,36 N 5,04 Saatu: C 60,65 H 4,55 N 5,07
II
27 81566 3-hydroksl-5-(p-kloorlfenyyli)pyrroli (17) 2,8 g:n (0,01 mol) näytteestä N-asetyyli-3-asetok-syyli-5-p-kloorifenyylipyrrolia (16) poistettiin happi kymmenen minuutin aikana typpivirrassa. Sitten kiintoaineet 5 liuotettiin 30 ml:aan hapettomaksi tehtyä metanolia, joka oli jäähdytetty -8°C:seen. Lisättiin kerralla kylmä, hapettomaksi tehty liuos, jossa oli 1,6 g (0,04 mol) NaOHsta 20 ml:ssa vettä. Muodostunut liuos kuumennettiin nopeasti 15°C:seen ja jäähdytettiin sitten nopeasti -5°C:seen. Kah-10 denkymmenenviiden minuutin kuluttua kirkasta liuosta käsiteltiin kylmällä, hapettomaksi tehdyllä liuoksella, jossa oli 4,2 g (0,02 mol) sitruunahappoa 15 ml:ssa vettä. Lämpötila kohosi lyhyeksi ajaksi 5°C:seen. Kun oli puoli tuntia sekoitettu -5°C:ssa, kiintoaineet eristettiin suodattamalla 15 ja pestiin kylmällä, hapettomaksi tehdyllä vedellä. Vaalean-vihreää tuotetta kuivattiin vakuumissa ja huoneen lämpötilassa P20^:n päällä useita vuorokausia (1,3 g, 68 %); TLC = 0,19 (CHCl^-EtOH 9:1); IR (KC1) ei osoittanut C=0-absorptiota. Analyysi Cl0HgClNO‘1/6H2O 20 Laskettu: C 61,08 H 4,27 N 7,12 Saatu: C 61,36 H 4,44 N 6,85 3-(N-tosyyli-L-alanlnyylioksi)-5-(p-kloorifenyyli)-pyrroli (18) 15 ml:aan typpivirralla hapettomaksi tehtyä THF:ää 25 lisättiin 0,65 ml (0,008 mol) pyridiiniä, 1,27 ml (0,0164 mol) trifluorietikkahappoa ja 1,3 g (0,0065 mol) 3-hydroksi- 5-(p-kloorifenyyli) pyrrolia (17). Liuos jäähdytettiin 0--4°C:seen ja lisättiin 10 minuutin aikana typpivirralla hapettomaksi tehty, jäähdytetty (0 - -4°C) liuos, jossa oli 30 2,1 g (0,008 mol) N-tosyyli-L-alaninyylikloridia 15 ml:ssa THF:ää. Kun seosta oli pidetty tunti 0°C:ssa, lisättiin seos, jossa oli jäitä ja 100 ml 1 N sitruunahappoliuosta.
Tämä seos uutettiin etyyliasetaatilla ja uute pestiin kerran kylmällä keittosuolaliuoksella, kahdesti kylmällä, laimealla 35 NaHCO^-liuoksella ja kerran kylmällä keittosuolaliuoksella ja 28 81 566 sitten kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä ja suodatettiin. Suodosta käsiteltiin 2 g:llaDarco:a ja sekoitettiin 10 minuuttia, suodatettiin ja suodos konsentroitiin vakuu-missa punertavan ruskeaksi öljyksi, öljy liuotettiin tolu-5 eeni-sykloheksaaniin (4:1) ja pidettiin jääkaapissa yli yön. Saatiin vaalean lohenvärisiä kiteitä (1/45 g, 53 %); sp. 113-115°C; TLC Rf = 0,47 (Et20); IR (KC1) cm"1 1740 (C=0, esteri); 1H-NMR (CDCl^ <$ 8,4 (leveä s, 1H) , 7,8-7,2 (m, 8H), 6,7 (m, 1H), 6,2 (m, 1H) 5,5 (d, J = 9, 1H), 4,2 10 (p, J = 8, 1H), 2,4 (s, 3H), 1,4 (d, 3H); MS (EI, DIP) m/e 418 (M+, 2,3 %) ja 420 (M+, 0,8 %).
Analyysi C2()H1 gClN2C>4S Laskettu: C 57,34 H 4,57 N 6,69 Saatu: C 57,53 H 4,58 N 6,67 15 Yhdistettä sisältävien testivälineiden valmistus ja käyttö
Suoritettiin sarja kokeita käsiteltävänä olevaa keksintöä sisältävien testivälineiden valmistamiseksi. Kokeissa testattiin edellä mainittujen esterisubstraattien 20 kykyä reagoida virtsan leukosyytteihin. Väline muodostui pienestä neliönmuotoisesta, määritysreagensseja sisältävästä suodatinpaperista, joka oli kiinnitetty polystyreenikalvo-liuskan toiseen päähän. Suodatinpaperi oli kyllästetty puskurilla, esterillä, joudutinaineella ja diatsoniumsuola-25 kytkemisaineella. Havaittiin, että jokainen testattu väline reagoi positiivisesti virtsan leukosyytteihin.
1. Testiväline, jossa esteri on 3-(N-tosyyli-L-alaninyy-lioksi)-5-fenyylipyrroli (4)
Valmistettiin virtsan leukosyytteihin reagoiva tes-30 tiväline. Väline muodostui pienestä neliönmuotoisesta suodatinpaperista, joka oli kiinnitetty pitkänomaisen polystyree-nikalvoliuskan toiseen päähän. Paperi oli kyllästetty erilaisilla aineosilla, mm. väriä synnyttävällä esterillä, joudutinaineella ja diatsoniumsuolalla. Eaton and Dickman nro 205 35 suodatinpaperi, leveys 50,8 mm, kastettiin vesiliuokseen, joka sisälsi:
II
29 81 566 0,4 M boraatti-NaOH-puskuria pH 8,6 2.0 %, (paino/tilavuus) polyvinyylipyrrolidoni K-30:tä 0,2 % (paino/tilavuus) Bioterge AS-40:tä 0,25 M NaCl 5 Sitten paperi kuivattiin 7 minuuttia Overly Air
Foil paperinkuivauskaapissa 79-93°C:ssa ilmavirtauksen paineessa 25,4 mm vesipatsasta. Tämän jälkeen kuivattu paperi kastettiin asetoniliuokseen, joka sisälsi 2.0 tilavuus-% n-dekanolia 10 0,75 mM 2-metoksi-4-morfolinobentseenidiatsoniumkloridia 0,5 mM 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-fenyylipyrrolia Tämän kyllästyksen jälkeen paperi kuivattiin 10 minuuttia ventiloidussa Hotpacl^ lämpökaapissa 54°C:ssa. Saatiin likaisenvalkoinen testipaperi.
15 Kuivatusta, kyllästetystä paperista leikattiin neliön muotoinen pala, jonka sivu oli 5,1 mm, ja pala kiinnitettiin pituussuunnassa polystyreeniliuskaan, 101,6 x 5,1 mm. Paperi kiinnitettiin liuskaan Double SticJ^ kaksipuolisella teipillä (3M Company).
20 2. Testiväline, jossa esteri on 3-(N-tosyyli-L-alaninyy lioksi) -1-metyyli-5-fenyylipyrroli (13)
Testivälineet valmistettiin kokeen 1 menettelyn mukaan ja niiden esteri-indikaattorina oli 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi) -1-metyyli-5-fenyylipyrroli ja kytkemisainee-25 na 1-diatsonaftaleeni-4-sulfonaatti. Ensimmäinen kastovesi-liuos sisälsi 0,4 M boorihappoa 2.0 % (paino/tilavuus) polyvinyylipyrrolidonia (K-30) 0,2 tilavuus-% Bioterg AS-40:tä 30 0,25 M NaCl
Ennen suodatinpaperin kyllästämistä liuos titrat-tiin NaOH:lla pH-arvoon 9,0.
Toinen kastoasetoniliuos sisälsi 0,75 mM 1-diatso-2-naftoli-4-sulfonaattia 35 1,3 mM 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-1-metyyli-5-fenyyli- pyrrolia 1,5 tilavuus-% dodekanolia 30 81 566
Ensimmäisessä kastovesiliuoksessa kyllästämisen jälkeen paperi kuivattiin n. 5 minuuttia n. 80°C:ssa ja toisessa kas-toasetoniliuoksessa kyllästämisen jälkeen n. 5 minuuttia 70°C:ssa. Kuivattu paperi kiinnitettiin kuten kokeessa 1.
5 3. Testiväline, jossa esteri on 3-(N-tosyyli-L-alaninyyli- oksi)-5-(p-kloorifenyyliryypoli (18)
Testivälineet valmistettiin kuten kokeessa 1 sillä erolla, että asetoniliuos sisälsi fenyylipyyrolin asemasta 1,3 mM 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-(p-kloorifenyyli)pyrrolia. 10 Testivälineen arvostelu
Arvosteltiin edellä kuvatuissa kokeissa valmistettujen testivälineiden kyky havaita leukosyyttien läsnäolo virtsassa.
Testinäytteet preparoitiin ihmisen yhteensekoitetusta normaalivirtsasta. Yksi näyte toimi vertailuna ja kahteen muu-15 hun virtsanäytteeseen lisättiin vastaotetusta verestä eristettyjä leukosyyttejä siten, että konsentraatiot olivat vastaavasti 0, 10 ja 75 leukosyyttiä/pl.
Testivälineet kastettiin nopeasti testinäytteeseen ja poistettiin siitä nopeasti. Kahden minuutin kuluttua välineet 20 tarkasteltiin spektrometrillä, joka mittasi prosentuaalisen reflektanssin aallonpituusalueella 400 - 700 nm (nanometriä).
Tulokset osoittavat, että testivälineet indikoivat selviä valon reflektanssieroja, jotka olivat verrannollisia tes-tinäytteiden erilaisiin leukosyyttipitoisuuksiin. Tulokset il-25 menevät seuraavasta taulukosta.
Koe n:o Leukosyyttikonsentraatio Prosentuaalinen reflek-(solua/pl) tanssi 555 nm — 11 0 30 _10 - 12_-_ 2 0 67 10 64 _75_60__ 3 0 61 35 10 51 _75_42__ *) Visuaalinen havainto: purppuraväri muodostui määrällä 10 - 12 solua/pl; vertailu ei antanut värireaktiota
Claims (10)
1. Yhdiste, tunnettu siitä, että sillä on kaava I
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että se on 3-(N-tosyyli-L-alaninyyliok- 20 si)-5-fenyylipyrroli.
3* Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että se on 3-(N-tosyyli-L-alaninyyliok-si)-l-metyyli-5-fenyylipyrroli.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, t u n - 25. e t t u siitä, että se on 3-asetoksi-l-metyyli-5-fe- nyylipyrroli.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että se on 3-(N-tosyyli-L-alaninyyliok-si)-5-(p-kloorifenyyli)pyrroli.
5 R* 0-A XI R' jossa 10. on COCH3 tai - COCH-CH3, K H TS jossa Ts on tosyyli, R on alempi alkyyli, jossa on 1 - 6 hiiliatomia, fenyyli 15 tai kloorifenyyli, R* on H tai alempi alkyyli, jossa on 1 - 6 hiiliatomia, ja R' on H tai alempi alkyyli, jossa on 1 - 6 hiiliatomia.
6. Menetelmä esterin valmistamiseksi, jolla on kaava II **->,—r°-B X7
35 R' 32 81 566 jossa B on -COCH, tai -COCH-CH,, N / \ H Ts 5 jossa Ts on tosyyli, R on alempi alkyyli, jossa on 1 - 6 hiiliatomia, fenyyli tai kloorifenyyli, R' on H tai alempi alkyyli, jossa on 1 - 6 hiiliatomia ja R* on H tai alempi alkyyli, jossa on 1 - 6 hiiliatomia, 10 tunnettu siitä, että 1. annetaan vesiseoksen, jossa on ketonia, alkali-metallimonopersulfaattia ja yhdistettä, jolla on kaava R*^^. COOH 15 j] R ^ jossa R ja R* ovat edellä määritellyt, reagoida sellaisen alkalimetallibikarbonaattimäärän läsnäollessa, että seoksen pH säilyy arvossa vähintään 7, jolloin muodostuu en-20 simmäinen reaktioseos, 2. lisätään ensimmäiseen seokseen yhdistettä H00C-CH2NHR' toisen reaktioseoksen muodostamiseksi, 3. poistetaan vesi toisesta seoksesta, jolloin saadaan olennaisesti kuiva toinen seos, 25 4) lisätään etikkahappoanhydridiä kuivaan toiseen seokseen orgaanisen emäksen läsnäollessa, jolloin saadaan kolmas reaktioseos, ja haluttaessa eristetään tästä seoksesta kaavan II mukainen esteri, jossa B on -COCH3, ja 5. kaavan II mukaisen esterin valmistamiseksi, jos- 30 sa B on -COCH-CH, I 3 N / \ H Ts hydrolysoidaan kohdassa 4) muodostunut seos tai siitä eristetty kaavan II mukainen esteri, jolloin saadaan reak-35 tioseos, joka sisältää 3-hydroksipyrrolia, jolla on kaava III il 33 81 5 6 6 R* OH XT R' 5 jossa R, R' ja R* ovat edellä määritellyt, 6. eristetään 3-hydroksipyrroli; lisätään happoha-logenidi, jolla on kaava Hal-COCH-CH3 /\ H Ts 10 jossa Hal on halogeeni ja Ts on tosyyli, 3-hydroksipyr- roliin orgaanisen hapon läsnäollessa, jolloin saadaan tuo- teseos, joka sisältää kaavan II mukaista esteriä, jossa B on -COCH-CH3, I 3 /N\
15. Ts jossa Ts on tosyyli, ja saadaan tuoteseos, ja eristetään kaavan II mukainen esteri tuoteseoksesta.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan 3-(N-tosyyli-L- 20 alaninyylioksi)5-fenyylipyrroli.
8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan 3-(N-tosyyli-L-alaninyyIloksi)-l-metyyli-5-fenyylipyrroli.
9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että valmistetaan 3-asetoksi-l- metyyli-5-fenyylipyrroli.
10. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-(p-kloorifenyyli)pyrroli. 34 81 566
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/597,336 US4645842A (en) | 1984-04-06 | 1984-04-06 | Pyrrole compounds for detecting the presence of hydrolytic analytes |
| US59733684 | 1984-04-06 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI851356A0 FI851356A0 (fi) | 1985-04-03 |
| FI851356L FI851356L (fi) | 1985-10-07 |
| FI81566B FI81566B (fi) | 1990-07-31 |
| FI81566C true FI81566C (fi) | 1990-11-12 |
Family
ID=24391091
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI851356A FI81566C (fi) | 1984-04-06 | 1985-04-03 | Nya pyrrolylderivat foer bestaemning av hydrolytiska analyter i ett prov och foerfarande foer deras framstaellning. |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4645842A (fi) |
| EP (1) | EP0157327B1 (fi) |
| JP (1) | JPS60260558A (fi) |
| AT (1) | ATE64382T1 (fi) |
| AU (1) | AU558425B2 (fi) |
| CA (1) | CA1267500A (fi) |
| DE (1) | DE3583169D1 (fi) |
| ES (1) | ES8607233A1 (fi) |
| FI (1) | FI81566C (fi) |
| IE (1) | IE57919B1 (fi) |
| IL (1) | IL74645A (fi) |
| NO (1) | NO168172C (fi) |
| ZA (1) | ZA852122B (fi) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4774340A (en) * | 1984-04-06 | 1988-09-27 | Miles Inc. | Method for preparing 3-hydroxy pyrroles and esters thereof |
| US4704460A (en) * | 1984-04-06 | 1987-11-03 | Miles Laboratories, Inc. | Novel compounds for detecting the presence of hydrolytic analytes in a test sample |
| US5543531A (en) * | 1987-06-16 | 1996-08-06 | Sandoz Ltd. | Thiophen compounds and their preparation |
| EP0318066B1 (en) * | 1987-09-22 | 1992-07-29 | Merck & Co. Inc. | Aryl-substituted thiophene 3-ols, derivatives and analogs, as lipoxygenase inhibitors |
| US4999436A (en) * | 1987-09-22 | 1991-03-12 | Merck & Co., Inc. | Aryl-substituted thiophene 3-ols, derivatives and analogs useful as lipoxgenase inhibitors |
| US5459272A (en) * | 1990-10-16 | 1995-10-17 | Research Corporation Technologies | Quinoline-2-(carboxaldehyde) reagents for detection of primary amines |
| US5776780A (en) * | 1993-05-28 | 1998-07-07 | Chimera Research & Chemical, Inc. | Method for quantitatively measuring white blood cells esterase activity in urine |
| US5464739A (en) * | 1994-08-22 | 1995-11-07 | Bayer Corporation | Composition method for determining the presence of leukocyte cells, esterase or protease in a test sample |
| US6551791B1 (en) * | 1995-12-21 | 2003-04-22 | University Of Florida | Rapid diagnostic method for distinguishing allergies and infections and nasal secretion collection unit |
| US5910421A (en) * | 1995-12-21 | 1999-06-08 | University Of Florida | Rapid diagnostic method for distinguishing allergies and infections |
| WO2000055359A1 (en) * | 1999-03-16 | 2000-09-21 | University Of Florida | Rapid diagnostic method for distinguishing allergies and infections |
| WO2000028070A2 (en) | 1998-11-11 | 2000-05-18 | Wheeler Ronald E | Detection of prostatitis |
| US6528652B1 (en) * | 1999-01-21 | 2003-03-04 | Chronimed | Composition and device for detecting leukocytes in urine |
| US6348324B1 (en) | 1999-01-21 | 2002-02-19 | Hypoguard America Limited | Composition and device for detecting leukocytes in urine |
| IL140993A0 (en) | 2000-05-15 | 2002-02-10 | Bayer Ag | Trypsin substrate and diagnostic device, and method of using same |
| US6955921B2 (en) | 2001-04-30 | 2005-10-18 | Bayer Corporation | Trypsin substrate and diagnostic device, and method of using same |
| US6709868B2 (en) * | 2002-05-20 | 2004-03-23 | Portascience Inc. | Method and apparatus for measuring white blood cell count |
| US7727206B2 (en) * | 2005-12-27 | 2010-06-01 | Gorres Geoffrey H | Device for monitoring a patient for a urinary tract infection |
| ES2573954T3 (es) | 2008-12-30 | 2016-06-13 | Children's Medical Center Corporation | Método de predicción de apendicitis aguda |
| CN102807557B (zh) * | 2012-08-21 | 2015-02-04 | 苏州大学 | 3h-1,2-二硫环戊烯-3-硫酮类化合物及其应用 |
| CN107892666B (zh) * | 2017-12-12 | 2021-10-15 | 吉林医药学院 | 一种5-苯基吡咯衍生物及其制备方法和用途 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2854987A1 (de) * | 1978-12-20 | 1980-06-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Diagnostische mittel zum nachweis proteolytischer enzyme und dafuer geeignete chromogene |
| DE2905531A1 (de) * | 1979-02-14 | 1981-01-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Diagnostisches mittel zum nachweis von leukozyten in koerperfluessigkeiten |
| US4499185A (en) * | 1982-05-17 | 1985-02-12 | Miles Laboratories, Inc. | Test for esterase activity in a liquid sample |
-
1984
- 1984-04-06 US US06/597,336 patent/US4645842A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-03-19 CA CA000476901A patent/CA1267500A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-19 IL IL74645A patent/IL74645A/xx unknown
- 1985-03-21 ZA ZA852122A patent/ZA852122B/xx unknown
- 1985-03-25 DE DE8585103507T patent/DE3583169D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-25 AT AT85103507T patent/ATE64382T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-03-25 EP EP85103507A patent/EP0157327B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-26 NO NO851226A patent/NO168172C/no unknown
- 1985-04-02 AU AU40724/85A patent/AU558425B2/en not_active Ceased
- 1985-04-02 ES ES541871A patent/ES8607233A1/es not_active Expired
- 1985-04-03 FI FI851356A patent/FI81566C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-04-04 IE IE872/85A patent/IE57919B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-04-05 JP JP60071264A patent/JPS60260558A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE57919B1 (en) | 1993-05-19 |
| EP0157327B1 (en) | 1991-06-12 |
| IE850872L (en) | 1985-10-06 |
| IL74645A0 (en) | 1985-06-30 |
| FI81566B (fi) | 1990-07-31 |
| JPS6241710B2 (fi) | 1987-09-04 |
| ZA852122B (en) | 1985-11-27 |
| AU4072485A (en) | 1985-10-10 |
| FI851356A0 (fi) | 1985-04-03 |
| EP0157327A2 (en) | 1985-10-09 |
| ATE64382T1 (de) | 1991-06-15 |
| IL74645A (en) | 1988-10-31 |
| NO168172C (no) | 1992-01-22 |
| FI851356L (fi) | 1985-10-07 |
| ES8607233A1 (es) | 1986-06-16 |
| CA1267500C (en) | 1990-04-03 |
| CA1267500A (en) | 1990-04-03 |
| NO851226L (no) | 1985-10-07 |
| AU558425B2 (en) | 1987-01-29 |
| DE3583169D1 (de) | 1991-07-18 |
| JPS60260558A (ja) | 1985-12-23 |
| ES541871A0 (es) | 1986-06-16 |
| US4645842A (en) | 1987-02-24 |
| NO168172B (no) | 1991-10-14 |
| EP0157327A3 (en) | 1987-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI81566C (fi) | Nya pyrrolylderivat foer bestaemning av hydrolytiska analyter i ett prov och foerfarande foer deras framstaellning. | |
| FI85990C (fi) | Sammansaettning innehaollande zwitterjonkopplingsmedel och testanordning foer bestaemning av leukocyter. | |
| US4657855A (en) | Composition and test device for determining the presence of leukocytes, esterase and protease in a test sample | |
| US4716222A (en) | Substrates for hydrolases | |
| US4704460A (en) | Novel compounds for detecting the presence of hydrolytic analytes in a test sample | |
| FI81359C (fi) | Glykosider av resorufin-derivat, foerfarande foer framstaellning daerav samt deras anvaendning foer bestaemning av aktiviteten av glykosidaser. | |
| US5750359A (en) | Composition for detecting leucocyte and proteinase in urine and its measuring device | |
| JPS631347B2 (fi) | ||
| US4774340A (en) | Method for preparing 3-hydroxy pyrroles and esters thereof | |
| US4716236A (en) | Method for synthesizing esters | |
| EP0158226B1 (en) | Method of synthesizing esters | |
| US4861713A (en) | Novel method for determining cholinesterase activity | |
| JPS6112898B2 (fi) | ||
| JPS5850986B2 (ja) | リジン誘導体 | |
| JP2002535342A (ja) | 尿中の白血球を検定するための組成物およびディバイス | |
| JPS6029702B2 (ja) | アルギニン誘導体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: MILES INC |