FI81359C - Glykosider av resorufin-derivat, foerfarande foer framstaellning daerav samt deras anvaendning foer bestaemning av aktiviteten av glykosidaser. - Google Patents

Description

1 81359

Resorufiini -johdannaisten glykosidit, menetelmä niiden valmistamiseksi sekä niiden käyttö qlykosidaasien aktiivisuuden määrittämiseen

Glykosidaasei1la on monia fysiologisia tehtäviä ihmis- ja eläin-organismeissa. Täten esimerkiksi 3-D-ga1aktosidäasi on tärkeä hiilihydraattien aineenvaihdunnassa, koska se saa aikaan laktoosin hydrolyysin. Tämän lisäksi β-D-qalaktosidaasi toimii avainentsyyminä qlykolipidien, mukoDolysakkaridien ja qlyko-proteiinien hajoamisessa. Muina fysiologisesti merkittävinä qlykosidaaseina voidaan mainita a-D-qalaktosidaasi, α-D- ja 3-D-q lukos idaas i sekä a-D-mannosidaas i .

Fysiologisen tärkeytensä lisäksi qlykosidaasien merkitys on viime vuosien kasvanut diagnostiikassa sekä biotekniikassa.

Täten näitä entsyymejä käytetään lisääntyvässä määrin esimerkiksi entsymaattisissa immunokokeissa indikaattorientsyymeinä. Tässä yhteydessä erityisen suosittu on 3-D-galaktos idaas i /Katso esimerkiksi Annals of Clinical Biochemistry 1_6, 221-240 (1979^7- Näin ollen qlykosidaasien aktiivisuuden määrittäminen näyttelee yhä tärkeämoää osaa sekä kliinisessä kemiassa että diagnostiikassa. Yleisesti ottaen glykosidaasia sisältävään näytteeseen lisätään tällöin jotakin sopivaa substraattia. Entsyymi pilkkoo tämän substraatin. Jokin näistä pi 1 kkoonturnis-tuotteista todetaan sopivalla tavalla. Joko entsyymin vaikutuksesta vapautunut glykoni tai aglykoni voidaan mitata. Tavallisesti määritetään viimeksi mainittu.

Tavallisesti substraateiksi soveltuvat määritettävän entsyymin luonnolliset substraatit. Mieluiten käytetään kuitenkin erityisesti glykosideja, koska niissä oleva aglykoni on soektro-skooppisesti helposti todettavissa oleva jäännös.

2 81359

Joukko sellaisia glykosidaasi-substraatteja tunnetaan, joista substraateista vapautunut aglykoni, glykosidaasilla tapahtuneen pilkkoutumisen jälkeen, voidaan mitata spektroskooppisesti näkyvän valon tai UV-alueen aallonpituuksilla seka fluorometrisesti.

Täten julkaisussa Biochem. Z. 333, 209 (1960) kuvataan β-D-galaktosidaasin substraatteina fenyyli-β-D-galaktosidi sekä eräitä muita aromaattisesta renkaasta substituoituja johdannaisia (kuten o-nitrofenyyli- ja p-nitrofenyy1i-β-D-galaktosidi). Hydrolyysissä vapautuneet fenolit määritetään fotometrisesti UV-alueella tai nitrofenolien tapauksessa lyhytaaltoisilla, näkyvän valon alueen aallonpituuksilla. Tässä yhteydessä voidaan myös indikaattorireaktiona käyttää hapettavaa kytkeytymistä aminoan t ipy r i in i in /Analytical Biochem. 4_0, 281 (1971 )7 .

Hi stokemia11 isissa tutkimuksissa käytetään naftyyli-β-D-calakto-sideja, kuten esimerkiksi 1-naftyyli-yhdistettä julkaisur Histochemie 3_5, 199 ( 1973) mukaisesti. 6-bromi-2-naf tyyl i-johdannaista julkaisun J. Biol. Chem. 195, 239 (1952) mukaisesti tai naftoli-B-D-galaktosidia julkaisun /Histochemie 37, 89 (1973^7 mukaisesti. Tällöin syntyvät naftolit tehdään näkyviksi muuntamalla ne atso-väriaineiksi erilaisilla di-atsoniumsuoloilla.

Fluorogeeneja substraatteja käyttäen tapahtuva entsyymien aktiivisuuksien määrittäminen on hyvin yleistä, koska fluoro-metristen määritysten herkkyys on muutamaa kymmenpotenssia parempi fotometrisiin menetelmiin verrattuna. Monissa tapauksissa on työskenneltävä flucrogeenisilla substraateilla, esimerkiksi määritettäessä automaattisilla laitteilla solujen entsyymiaktiivisuutta erikoistuneiden solujen erottamiselcsi toisistaan (sytofluorometria) sekä analysoitaessa immobilisoi-tuja entsyymejä läpivirtausmikrofluorometrisesti. Toisissa tapauksissa, esimerkiksi määritettäessä koejärjestelmien ent-symaatti.sia merkkiaineita (entsymaattiset immunokokeet) voimistuu entsymaattisen katalyysin kerrannaisvaikutus olennaisesti fluorogeeneja substraatteja käyttämällä.

Il 3 81 359 8-D-galaktosidaasin ja muiden glykosidaasien toistaiseksi tunnetuissa fluoroqeenisissa substraateissa on fluoroforina fluoreseiinin, indoksylin tai metyyliumbel1 iferonin johdannaisia. Monimutkaisten järjestelmien kineettistä analyysia ajatellen on näillä yhdisteillä kuitenkin huomattavia haittoja. Fluoreseiinin disubstituoidut johdannaiset hydrolysoituvat monivaiheisessa reaktiosarjassa. Monosubstituoidut fluoreseiini-glykosidit fluoresoivat jo itsessään. Entsymaat-tisen piIkkoontumisensa jälkeen indoksyy1ijohdannaiset kokevat useita kemiallisia muutoksia, jotka samoin monimutkaistavat tällaista kineettistä analyysiä. Metyyliumbelliferonin johdannaisia on aktivoitava UV-säteily1lä. Tällöin biologisten tai synteettisten materiaalien oma fluoresenssi saattaa olla häiritsevää. Tämän lisäksi UV-aktivointi, erityisesti Laser-optiikkaa käytettäessä, on kallista. Useimmat tällaiset f luoro-geeniset substraatit johtavat sellaisiin reaktiotuotteisiin, jotka ovat vain vähäisessä määrin liukenevia, joten ne eivät sovellu entsyymiaktiivisuuksien kineettiseen analyysiin, missä nimen omaan vaaditaan substraatin ja tuotteen hyvää liukenevuutta.

Näin ollen olemassa oli edelleen tarve löytää sellaisia substraatteja, joilla erilaisia glykosidaaseja voidaan määrittää yksinkertaisesti, nopeasti ja luottettavasti, ja joita voidaan mahdollisesti käyttää sekä fotometrisissä että fluorometrisissä määritysmenetelmissä. Tämän keksinnön tehtävänä oli tämän tarpeen tyydyttäminen.

Tämän tehtävän ratkaisuna ovat resorufiini-johdannaisten uudet glykosidit, jotka voidaan pilkkoa glykosidaasien avulla sokeri-komponentiksi ja resorufiini-johdannaiseksi. Viimeksi mainitut ovat veteen hyvin liukenevia yhdisteitä, joiden näkyvän valon absorptio on hyvin mitattavissa, ja jotka voidaan lisäksi helposti aktivoida fluoresoituviksi.

i 4 81 359 Näin ollen tämä keksintö kohdistuu resorufiini-johdannaisten glvkosideihin, joilla on yleinen kaava Ia tai Ib 7 r1 R6

WvV5 I Ia

Giykosidi-0 R3 R4 R1 R6 ' Y /r5 l ] h ib

^ O

0 1 i O-Glykosidi R3 R4 joissa R3 tarkoittaa vetyä 2 3 5 R , R ja RJ, jotka voivat olla samoja tai erilaisia, tarkoittavat vetyä, halogeenia tai alempaa alkvyliryhmää, 4 6 * R ja R , jotka voivat olla samoja ja erilaisia, tarkoittavat vetyä, halogeenia, syanoryhmää, alempaa alkyyliryhmää, alempaa alkoksiryhmaä, karboksiryhmää, alempaa alkoksikarbonyyliryhmää, alempaa karboksia1kyy1iryhmää, alempi-alkoksikarbonyyli-alempi-alkyyliryhmää tai mahdollisesti yhteen tai kahteen kertaan substituoitua karboksiamidoryhmää tai ryhmää -COO-(CH CH O) -R7, 2 2 n missä R7 tarkoittaa vetyä tai alempaa alkyyliryhmää ja n tarkoittaa kokonaiskukua 1-4, jolloin lisäksi voi tarkoittaa sylfonyyli-tai nitroryhmää, ja Y tarkoittaa typpeä tai ryhmää N —>0.

n 5 81 359

Yleisen kaavan I mukaiset resorufiini-johdannaisten glykosidit ovat uusia yhdisteitä. Niitä voidaan valmistaa hiilihydraatti-kemiasta sinänsä tunnetuilla menetelmillä.

Yleisten tautomeeristen kaavojen Ha ja Ilb R1 R6 r2 Λ v 1 f j I Ia \ o - H0 I T b R1 R6 i3 R4 1 r5 x i X iib

0 OH

R3 R4 missä symboleilla R^-R^ ja γ on edellä esitetty merkitys, mukaiset resorufiini-johdannaiset muunnetaan edullisesti sinänsä tunnetulla tavalla mono- tai oligosakkaridilla tai jollakin näiden 1-halogenojohdannaisella, jolloin kulloinkin kaikki hydroksiryhmät on substituoitu hii1ihydraattikemiassa tavallisella suojaavalla ryhmällä, per-O-substituoiduiksi glykosideiksi, joista saadaan yleisen kaavan I mukaisia resorufiini-johdannaisten glykosideja irrottamalla suojaavat ryhmät sinänsä tunnetulla tavalla.

Kaavan II mukaisten yhdisteiden muuntaminen oer-O-substituoi-duilla 1-halogeno-sakkarideilla suoritetaan mieluiten happoja Didättävien yhdisteiden, kuten alkalihydroksidin tai -karbonaatin, länsäollessa, vettä sisältävässä asetonissa tai (faasien välisen aineensiirron olosuhteissa) vesi/bentseeni- tai vesi/kloroformi-seoksessa.

Tämän lisäksi tämä menetelmä voidaan toteuttaa siten, että yleisen kaavan TI mukaiset johdannaiset muutetaan ensin alkalihydroksidi11a tai -alkoholaatilla alkaalisuoloiksi tai 6 81359 vaihtoehtoisesti mahdollisesti substituoiduilla amiineilla ammoniumsuoloiksi, jonka jälkeen nämä muunnetaan dipolaari-sesti aproottisissa liuottimissa, kuten asetonissa, dimetyyli-sulfoksidissa, dikloorimetaanissa, tetrahydrofuraanissa "ai dimetyyliformamidissä, per-O-substituoiduilla 1-halogeno-sakkaridilla.

Edelleen per-O-substituoitujen glykosidien synteesissä kaavan II mukaisista resorufiinijohdannaisista sekä per-O-substLtuoi-duista 1-halogeno-sakkarideista lähtien yksittäisten hopea-suolojen tai hopeasuolojen seosten (hopeaoksidi, -karbonaatti, seliitin pinnalla oleva hopeakarbonaatti, hopeatriflaatti, -saiisylaatti) ja/t.ai yksittäisten elohopeasuolojen tai elo-hopeasuolojen seosten (elohcpeabromidi, -syanidi, -asetaatti, -oksidi) lisäykset ovat osoittautuneet hyödyllisiksi, sannalla mahdollisesti kuivausaineita, kuten kalsiumkloridia, molekyyli-seulana toimivaa ainetta tai drieriittiä, käyttäen ja liuot-timessa, kuten metyleenikloridissa, kloroformissa, bentsee-nissä, toluolissa tai dioksaanissa. α-^itoutuneiden glykosidien syntetoimiseksi yleisen kaavan II mukainen yhdiste sulatetaan tarkoituksenmukaisesti sellaisen sakkaridin kanssa, jonka sakkaridin hydroksiryhmät on substituoitu jollakin suo-jaavalla ryhmällä, joka erityisen mielellään on asetyyliryhmä, Lewis:in hapon, kuten esimerkiksi tinatetrakloridin, alumiini-kloridin, mieluiten sinkkikloridin läsnäollessa /vertaa julkaisut Chem. Ber. 6_6, 378-383 (1933) ja Methods in Carbohydr. Chem. 2_, 345-347 ( 19 6 7 / Tällöin lämpötila valitaan £ 0 : n ja 150°C:n väliltä, mieluiten alueelta 110 ja 130°C.

Näin saadut, yleisen kaavan II mukaisten resorufiini-johdannaisten per-O-substituoidut glykosidit ovat myös uusia yhdisteitä.

Suojaavien ryhmien irrottaminen per-O-substituoiduista cjlyko-sideista yleisen kaavan I mukaisiksi glykosideiksi suoritetaan hii1ihydraattikemiassa tavanomaisten menetelmien mukai-

II

7 81359 sesti [katso esimerkiksi Advances Carbohydrate Chem. 12, 157 (1975)], esimerkiksi suojaavien ryhmien ollessa asyyliryhmiä irrottaminen suoritetaan natriummetylaatilla tai bariummety-laatilla tai ammoniakilla metanolissa.

Keksintö kohdistuu lisäksi yleisten tautomeeristen kaavojen Ila ja Hb mukaisten resorufiini-johdannaisten käyttöön yleisten kaavojen Ia ja Ib mukaisten resorufiiniglykosidien valmistamiseksi .

Symbolien rI-R? määritelmässä tarkoitetaan halogeenilla fluoria, klooria, bromia tai jodia, mieluiten klooria tai bromia.

Symbolien R-^-R^ määritelmässä esiintyvässä "alemmassa alkyy-liryhmässä" on 1-5, mieluiten 1-3 hiiliatomia, ja tällöin metyyliryhmä on erityisen suositeltava.

Symbolien R^ ja R^ määritelmässä esiintyvässä "alemmassa alkoksiryhmässä" on 1-5, mieluiten 1-3 hiiliatomia, ja tällöin metoksiryhmä on erityisen suositeltava.

Substituenttien ja määritelmissä esiintyvien alemman alkoksikarbonyyli- ja alemman karboksialkyylijäännöksen sekä alemman alkoksikarbonyylin ja alemman alkyylin välisen jäännöksen "alemmassa alkoksijäännöksessä" ja "alemmassa alkyyli-jäännöksessä" on myös 1-5, mieluiten 1-3 hiiliatomia, ja tällöin erityisen suositeltavia ovat metoksiryhmä ja metyleeni-j äännös.

"Hiilihydraattikemiassa tavanomaiseksi suojaavaksi ryhmäksi" soveltuu erityisesti asetyyli-, bentsoyyli-, bentsyyli- tai trimetyylisilyylijäännös.

Karboksiamidoryhmän substituentteina tulevat kysymykseen al-kyyli-, alkoksialkyyli-, karboksialkyyli- ja aikoksikarbonyy-lialkyylijäännökset, jolloin näissä alkyylijäännöksissä on kulloinkin 1-5, mieluiten 1-3 hiiliatomia. Kahdesti substitu-oidun karboksiamidiryhmän tapauksessa nämä molemmat substi-tuentit voivat olla sulkeutuneina renkaaksi, jossa heteroato-mina saattaa olla esimerkiksi happi-, typpi- ja rikkiatomi.

8 81 359

Sellaiseksi glykosidijäännökseksi, joka on sitoutunut yleisen kaavan II mukaisten resorufiini-johdannaisten kanssa yleisen kaavan I mukaiset glykosidit muodostaen, soveltuvat kaikki ne mono- ja oligosakkaridit, jotka voidaan irrottaa uudestaan tästä resorufiinirungosta vastaavilla glykosidaasei11a. Esimerkkeinä keksinnön mukaisista glykosideista mainittakoon: β-D-galaktopyranosidi, a-D-galaktopyranosidi, S-D-glukopyrano-sidi , α-D-glukooyranosidi , seka ct-D-mannopyranosidi .

Glykosidijäännökseksi soveltuvat myös sellaiset oligosakkaridi-ketjut, jotka voidaan hajottaa sakkaridiketjuja oilkkovilla entsyymeillä aina mono- tai oligosakkarideiksi saakka, jotka mono- tai oligosakkaridit voidaan puolestaan irrottaa suoraan resorufiinirungosta vastaavien glykosidien kanssa. Tällaisilla oiigosakkaridiketjui1la tarkoitetaan erityisesti sellaisia ketjuja, jotka ovat muodostuneet 2-10, mieluiten 2-7 monosak-karidiyksiköstä.

Lisäksi tämä keksintö kohdistuu yleisten tautomeeristen kaavojen II'a ja II 1 b

Rl ' R6 ' j II'a O'' VN.

R3' R4' R1' R6' O2' I I R5’ [3· 4 1

R R

II

9 81359 mukaisiin uusiin yhdisteisiin, joissa kaavoissa II'a ja II'b symboleilla R1'-R®' on sama merkitys kuin substituen-teilla R^-R^, jolloin symbolit R^· -R^' eivät kuitenkaan voi kaikki tarkoittaa samanaikaisesti vetyä, ja symbolilla Y on edellä esitetty merkitys, jolloin kuitenkin vähintään yksi ryhmistä R^' ja R®' tarkoittaa alempaa alkok-sikarbonyyli-, mahdollisesti yhteen tai kahteen kertaan substituoitua karboksiamidoryhmää tai ryhmää -COO-(CH2CH2O)n-R^, kun Y tarkoittaa typpeä.

Nämä yhdisteet ovat uusia. Ne soveltuvat erityisesti välituotteiksi valmistettaessa keksinnön ja yleisen kaavan I mukaisia resorufiini-johdannaisten glykosideja.

Yleisen kaavan II' mukaiset yhdisteet voidaan valmistaa analogisesti niillä menetelmillä, jotka soveltuvat tunnettujen resorufiinien (yleisen kaavan II mukainen yhdiste, jossa kaavassa symbolit R^-R^ tarkoittavat kulloinkin yhtä vety-atomia) valmistamiseen.

Yleisen kaavan II’ mukaiset yhdisteet valmistetaan edullisesti siten, että yleisen kaavan III

Rl'

R2 / NO

|l I III

HO ^ ^ ^ OH

13.

RJ

mukaiset nitrosoresorsiini-johdannaiset muunnetaan yleisen kaavan IV

ίο 81359 R6' I Iv

ΗΟ/γ^ ^ OH

I4, jossa 1 · 6 ' symboleilla R -R on edellä esitetty merkitys, mukaisilla resorsiini-johdannaisi1la pyrolusiitin ja rikkihapon läsnäollessa alhaisissa lämpötiloissa. Tällöin muodostuvat ensin yleisen kaavan II1, jossa Y tarkoittaa N -> O-ryhmää, mukaiset yhdisteet. Nämä aineet voidaan muuntaa helposti yleisen kaavan II’, jossa Y tarkoittaa typpeä, mukaisiksi yhdisteiksi sinkki jauheella ammoniakin läsnäollessa.

Yleisen kaavan lii mukaisten yhdisteiden ja yleisen kaavan IV mukaisten yhdisteiden välinen reaktio suoritetaan tavallisesti lämpötilassa, joka on alueella -10-50°C, mieluiten alueella 0-30°C. Tämä muuntaminen etenee erityisen varovaisesti, mikäli yleisten kaavojen III ja IV mukaiset aineet sekoitetaan keskenään suurin piirtein 0°C:n lämpötilassa, jonka jälkeen tämän reaktioseoksen annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan. Pyrolusiitin oitoisuuden tulisi tarkoituksenmukaisesti olla 0,5-5, mieluiten 1-2 mol/1. Rikkihapon pitoisuuden tulisi olla 0,5-5, mieluiten 1- 3 m oI/1.

Yleisen kaavan II1, missä Y tarkoittaa N-> 0-ryhmää, mukaisten yhdisteiden pelkistäminen yleisen kaavan II1, missä Y tarkoittaa typpeä, mukaisiksi yhdisteiksi suoritetaan mieluiten ammoniakkia sisältävässä liuoksessa sinkkipölyl.lä /katso julkaisu Nietzki et ai., Ber. Dtsch. Chem. Ges. 2_2, 3020 (1889.)7. Liuottimena käytetään tarkoituksenmukaisesti vesi-alkoholiseoksia, mieluiten seosta, joka muodostuu 1 osasta vettä ja 0-4 osasta metanolia. Pelkistettävän aineen moolia kohden lisätään vähitellen 1-20, mieluiten 1-5 moolia sinkkipölyä. Reaktioliuoksen

II

11 81359 lämpötila pidetään tällöin alueella -10-35°C, mieluiten alueella + 5—hlO°C. Tällä lämpötila-alueella pysytteleminen on osoittautunut välttämättömäksi, jotta reaktio etenisi yksiselitteisesti. Ilman jäähdyttämistä tämä eksoterminen reaktio johtaa sivutuotteisiin, jotka on vain vaikeasti erotettavissa.

Yleisen kaavan III ja yleisen kaavan IV mukaisten aineiden välinen muunnos reaktio etenee näissä valituissa miedoissa olosuhteissa yksiselitteisesti ja hyvällä saannolla. Tätä valittua synteesi reittiä voidaan muuntaa. Näin ollen lukuisat synteesi-tavat ovat mahdollisia, ajatellen erityisesti epäsymmetrisesti substituoitujen resorufiini- tai myös resatsuriini-johdannaisten valmistamista.

Kaavan II', missä R4' ja/tai R6' tarkoittavat alempaa alkoksi-karbonyy1iryhmää, mahdollisesti yhteen tai kahteen kertaan 7 subs ti tuoi tua karboksiamidoryhmää tai ryhmää -COO- ( ) -R ,

mukaiset resorufiini-johdannaiset valmistetaan mieluiten yleisen kaavan V

R7" R1 V=o R6" R2 J ' 5

R . /kv/W/R

o |]| ° v O (yj\ 7„

R U 4” R

R R

missä 12 3 5 symboleilla R , R , R ja R on edellä esitetty merkitys, 4 " 6 " R ja R tarkoittavat karboksiryhmaä ja 7" R tarkoittaa vetyä tai alempaa alkyyliryhmää, mukaisten triasyloitujen dihydroresorufiinien toimiessa välituotteina .

12 81 359

Karboksyylihapon toiminnallinen ryhmä muunnetaan kirjallisuudesta tunnettuja menetelmiä käyttäen, esimerkiksi oksalyyli-kloridi/DFM:llä tai tionyy1ikloridi/DFM:1lä, happokloridiksi, joista saadaan vastaavasti substituoidut karboksyylihapon ester i johdannaiset tai karboksiamidijohdannaiset annettaessa näiden happokloridien reagoida mielivaltaisten alkoholien ja amiinien kanssa.

Käsittelemällä näin saatuja asetyloituja, yleisen kaavan ITI mukaisia johdannaisia lipeällä, mieluiten 0,1-5 M natrium- tai kalilipeällä, tai 1-15 M vesipitoisella ammoniakilla ja hapettavalla aineella, mieluiten kaliumheksasyanoferraatti-III:11a, samalla vesiliukoisia orgaanisia liuottimia, kuten 1,4-dioksaa-nia tai metanolia, lisäten, saadaan yleisen kaavan II mukaisia vastaavia resorufiini-johdannaisia.

Alkoholikomponenteiksi soveltuvat periaatteessa kaikki mahdolliset alkoholit. Erityisen suositeltavia ovat dietyleen Lg.lykoli-monoetyylieetteri, trietyleeniglykoli-monoetyyli-eetteri tai yksinkertaiset alkoholit, kuten metanoli tai etanoli. Amiini-komponentti voidaan samoin valita kaikkien mahdollisten amiinien joukosta. Erityisen suositeltavia ovat sellaiset amiinit, joissa on polaarinen ryhmä, kuten esimerkiksi morfoliini, metoksietyy1i-amiini tai glysinamidi tai ammoniakki, primäärinen tai sekundäärinen alempi alkyyliamiini. Lisäksi voidaan käyttää sellaisia aminokarboksyylihappoja, joiden karboksyyliryhmä on suojattu tavallisella tavalla, kuten esimerkiksi glysiini-tert.butyyli-esteriä, glysiinibentsyyli-esteriä tai Na-BOC-1ysiinimetyyli-esteriä. Suojaavien ryhmien irrottamisen jälkeen saadaan täten resorufiini-II tai resorufiini-glykosidi-I: tä, jossa on alifaat-tisen karboksyylihapon toiminnallinen ryhmä.

Yleisen kaavan V mukaiset asetyloidut dihydroresorufiinit saadaan vastaavasta resorufiinista tai resatsuriinistä muuntamalla nämä voimakkaalla pelkistimellä, kuten esimerkiksi tina(II)klo-ridilla tai kromi (II)asetaatilla tai pelkistämällä ne sahkö-

II

13 81 359 kemiallisesti, jonka jälkeen suoritetaan asetylointi. Pelkistämistä varten resorufiinia tai resatsuriinia lämmitetään 10 minuutista 1 tuntiin saakka yhdessä tina (II) kloridin 2-10, mieluiten 2-6 ekvivalentin kanssa suolahapon 5-38%:sessa vesi-liuoksessa, Dihydroyhdiste saostuu jäähdytettäessä. Asetylointi suoritetaan tavallisella tavalla asetanhydridi11ä. Yleisen kaavan V mukaiset yhdisteet valmistetaan mieluiten pelkistävällä asetyloinnilla sekoitusmenetelmää käyttäen. Vastaavaa resorufiinia tai resatsuriinia kuumennetaan palautus jäähdyttäen asetanhydridissä yhdessä tina( 11)kloridin 2-6 ekvivalentin kanssa 5 minuutista 5 tuntiin, mieluiten 10 minuutista 3 tuntiin tai niitä sekoitetaan 4-16 tuntia.

Yleisen kaavan II mukaisten resorufiini-johdannaisten glykosi-dien synteesissä syntyy fluoresoimattomia yhdisteitä, joista voidaan edelleen vapauttaa fluoresoivat resorufiini-johdannaiset vastaavilla glvkosidaaseilla tapahtuvilla entsymaattisilla pilkkomisilla. Muiden kromogeenisten tai fluorogeenisten ryhmien tähän saakka tunnettuihin glykosideihin verrattuna keksinnön mukaisilla fluorogeenisi1la resorufiini-johdannaisi11a on erittäin edullisia ominaisuuksia. Monosubstituoituina johdannaisina niiden entsymaattisen hydrolvysin kinetiikka on erittäin yksinkertaisesti selitettävissä Michaelis-Menten-yhtälöllä. Resorufiini-f-D-ga1aktopyranosidin Michaelis-vakion K^-arvo on esimerkiksi 0,38 mmol/1. Luonnollinen substraatti saa aikaan tämän hydrolvysin kilpailevan inhibition, jolloin tiettyjä tutkimuksia varten resorufiini-johdannaisten glykosidien spesifinen muuntuminen voidaan määritellä ja sitä voidaan muuttaa luonnollisia glykosideja, kuten β-D-galaktosidaasin tapauksessa laktoosia lisäämällä.

Resorufiini-johdannaisten keksinnön mukaisia glykosideja voidaan säilyttää vesiliuoksessa käytännöllisesti katsoen miten kauan tahansa +4°C:ssa. Resorufiinirungon glykosidien liukoisuus on jo riittävää useimpiin kineettisiin tarkoituksiin. Vastaavien glykosidien liukoisuus paranee olennaisesti, kun niihin lisätään karboksyy1ihappojen estereitä ja sellaisia 14 81 359 karboksyylihappojen johdannaisia, joissa on polaarisia ryhmiä tai sulfonihapporyhmiä.

Keksinnön mukaiset tuotteet aktivoiva säteily ja näiden tuotteiden lähettämä säteily on spektrin näkyvän valon alueella, kun kvanttisaanto on riittävä. Resorufiinin fluoresenssin maksimi-intensiteetti saavutetaan yli 7,0 olevissa pH-arvoissa ja se vaimenee vain hitaasti liian alhaisissa pH-arvoissa.

Tämän resorufiinin qlykosidit ovat vesiliuoksessa väriltään tavallisimmin keltaisia (λ noin 470 nm:ssa). Entsymaattisen reaktion jälkeen nämä tuotteet ovat pääasiassa punaisia 7 χ noin 570 nm:ssa), joten nämä aineet sopivat myös erinomaisesti fotometrisiin määrityksiin ja ilman mittalaitteita suoritettaviin visuaalisiin menetelmiin.

Tämä keksintö kohdistuu edelleen näiden uusien, yleisen kaavan I mukaisten resorufiini-johdannaisten glykosidien käyttöön määritettäessä vastaavien glykosidaasien, esimerkiksi a-D-ja 2-D-galaktosidaasin, α-D- ja β-D-glukosidaasin sekä a-D-man-nosidaasin aktiivisuutta.

Yleisen kaavan I mukaiset reorufiini-johdannaiset, joissa glvkosidijäännöksenä on oligosakkaridiketju, soveltuvat myös erityisesti sakkaridiketjuja pilkkovien entsyymien, kuten esimerkiksi a-amylaasin osoittamiseen. Tällöin tämä oligosakkaridi-ketju pilkkoutuu tyypillisellä tavalla osoitettavan entsyymin vaikutuksesta, mieluiten monosakkaridiksi saakka, jolloin tarvittaessa muita entsyymejä voidaan käyttää apuna. Tämän jälkeen tämä tuote pilkotaan vastaavaa glykosidaasia käyttäen edellä esitetyllä tavalla resorufiinirungoksi ja monosakkaridiksi.

Tämän keksinnön piiriin kuuluvat lisäksi uusia yleisen kaavan I mukaisia resorufiini-johdannaisten glykosideja sisältävät, glykosidaasien aktiivisuuden määrittämiseen sopivat diapfnos-tiset aineet. Näiden yleisen kaavan I mukaisten resorufiini-johdannaisten glykosidien käyttö glykosidaasien substraatteina johtaa selvästi herkempiin koejärjestelmiiin aikaisempaan ver- is 81359 rattuna. Näitä uusia substraatteja voidaan käyttää edullisesti glykosidaasien aktiivisuuden määrittämiseen sekä biokemian ja biotekniikan että kliiniskemiallisella alalla. Ne ovat herkempiä, mikä johtaa useampiin etuihin: a) Vähäisempiä entsyymiaktiivisuuksia voidaan mitata.

b) Pienempiä näytemääriä voidaan käyttää.

c) Aktiivisuuden määrittäminen voidaan suorittaa huomattavasti lyhyemmässä ajassa.

d) Pienempien näytemäärien käyttö ja edullinen mittaamiseen käytetty aallonpituus vähentävät lisäksi tässä menetelmässä muiden näytteessä olevien aineosien aiheuttamia häiriöitä.

e) Kantaja-ainematriisissa immobi1isoidui1la entsyymeillä aikaansaatu muuntuminen voidaan mitata.

Tämän keksinnön kohteena olevat substraatit ovat osoittautuneet sopiviksi alkuperältään kaikenlaisten glukosidaasien aktiivisuuden määrittämiseen. Keksinnön mukaiset diagnostiset aineet, joiden substraatit ovat yleisen kaavan I mukaisia, reagoivat selvästi herkemmin kuin tähän saakka tunnetut koeaineet.

Kaavan I mukaiset resorufiini-johdannaisten olykosidit soveltuvat myös sellaisiin immunologisiin määritysmenetelmiin, joissa indikaattori entsyymeinä käytetään glykosidaaseja, joiden aktiivisuus täytyy ilmoittaa immunologisen reaktion suorittamisen jälkeen.

Alan asiantuntija tuntee tällaiset entsymaattista indikaattori-reaktiota käyttävät määritysmenetelmät entsymaattisina immunoko-keina. Näitä menetelmiä voidaan käyttää proteiinien, polysakkaridien, hormonien, lääkeaineiden ja muiden molekyy1ipaino1taan alhaisten aineiden pitoisuuden määrittämiseen pitoisuusalueella -5 -12 10 - 10 mol/1. Aina sen mukaan, ovatko faasien erottamisvai- heet välttämättömiä vai ei, puhutaan kokeen homogeenisesta ja heterogeenisesta suorittamisesta. Muunlainen alajaottelu voidaan edelleen tehdä kilpailevan sekä ei-kilpailevän koeperiaatteen perusteella .

Kaikki koeperiaatteet toimivat kuitenkin entsyymi-antigeeni- tai entsyymi-vasta-aine-konjugaatei1la. Entsymaattinen indikaattori- 16 81 359 reaktio on sama kaikissa entsymaattisissa immunokokeissa. Tähän tarkoitukseen sopivia indikaattorientsyymejä ovat esimerkiksi qlykosidaasit , erityisesti β-D-galaktosidaasi. Näiden glukosi-daasien määrittäminen tällaisissa entsymaattisissa immunokokeissa tapahtuu tavallisesti siten, että näytteeseen lisätään sopivaa substraattia, joka pilkkoutuu entsymaattisesti ja joka tavallisesti mitataan fotometrisesti tai myös fluorometrisesti.

Glykosidaasi-koejärjestelmien paraneminen johtaa näin ollen myös tällaisissa entsymaattisissa immunokokeissa huomattaviin etuihin: 1. Parempi herkkyys mahdollistaa myös nyt ilmaisurajan edelleen alentamisen, lyhyemmät reaktioajat sekä pienempien näytteiden käyttämisen, ja täten myös näytteen muiden aineosien aiheuttamien häiriöiden vähenemisen.

2. Mittaukseen käytettävä edullisempi aallonpituus vähentää menetelmässä reaktion tiettyä suoritustapaa käytettäessä liukenemattomien aineosien, esimerkiksi samentumien aiheuttamia häiriöitä.

Tällainen diagnostinen aine sisältää yhden tai useamman, yleisen kaavan I ja keksinnön mukaisen substraatin ohella sopivan puskuri-järjestelmän sekä mahdollisesti myös muita sooivia, tavallisesti tällaisissa diagnostisissa aineissa käytettyjä lisäaineita, kuten esimerkiksi kostutusainetta, stabilisaattoreita jne. Tämä diagnostinen aine voi olla liuoksena, lyofi1isaattina, jauheseoksena, reaqenssitablettina tai se on voitu imeyttää imukykyiseen kanto-aineeseen.

Liuoksen muodossa oleva keksinnön mukainen diagnostinen aine sisältää mieluiten kaikki kokeessa tarvittavat reagenssit. Liuottimena tulevat kysymykseen vesi, tai veden ja jonkin vesiliukoisen orgaanisen liuottimen, kuten esim. metanolin, etanolin, asetonin tai dimetyyliformamidin seokset. Säilyvyyssyistä saattaa olla edullista, että kokeeseen tarvittavat reagenssit jaetaan kahdeksi tai useammaksi liuokseksi, jotka sekoitetaan keskenään vasta varsinaisen tutkimuksen yhteydessä.

Il i7 81 359

Lyofilisaatin muodossa ja kokonaispainoltaan kulloinkin noin 5-20 mg, mieluiten noin 10 mg olevan diagnostisen aineen valmistamiseksi kuivataan liuos, joka kaikkien kokeessa tarvittavien rea-genssien Iisaksi sisältää tavallisia rungon muodostajia, kuten esim. po1yvinyy1ipyrrolidonia, ja mahdollisesti muita täyteaineita, kuten mannitolia, sorbitolia tai ksylitolia.

Jauheseoksen tai reagenssitablettien muodossa oleva diagnostinen aine voidaan valmistaa siten, että kokeessa tfarvittavat aineosat sekoitetaan tavanomaisiin galeenisiin lisäaineisiin ja tästä seoksesta tehdään rakeita. Tällaisia lisäaineita ovat esim. soke-rialkoholit, kuten mannitoli, sorbitoli tai ksylitoli, tai muunlaiset liukoiset inertit yhdisteet, kuten polyetvleeniglykoli tai polyvinyylipyrroiidoni. Tavallisesti tällaisten jauheseosten tai reagenssitablettien paino on suurin piirtein 30-200 mg, mieluiten 50-80 mg.

Koeliuskan muodossa olevan diagnostisen aineen valmistamiseksi imu-kykyinen kantoaine, mieluiten suodatinpaperi, selluloosa tai keino-kuitumatto kyllästetään helposti haihtuviin liuottimiin, kuten esim. veteen, metanoliin. etanoliin tai asetoniin valmistetulla, välttämättömien ja tavanomaisesti tällaisten koeliuskojen valmistamiseen käytettävien reagenssien liuoksella. Tämä voidaan suorittaa yhdessä kyllästysvaiheessa. Usein on kuitenkin tarkoituksenmukaista suorittaa tämä kyllästäminen useammassa vaiheessa, jolloin käytetään sellaisia liuoksia, jotka sisältävät kulloinkin yhden osan tämän diagnostisen aineen aineosista. Täten ensimmäisessä vaiheessa voidaan esimerkiksi kyllästää sellaisella vesiliuoksella, joka sisältää puskurin ja muut vesiliukoiset lisäaineet, ja tämän jälkeen toisessa vaiheessa kyllästetään glykosidaasin substraatin sisältävällä liuoksella. Näitä valmiita kcepaoereita voidaan käyttää yksin tai ne voidaan sinänsä tunnetulla tavalla liimata johonkin alustaan tai mieluiten kiinnittää patenttijulkaisun DBP 2 118 455 mukaisesti muovien ja pienisilmukkaisten verkkojen väliin.

Seuraavissa esimerkeissä esitetään tämän menetelmän joitakin niistä lukuisista muunnelmista, joita voidaan soveltaa keksinnön mu- is 81359 kaisten yhdisteiden synteesissä, ja niissä esitetään esimerkin omaisesti resorufiinijohdannaisten uusien glykosidien käyttö glvkosidaasien aktiivisuuden määrittämiseen. Nämä esimerkit eivät kuitenkaan pyri rajoittamaan tämän keksinnön tavoitteita.

Esimerkki .1

Resorufiini-3-D-galaktooyranosidi a) Resorufiinin valmistaminen

Resorufiini valmistetaan hapettumistuotteestaan resotsuriinistä, jota on kaupallisesti saatavana riittävän puhtaana, tukeutuen Niet zki: n et ai. esitykseen (Ber. Dtsch. Chem. Ges. 2_2 ( 1889) sivut 3020-3038). Tällöin 10 g (43 mmol) resatsuri.inia (Fluka, Buchs, Sveitsi) kuumennetaan dekantterilasissa seoksessa, joka käsittää 50 ml 25 %:sta ammoniakkiliuosta, 25 ml 37 %:sta natrium-vety su 1 fii11l1iuosta ja 50 ml vettä, 30 minuuttia kiehuvassa vesi-hauteessa. Tähän seokseen lisätään vielä 20 ml ammoniakkiliuosta, 7 ml vetysuIfii11i1iuosta ja 20 ml vettä, ja kuumennetaan edelleen 30 minuuttia. Muuntuminen voidaan todeta värin muuttumisesta sinisestä punaiseksi tai ohutkerroskromatograf isesti. Sen jä.lkeen, kun reaktio on täysin päättynyt, seokseen lisätään 10 ml 32 %:sta suolaliuosta, kunnes pH-arvoksi saadaan 5. Tämän reaktioliuoksen . . annetaan seistä vuorokauden jääkaapissa. Tämän jälkeen ruskehtava sakka imetään pois, se pestään jääkylmällä suolahappoliuoksella, pH 4, ja kuivataan H0°C:ssa. Saanto 7,8 g (35,7 mmol; 8!) % teoreettisesta) .

b) Resorufiinin glykosylointi resoruf i ini-β-D-ga 1 aktopy ranosidi ks.i Fenolisen hydroksyy1iryhmän glykosylointi, tetra-asetaatLn toimiessa vä1ivaiheena, onnistui seuraavalla menetelmällä. Seosta, joka oli valmistettu 50 ml:aan metyleenikloridia, ja joka käsitti 2,13 g (10 mmol) hienoksi jauhettua resorufiinia, 4,12 g (10 mmol) ase tobromo-α - D-ga laktoosi a (Sigma, Miinchen), 1,16 g (5 mmol) hopea-I-oksidia (Fluca, Buchs, Sveitsi), 5 g kalsium-sulfaattia (CaS04 . 1/2 H20; Drieriitti), muutaman jodirakeen ja 50^ul kinoliinia, sekoitetaan huoneen lämpötilassa 40 tuntia.

Tällöin 40% resorufiinista muuttuu resorufiini-0-D-galaktopyrano-sidi-tetra-asetaatiksi. Reaktiota voidaan jälleen seurata ohut-

II

19 81 359 kerroskromatografiän avulla. Sen jälkeen, kun kiinteät aineosat on erotettu poimusuodattimella ja sentrifugoimalla, mety-leenikloridi haihdutetaan pyöröhaiduttimessa. Resorufiini-β-D-ga1aktODyranosidi-tetra-asetaatti jää astiaan ruskeankeltaisena siirappina. Saanto on noin 2 g (35% teoreettisesta).

2 g resorufiini-B-D-galaktopyranosi.di-tetra-asetaattia sekoitetaan ilman 1isäpuhdistusta 80 ml:aan kuivaa metanolia. 0,5 g natriumia liuotetaan pieninä palasina, jäähautee.ssa, 20 ml: aan kuivaa metanolia. 6-8 ml tätä metoksidi1 tuosta lisättään 30 minuutin aikana 1 ml:n annoksina resorufiini-3-D-galaktopyrano-sidi-tetra-asetaattiliuokseen jäähauteessa ja sekoittaen, ja deasetylointia seurataan ohutkerroskromatografisesti. Saostunut, oranssin värinen resorufiini-S-D-galaktopyranosidi imetään pois ja se pestään jääkylmällä metano1i11e. Saanto on noin 1 g puhdistamatonta ainetta (70% teoreettisesta). Metanolista taoahtuvalla uudelleen kiteyttämisellä ja sitä seuraavalla kuivaamisella (ei yli 60°C:ssa) saadaan 0,2 g puhdasta tuotetta. Kaikki ohutkerroskromatografiset tutkimukset reaktion etenemisen seuraamiseksi voidaan suorittaa järjestelmällä, jossa käytetään niimaata (Kieselgel 60; Merck, Darmstadt' ja liikkuvana faasina seosta metvleenikloridi/metanoli (9/1). Tässä järjestelmässä : pätevät seuraavat Rf-arvot:

Resorufiini 0,4

Resatsuriini 0,35

Resorufiini-3-D-galaktopyranosidi-tetra-asetaatti 0,9

Resorufiini-6-D-ga1aktopyranosidi 0,1.

Esimerkki 2

Resorufiini-g-D-glukosidi 2,13 g (10 mmol) resorufiinia (valmistettu esimerkin la mukaisesti), 4,li g (10 mmol) asetobromo-a-D-glukoosia ja 3,64 g (10 mmol) heksadekyy1itrimetyy1iammoniumbromidia kuumennetaan 4 tuntia pa 1autusjäähdyttaen seoksessa, joka käsittää 11,5 ml 1 N natriumlipeää ja 50 ml kloroformia. Tämän jälkeen seos haihdutetaan kuivaksi ja sekoitetaan etikkaesteriin. Tämä etik-kaesteri1iuos haihdutetaan jälleen kuivaksi. Se liuotetaan 20 81359 20 ml:aan etanolia. Tästä liuoksesta saostuva tetra-asetyyli-resorufiini-g-D-glukosidi kiteytetään uudestaan metanolista, johon lisätään aktiivihiiltä.

Deasetylointia varten aine liuotetaan 10 ml:aari metanolia. Sen jälkeen, kun seosta on sekoitettu 2 tuntia huoneen lämpötilassa, saostunut tuote imetään pois ja se kuivataan. Saanto: 50 mg.

1H-NMR (/d7c-DMSO): 5= 3,15 - 3,80 (m, 6H); — o 4.5 - 6,5 (leveä, 4H); 5,12 (d, J = 6,9 Hz, 1H); 6,29 (d, J = 2,0 Hz, 1H); 6,80 (dd, J = 9,6 ja 2,0 Hz, 1H); 7,12 (dd, J = 8,5 ja 2,0 Hz, 1H); 7,16 (d, J = 2,0 Hz, 1H); 7,55 (d, J = 9,6 Hz, 1H); 7,80 (d, J = 8.5 Hz, 1H ) .

Esimerkki 3

Resoruf i ini -1-karboksyy1ihappo-metyy1 iesteri 50 g nitrosoresorsiinia, 53,3 g 3,5-dihydroksibentsoehappo-metyyliesteriä ja 28,0 g pyrolusiittia liuotetaan tai suspen-doidaan 500 ml:aan metanolia. Tähän seokseen, sitä jäähauteessa jäähdyttäen ja lämpötilan ollessa 5-10°C lisätään, oisaroittain 34,4 ml väkevää rikkihappoa. Jäähaude poistetaan ja seosta sakotetaan edelleen vielä kaksi tuntia. Sitten siihen lisätään 200 ml ammoniakin vesiliuosta, seosta jäähdyttäen. Saostunut kiintoaines suodatetaan lasikuitusuodattimella. Suodokseen lisätään annoksittain 10 g sinkki jauhetta 5-10°C:n 1ämoöti1assa. Seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa niin kauan, kunnes pelkistyminen on täydellistä (ohutkerroskromatografinen toteaminen, liikkuvana faasina etikkaesteri/metanoliseos 4:1, reaktio-aika noin 1,5 tuntia). Seos haihdutetaan pyöröhaihduttimella l/3:aan alkuperäisestä tilavuudesta hauteen lämpötilan ollessa 25°C. Toivottu tuote saadaan saostumaan tekemällä seos happamaksi väkevällä suolahapolla värin muuttumiseen saakka, seosta jäähdyttäen. Laimealla suolahapolla suoritetun pesun ja vakuu-missa kalsiumkloridilla suoritetun kuivaamisen jälkeen saadaan resorufiini-i-karboksyylihappo-metyyliesteriä. Saanto: 30,9 g (36% teoreettisesta).

Il 2i 81359 1H-NMR: (/Ö76~DMSO) : 5= 3,98 (s, 3H); 6,47 (d, J = 2,2

Hz, 1H); 6,85 - 6,95 (m, 2H); 7,09 (d, J = 2,2 Hz, 1H); 7,60 (d, J = 9,6 Hz, 1H).

Fluoresenssi: absorptio: A = 570 nm max emissäo : λ = 588 nm.

max

Samalla tavalla a) 3,5-dihydroksibentsoehacosta ja nitrosoresorsiinista saadaan resatsuriini-l-karboksyylihapon toimiessa välivaiheena resoru- fiini-l-karboksyylihappoa, UV/VIS (0,1 M kaliumfosfaattipusku- rissa, dH 7,5): A = 569 nm ' max b) 4-0-metyy l i-ga1lushappo-metyyliesteris ta ja nitrosoresorsii- nista saadaan 4-metoksi-resatsuriini-1-karboksvy1ihappo-metyy1i- esterin toimiessa välivaiheena 4-metoksi-resorufiini-l-karbok- syvlihappo-metyvlies teriä, UV/VIS (0,1 M kaliumfosfaattiousku- rissa, dH 7,5): ' = 592 nm max c) 3,5-dihydroksibentsoehappo-metyy1 ies teristä ja 4-kloori-6-nitrosoresorsiinista saadaan 8-k 1o o r i-r e s a t s υ r i i n i-1-k a rbo k-syvlihappo-metvy1iesterin toimiessa välivaiheena 8-kloori-reso-rufiini-l-karboksyylihappo-metyyliesteriä d) 4-O-metyyligallushappo-metyyliesteristä ja 4-bromi-6-nitro-soresorsiinista saadaan 8-bromi-4-metoksi-resatsuriini-l-karbok-svylihaoDo-metyyliesterin toimiessa välivaiheena 8-bromi-4-metoksi resoru f i i ni-1-karboksvylihappo-metyy1 iesteriä e) 5-nitroresorsiinista ja nitrosoresorsiinista saadaan 1-nitro-resatsuriinin toimiessa välivaiheena 1-nitro-resorufiinia :*"· f) resorsiini-5-sulfonihaposta ja nitrosoresorsiinista saadaan • resatsuriini-l-s\:lfonihapon toimiessa välivaiheena resorufiini- 1-sulfonihappoa.

22 81 359

Esimerkki 4

Resatsuriini-4-karboksyyIihappo 160 g (10,5 mmol) ni t rosoresor.s i inia, 1,55 g (.10,0 mmoi) 2,6-dihydroksibentsoehaopoa ja 0,86 g (10 mmol) pyrolusiittia sekoitetaan 20 ml:aan metanolia ja jäähdytetään 0°C:n lämpötilaan. Tähän seokseen tiputetaan 1,06 ml väkevää rikkihappoa. Sitä sekoitetaan vielä 2 tuntia jäähdyttämättä. Saostunut punainen tuote suodatetaan, se pestään metanolilla ja kuivataan. Saanto: 2.3 g (85¾ teoreettisesta).

UV/VIS (0,1 M kaliumfosfaattipuskurissa, pH 7,5): Λ = 614 nm ( e = 48 cm^ mol "*") max

Happamaksi tekemisen jälkeen: \ = 522 nm (e=32 cm^ mol ^ ) max

Esimerkki 5

Resoruf iini-4-karboksyylihappo 2.3 g resatsuriini-4-karboksyylihappoa (valmistettu esimerkin 4 mukaisesti) liuotetaan 20 ml:aan vettä ja 5 ml:aan 25%:sta ammoniakkia. Tähän siniseen liuokseen lisätään jäähauteessa jäähdyttäen 5 g sinkkipölyä. Sitten jäähaude poistetaan, jotta liuos lämpenisi vähitellen huoneen lämpötilaan. Pelkistyminen voidaan havaita helposti värin muuttumisena sinisestä tumman violetiksi, tai se voidaan todeta ohutkerroskromatografisesti (liikkuva faasi: metanoli/etikkaesteri 1:1). Liiallinen sinkki- jauhe suodatetaan pois. Reaktioliuos tehdään häpeämäksi 5 ml :11a jääetikkaa ja väkevää suolahappoa. Saostunut tuote suodatetaan, se pestään laimealla suolahapolla ja kuivataan vakuumissa kalsium-kloridilla. Saanto: 1,8 g (82¾ teoreettisesta).

UV/VIS: (0,1 M kaliumfosfaattipuskurissa, pH 7,5): λ = 579,4 nm (e = 48,6 cm^ mol-"*-); max

Happamaksi tekemisen jälkeen: λ = 485,9 nm (ε = 34,7 cm^ mol ^). max ' , Fluoresenssi: Absorptio: λ = 579 nm ^ max

Emissio : λ = 593 nm.

max

II

23 81 359

Esimerkki 6 1-metyyliresorufiini-4-karboksyylihappo

Analogisesti esimerkissä 4 esitetyllä tavalla 840 mg 2,6-dihyd-roksi-4-metyylibentsoehappoa, 760 mg nitrosoresorsiinia, 430 mq pyrolusiittia ja 0,53 ml rikkihappoa muunnetaan 1-metyyliresat-suriini-4-karboksyylihapoksi. Saanto: 0,8 g. Näin saatu 1- metyyliresatsuriini-4-karboksyylihappo pelkistetään analogisesti esimerkissä 5 esitetyllä tavalla 1-metyyliresorufiini-4-karbok-syylihapoksi. Saanto: 0,4 g.

UV/VIS (0,1 M kaliumfosf aattipuskurissa, oH 7,5): max - 571 nm.

Esimerkki 7

Resoruf iini-4-karboksyylihappomorfolidi 1) N,0,0-triasetyylidihydroresorufiini-4 -karboksyylihaooo Muunnos a) 5 g (19,4 mmol ) resorufiini-4-karboksyylihaopoa tai 5,3 g (19,4 mmol) resatsuriini-4-karboksyylihappoa kuumennetaan 0,5 tuntia palautusjäähdyttäen 100 ml:ssa 10%:sta suolahappoa, jossa on 7 g (38 mmol) tina (II)kloridi a. Tämä liuos värjäytyy tällöin vihreäksi. Seoksen annetaan jäähtyä, saostunut dihydroresorufiini- 4-karboksyylihappo suodatetaan typpi-ilmakehässä ja se kuivataan vakuumissa fosforipentoksidilla. Näin saatua raakatuot.etta kuumennetaan palautus jäähdyttäen 30 minuuttia asetanhydridin 30 ml:n ja natriumasetaatin 20 mg:n kanssa. Reaktioseos kaadetaan 200 ml:aan jäävettä ja sitä sekoitetaan 14 tuntia. Kiinteä aines kiteytetään uudestaan etanoli/vesiseoksesta . Toivottua yhdistettä saadaan 4,8 g (65%).

Sulamispiste: 197-199°C.

Ohutkerroskromatografia (Kieselgeeli, eluenttina kloroformi/ metanoli/jääetikka-seos, 9:1:0,1): = 0,33.

Muunnos b) 5,1 g (20 mmol) resorufiini-4-karboksyylihappoa sekoitetaan 20 ml:ssa asetanhydridiä, jossa on 11 g (60 mmol) tina(II) kloridia, 1 tunnin ajan 80°C:n lämpötilassa. Seos kaadetaan 24 81 359 230 ml:aan jäävettä, sekoitetaan 1 tunnin ajan, suodatetaan ja käsitellään analogisesti muunnoksessa a) esitetyllä tavalla.

Saanto: 5,4 g (71%).

2) Ν,Ο,Ο-triasetyylihydroresorufiini-4-karboksyylihappokloridi 3,85 g:aan (10 mmol) N,O,O-triasetyy1idihydroresorufiini-4-karboksyy1ihappoa laitetaan 5,4 ml (60 mmol) oksalyylikloridia ja seos jäähdytetään -10°C:n lämpötilaan. Tähän lisätään di-metyyliformamidia ja reaktioseoksen annetaan lämmetä sekoittaen huoneen lämpötj. .1 aan. Hajoava tuote liukenee tällöin kaasua kehittäen. Kaasun kehittymisen päättymisen jälkeen seosta sekoitetaan vielä 0,5 tuntia, haihdutetaan, liuotetaan kolmeen kertaan 20 ml:aan kuivaa metyleenikloridia ja haihdutetaan kuivaksi.

Näin saadaan 4 g raakatuotetta, jota jatkokäsitellään ilman lisäpuhdistamista.

Ohutkerroskromatografia (Kieselgeeli, eluenttina kloroformi/ metanoli/jääetikka-seos, 9:1:0,1): = 0,42; väritön täolä, joka värjäytyy punaiseksi muutaman tunnin kuluttua.

3) Ν,Ο,Ο-triasetyylidihydroresorufi ini-4-karboksyylihappc-morfolidi 11,3 g (31,4 mmol) raakaa happokloridia liuotetaan 150 ml:aan kuivaa metyleenikloridia. Tähän lisätään oisaroittain 8,7 ml . . (63 mmol) trietyyliamiinia ja sen jälkeen 3,3 ml (37,7 mmol) morfoliinia. Sekoitusta jatketaan vielä noin 2 tuntia, liuos pestään l%:lla sitruunahapolla, natriumvetykarbonaattiliuoksella ja vedellä, orgaaninen faasi kuivataan magnesiumsulfaatilla ja haihdutetaan. Jäännös kiteytetään uudestaan etanolista. Saanto: 8,1 g (63%), sulamispiste: 133-135°C (hajoaa).

4) Resorufiini-4-karboksyylihappo-morfolidi 3,7 g (9 mmol) triasetyy1idihydroresorufiini-4-karboksyylihappo-morfolidia sekoitetaan 250 ml:aan metanolia ja 250 ml:aan vettä. Tähän lisätään 36 ml 1 N natriumlipeää ja 6,0 g (18 mmol) kaiiumheksasyanoferraatti(III):a ja seosta sekoitetaan 14 tuntia

II

25 81 359 huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen, kun seos on tehty suolahapolla happamaksi pH-arvoon 3, se haihdutetaan kuiviin ja sekoitetaan asetoniin. Tämä väriliuos suodatetaan Kieselgeelin 500 ml:n läoi käyttäen asetonia eluenttina. Sen jälkeen, kun väri-ainepitoinen eluaatti on haihdutettu kuiviin, saadaan 2,3 g (80%) tuotetta.

UV/VIS (0,1 M kaliumfosfaattipuskurissa, pH 7,5): λ = 575 nm, ε= 55,000 cm^ mol ^. max

Ohutkerroskromatoqrafia (eluentti, kuten kohdassa 2):

Rf = 0,52.

XH-NMR 1/h7 -DMSO):0 = 3,3 - 3,8 (m, 8 H); 5,50 — b (d, J = 2 Hz, 1 H); 6,64 (d, J = 10 Hz, 1 H); 6,76 (dd, J = 10 ja 2 Hz, 1 H); 7,44 ja 7,51 (kulloinkin d, J = 10 Hz, 2 H) .

Esimerkki 8

Tetra-asetyyliresorufiini-1-karboksyylihappo-metyyliesteri-B-D-galaktooyranosidi ja tetra-asetyyliresorufiini-9-karboksyyli-happo-metyyliesteri-β-D-galaktopyranosidi 6,8 g resorufiini-l-karboksyylihappo-metyyliesteriä (valmistettu esimerkin 3 mukaisesti), 5,75 g hopea-I-oksidia, 6,75 g hODeakar-bonaattia, 15 g molekyylisiivilää 4 Ä ja 10 g a-bromi-tetra-: asetyyli-galaktoosia sekoitetaan 250 ulissa absoluuttista kloro formia 4 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen, kun tähän seokseen on edelleen lisätty 5 g a-bromi-tetra-asetyy1i-galaktoosia, sitä sekoitetaan yli yön. Reaktioseos suodatetaan lasikuitusuodattimella ja haihdutetaan. Öljymäinen raakatuote kromatografoidaan 2 1:11a Kieselgeeliä käyttäen eluenttina kloroformi/etikkaesteri-seosta 2:1. Tällöin saadaan eluoitua 2,5 g keltaista fraktiota, jonka on 0,28 (HPTCL-Kieselgeeli, sama eluentti). Metanolissa sekoittamisen jälkeen saadaan tetra-ase tyyli resoruf iini-9-karboksyylihappometyy 1 iester i- β-D-gäLakto-pyranosidia oranssinvärisinä kiteinä. Saanto 1,5 g.

26 81 359 1H-NMR (/d76-DMSO): δ = 1,95, 2,03, 2,04 ja 2,14 (kulloinkin s, 12 H); 3,88 (s, 3H); 4,11 (d, J = 7 Hz, 2H); 4,51 (t, J = 7 Hz, 2 H); 5,24 (m, 2 H); 5,36 (m, 1H); 5,69 (m, 1H); 6,31 (d, J = 2 Hz, 1H); 6,97 (d, J = 2 Hz, 1 H); 7,04 (dd, j = 8,8 ja 2,4 Hz, 1H); 7,14 (d, J = 2,4 Hz, 1H); 7,78 (dd, J = 8,8 Hz, 1H).

Tämän jälkeen eluoidaan 1,6 g:n samoin keltainen fraktio, jonka R^. on 0,24. Metanolista kiteytyy tällöin tetra-asetyy 1 iresoruf iini-l-karboksyylihappo-metyy1iesteri-3-D-galaktopyranosidi kellanoransseina kiteinä. Saanto: 1,2 g.

1H-NMR (/57 -OMSO): 6 = 1,95, 2,02, 2,04 ja 2,14 (kulloinkin - - 6 s, 12H); 3,90 (s, 3 H); 4,09 (m, 2H); 4,51 (m, 1H); 5,24 (d, J = 7 Hz, 1H); 5,25 (m, 1H): 5,36 (m, 1H); 5,71 (m, 1H); 6,50 (d, J = 2 Hz, 1H); 6,83 (dd, J = 10 ja 2 Hz,

1H): 7,20 ja 7,24 (kulloinkin d, J = 2Hz, 2H); 7,47 (d, J

^ 10 Hz, 1H ) .

Näiden puhtaiden tuotteiden välistä voidaan vielä eluoida seosfraktio, josta metanolissa suoritetulla uudelleenki-teyttämisellä saadaan 2,5 g molempien isomeeristen yhdisteiden muodostaman seoksen kiteitä.

Analogisella tavalla a-bromitetra-asetyyligalaktoosista ia a) 2-metoksi-resoruf iini-1-karboksyy1ihappo-metyyliesteristä saadaan tetra-asetyyli-4-metoksi-resorufiini-l-karboksyylihaopo-metyyli-esteri-β-D-galaktopyranosidia ja tetra-asetyyli-6-metoksi-resorufiini-9-karboksyylihappo-metyyliesteri- f,-D-galaktopryanos id ia .

b) 8-kloori-resorufiini-l-karboksyylihappo-metyyliesteristä saadaan tetra-asetyyli-8-kloori-resoruf i ini-1-karboksyy1ihappo-metyy liesteri-f-’.-D-gaiaktopyranosidia ja tetra-asetyyli-2-kloori-resorufiini-9-karboksyylihappo- metyvliesteri-g-D-galaktopyranosidia.

27 81 359

Esimerkki 9

Tetra-asetyyli-resorufiini-4-karboksyylihappo-morfoiidi-3-D-galaktopyranosidi ja tetra-asetyyli-resorufiini-6-karboksyy1ihappo-morfoiidi-3-D-galaktopyranosidi 3,26 g (10 rnmol ) resoruf iini-4-karboksyylihappo-morf oi idi a galaktosoidaan analogisesti esimerkin 8 mukaisesti. Tämä raakatuote kromatografoidaan käyttäen 1 1 Kieselgeeliä ja liikkuvana faasina etikkaesteri/asetoni-seosta 3:1. Näin saadaan 0,9 g tetra-asetyy1i-resorufiini-6-karbcksyy1ihappo-morf oiidi-g-D-galaktopyranosidiä, ohutkerroskromatografia (Kieselgeeli, liikkuva faasi esimerkin 7 mukainen ):

Rf = 0,71.

ja 0,4 g tetra-asetyyliresorufiini-4-karboksyylihappo-morfolidi-B-D-galaktopyranosidiä ohutkerroskromatografia (Kieselgeeli, sama liikkuva faasi): R = 0,76 sekä 1,2 g näiden molempien isomeerien muodostamaa seos-fraktiota .

Esimerkki 10

Resorufιin i-1-karboksyylihappo-metyy1iesteri-B-D-galakto- pyranosidi : 1,2 g tetra-asetyyliresorufiini-9-karboksyylihappo-metyyli- esteri-8-D-galaktopyranosidia deasetyloidaan analogisesti esimerkissä 2 esitetyllä tavalla natriummetylaatti/metanoli-.... seoksella. Saanto: 0,8 g.

UV/VIS (0,1 M kaliumfosfaattipuskurissa, pH 7,5): λ = 464 nm ( c = 21,8 cm^ , mol ^ ) . max ' ' 3-galaktosidaasilla suoritetun pilkkomisen jälkeen saadaan resorufiini-1-karboksyylihappo-metyy1iesterin anioni: λ = 572 nm ( ε = 65,4 cm^ mol-''"), max 1H-NMR (/Ö7.-DMS0): δ = 3,20 - 3,80 (m, 6H); 3,91 (s,

— ” O

3H) : 5,09 (d, J = 7,5 Hz, 1H): 6,30 (d, J = 2,1 Hz, 1H); 6,81 (dd, J = 9,8 ja 2,1 Hz, 1H); 7,30 ( m, 2H); 7,51 (d, J = 9,8 Hz, 1H); OH-protonit erittäin leveitä, noin 5.

28 81 359

Analogisesti vastaavat tetra-asetaatit deasetyloimalla saadaan a) resoruf iini-l-karboksyylihappo-metyyliesteri-B-D-c alakto-oyranosidia 1H-NMR (/D7C-DMS0): 6 = 3,4 - 3,7 (m, 6 H): 5,09 (d, J = 7,5 Hz, 1 H); 6,34 (d, J = 2 Hz, 1 H): 6,97 (d, J = 2 Hz, l H): 7,08 - 7,17 (m, 2 H): 7,75 (d, J = 10 Hz, 1 H); OH: erittäin leveä, noin 5 ppm b) 4-metoksi-resoruf i ini-1-karboksyy1ihaopo-metyy1iester i-0rD-qalaktoovranosidia c) 6-metoksi-resoruf i ini-9-karboksyy1ihapoo-metyy1iesteri-B-D-galaktopryanosidia d) 8-kloori-resorufiini-,l-karboksyylihappo-metyyliesteri-β-D-galaktopyranosidia e) 2-kloori-resorufi i ni-9-karboksyy1ihappo-metyyliesteri-P-D-galaktopyranosidia f) resorufi ini-6-karboksyylihappomorfolidi-g-D-galaktopyra-nosidia R^. ( etikkaesteri/isoprooanol i/vesi 9:4:2): 0,3.

β-galaktosidaasi1la suoritetun pilkkomisen jälkeen: UV/VIS (0,1 M kaliumfosfaattipuskurissa, pH 7,5): λ =574,6 nm max fluoresenssiemissio:/ = 593 nm max g) resoruf iin i-4-karboksyy1ihappomorfoiidi-β-D-galakto-oyranosidia.

R (etikkaesteri/isopropanoli/vesi 9:4:2): 0,3 β-Galaktosidaasilla suoritetun pilkkomisen jälkeen: UV/VIS (0,1 M kaliumfosfaattipuskurissa, pH 7,5): λ = 574,6 nm, max fluoresenssiemissio: λ = 593 nm.

max

Esimerkki 11

Resoruf i ini-9-karboksyylihappo-B-D-galaktopyranosidi-tri-etyyli-ammoniumsuola 266 mg resorufiini-9-karboksyylihappo-metyyliesteri-β-D-galaktopyranosidia sekoitetaan 50 ml:aan vettä ja 20 ml:aan 1,4-dioksaania. Tähän lisätään vähitellen 5 ml 0,1 N nat-

II

29 81 359 riumlipeää 0,5 ml:n annoksina, jolloin liuoksen pH-arvo ei saa kohota yli 12,5, Reaktioseos kaadetaan 6 ml:n karbonaattimuodossa olevan DEAE-Sephadex-hartsin päälle.

Se pestään 180 ml :11a vettä.

Tämän jälkeen tuote eluoidaan 0,1 M trietyyliammoniumkar-bonaattipuskuri1la, pH 7,5. Eluaatti haihdutetaan vakuu-missa. Tämän jälkeen se haihdutetaan useaan kertaan etanolin kanssa. Saanto: 10 mg resorufiini-9-karboksyy1i-happo-S-D-galaktopyranosidi-trietyyli ammoniumsuola.

UV/VIS (0,1 M kaliumfosfaattiouskuri, pH 7,5): λ = 4 6 5 nm max B-ga1aktosidaasi11 a suoritetun pilkkomisen jälkeen: λ = 5 70 nm. max

Esimerkki 12

Resatsuriini-B-D-galaktopyranosidi 12,6 g resatsuriinin natriumsuolaa liuotetaan 65 ml:aan 1 N natriumlipeää ja 80 ml:aan vettä. Tähän lisätään 150 ml:ssa kloroformia olevia, 20,6 g asetobromi-a-D-galaktoosia ja 18,2 g heksadekyylitrimetyyliammonium-. . bromidia. Tätä seosta kuumennetaan 3 tuntia palutusjääh- dyttäen. Sitten se haihdutetaan kuivaksi ja sekoitetaan etikkaesteriin. Tämä etikkaesteriliuos haihdutetaan jälleen ja se kromatografoidaan 500 g Kieselgeeliä käyttäen (eluentti: metyleenikloridi/etikkaesteri 3:1). Saadaan 2,13 g tetra-asetyyliresatsuriini-6-D-galaktopyranosidia, jonka Rf-arvo on 0,5 (HPTLC-Kieselgeeli, sama liikkuva faasi).

Deasetyloimiseksi 2,13 g tetra-asetyyli-johdannaista sekoitetaan huoneen lämpötilassa tunnin ajan 100 ml:ssa absoluuttista metanolia, jossa on 0,1 g natriummetylaattia. Saostunut tuote imetään pois ja kuivataan vakuumissa kaisiumkloridilla. Saanto: 1,0 g.

= 0,62 (HPTLC-Kieselgeeli, etikkaesteri/isopropanoli /vesi 9:4:2) .

30 81 359 1H-NMR (/B7c-DMSO): <5 = 3,30 - 3,90 ( m, 6H); 4,54 (br.d, J = 4,4 Hz, 1H); 4,67 (br. t, J = 4,4 Hz, 1H); 5,07 (d, J = 7 Hz, 1H); 5,27 (br. d, J = 4,4 Hz, 1H); 6,15 (d, J = 2 Hz, 1H); 6,63 (dd, J = 9,6 ja 2 Hz, 1H); 7,10 (dd, J = 9 ja 2 Hz, 1H); 7,2 (m, 2H): 7,96 (d, J = 9,6 Hz, 1H); 8,07 (d, J = 9 Hz, 1H).

Esimerkki 13 8-kloori-resat.suriini-4 -karboksyylihappo 4,3 g (30 mmol) 4-k 1oori-resorsiinia liuotetaan 20 mitään etanolia. Sen jälkeen, kun 2,4 g ka 1iumhydroksidia on lisätty, seos jäähdytetään 5°Ctn lämpötilaan. 2,81 ml isc-pentyy1 initrii11iä lisätään tipoittain seosta jäähdyttäen.

Tämän jälkeen sitä sekoitetaan edelleen yli yön huoneen lämpötilassa. Kiintoaines suodatetaan, liuotetaan veteen ja tehdään happamaksi. Keltainen saostuma suodatetaan uudestaan ja kuivataan vakuumissa 40°Ctn lämpötilassa.

Saanto: 2,5 a (48%) 4-kloori-6-nitrosoresorsiinia.

R = 0,28 (HPTLC-Kieselgeeli, liikkuva faasi: metanoli/ etikkaesteri 1:3).

1,83 g 4-kloori-6-nitrosoresorsiinia, 1,55 g 2,6-dihydroksi-bentsoehappoa, 0,86 g pyrolusiittia ja 1,06 ml rikkihappoa sekoitetaan 20 mitään metanolia ja sekoitetaan 2 tuntia 0°C:ssa sekä 14 tuntia huoneen lämpötilassa. Saadaan punaista kiintoainetta, joka suodatetaan ja kuivataan.

Saanto: 2,45 g (80% 8-k1oori-resatsuriini-4-karboksyyli-happoa.

UV/VIS (0,1 M kaliumfosfaattipuskurissa, pH 7,5): λ = 621,5 nm. max

Analogisesti a) 2-metyyli-resorsiinista saadaan 2-metyyli-6-nitrosoresorsii-nin toimiessa välivaiheena 6-metyyli-resatsuriini-4-karboksyyli-happoa;

II

3i 81359 b) 4-metyyli-resorsiinista saadaan 4-metyyli-6-nitrosoresorsiinin toimiessa välivaiheena 8-metyyli-resatsuriini-4-karboksyyli-happoa; c) 4-bromi-resorsiinista saadaan 4-bromi-6-nitrosoresorsiinin toimiessa välivaiheena 8-bromi-resatsuriini-4-karboksyylihap-poa .

Esimerkki 14 8-kloori-resoruf iini-4-karboksyylihappo 2 g 8-kloori-resatsuriini-4-karboksyylihappoa (valmistettu esimerkin 10 mukaisesti) liuotetaan 20 ml:aan vettä ja 5 ml:aan 25%:sta ammoniakkia. Seosta jäähdyttäen siihen lisätään sinkki-jauhetta sen verran, että väri vaihtuu täydellisesti punavio-letiksi. Liiallinen sinkki suodatetaan pois. Happamaksi tekemisen jälkeen saostunut tuote suodatetaan ja kuivataan vakuu-missa 40°C:n lämpötilassa kalsiumkoridi1la . Saanto: 1,5 g (79%) 8-kloori-resorufiini-4-karboksyy1ihappoa.

UV/VIS (0,1 M kaliumfosfaattipuskurissa, pH 7,5): λ = 585,5 nm. max

Analogisesti a) 6-metyyli-resatsuriini-4-karboksyylihaposta saadaan 6-metyyli-resorufiini-4-karboksyylihappoa; b) 8-metyyli-resatsuriini-4-karboksyylihaposta saadaan 8-metyy1i-resorufiini-4-karboksyylihappoa; c) 8-bromi-resatsuriini-4-karboksyylihaposta saadaan 8-bromi-resoruf iini-4-karboksyylihappoa.

Esimerkki 15

Resorufiini-9-karboksyylihappo-metyy1jesteri-g-D-galaktopyra-nosidi 3,9 g:aan penta-asetyyligalaktoosi sekoitetaan 0,1 g vedetöntä sinkkikloridia ja kumennetaan 125°C:een. Tätä sekoitetaan 20 minuuttia 10 torrin paineessa. Tähän sulatteeseen lisätään 1 g resorufiini-l-karboksyylihappo-metyyliesteriä. Seosta sekoitetaan tunnin ajan 41°C:ssa, jonka jälkeen se kromatogra-foidaan esimerkissä 7 esitetysti Kieselgeelillä, ja käyttäen 32 81359 liikkuvana faasina kloroformi/etikkaesteri-seosta 2:1.

Saanto: 25 mg tetra-asetyyli-resorufiini-9-karboksyylihappo-metyyliesteri-a-D-galaktopyranosidia (keltainen öljy).

R^. = 0,22 (HPTLC, Kieselgeeli, sama liikkuva faasi).

Deasetyloiminen resorufiini-9-karboksyylihappo-metyyli-esteri-a-D-galaktopyranosidiksi suoritetaan analogisesti esimerkissä 10 esitetyllä tavalla.

Esimerkki 16

Resorufiini-9-(3,6-dioksaoktyyli)-esteri-B-D-galaktopryanosidi 0,6 g:aan tetra-asetyyliresorufiini-9-karboksyy1ihappo-metyy1i-esteri-6-D-galaktopyranosidia laitetaan 50 ml diety leenicflykol i-monoetyy 1 ieetteriä ja spaattelin kärjellinen natriumhydrr.diä ja tätä seosta sekoitetaan 15 minuuttia huoneen lämpötilassa.

Tämän jälkeen lisätään 100 ml asetonia. Saostunut kiintoaines suodatetaan ja kuivataan. Saanto: 56 mg resorufiini-9-karboksyyli-happo-(3,6-dioksaoktyyli)-esteri-β-D-galaktopyranosidia.

= 0,54 (HPTLC, Kieselgeeli, liikkuvana faasina etikkaesteri/ isopropanoli 9:4).

Esimerkki 17

Resoruf iini-maltoheptaosidi

Amylaasilla (E.C. 2.4.1.19), esimerkiksi Bacillus macerais-bakteerista peräisin olevalla amylaasilla, on hydrolyyttisen ja syklisoivan vaikutuksensa ohella myös glykosyyliryhmiä siirtäviä ominaisuuksia, joita voidaan hyödyntää oligosakkaridien ja oligosakkaridi johdannaisten synteesissä (Methods in Carbohydrate Chemistry II, 347).

680 mg Bacillus macerans-bakteerista DSM 24 peräisin olevaa 'V amylaasia ( lyofi1isaatti; paino 0,46 U/mg; tämän annoksen proteiinipitoisuus 28%), 500 mg resorufiini-glukosidia, 3,5 g oc-syklodekstriiniä ja 70 ml Soerensen-fosfaattipuskuria (pSH 6.2; 0,01 M) sekoitetaan keskenään. Tätä panosta inkuboidaan 24 tuntia

II

33 81 359 37°C:ssa. Tämän jälkeen seoksen yksinkertaistamiseksi a- ja syntynyt S-syklodekstriini erotetaan tetrakloorietyleenin inkluusioyhdisteenä. Verkkoontuneella dekstraani1la (Sephadex LH 20) suoritetun kromatografiän jälkeen saadaan 50 mg reso-rufinyylimaltoheptaosidin lyofilisaattia, joka on erittäin aktiivista amylaasikokeessa.

Esimerkki 18 B-D-galaktosidaasin aktiivisuuden määrittäminen a) käytettyjen liuosten valmistaminen

Puskuriliuos: HEPES 100 mmol/1

Natriumkloridi 154 mmol/1

Magnesium-L-aspartaatti 2 mmol/1 BSA 10 g/1

Tween-20 0,5 g/1 pH-arvo (asetettu natriumlipeällä) 7,3 (3 7°C)

Reagenssi1iuos 1:

Edellä kuvattuun puskuriliuokseen liuotetaan 0,8 mmol/1 reso-furiini-3-D-ga1 aktopyranosidia.

Reagenssiliuos 2:

Edellä kuvattuun puskuriliuokseen liuotetaan 3,5 mmol/1 reso-ruf i ini-9-karboksyy1ihappo-β-D-galaktopyranosidia.

Reagenssiliuos 3: . . Edellä esitettyyn puskuriliuokseen liuotetaan 1,0 mmol/1 reso- rufiini-9-karboksyy1ihappometyy1iesteri-β-D-galaktopyranos idi a.

Entsyymiliuos

Kaupallisesti saatavana olevaa, Escherichia coli-bakteerista peräisin olevaa 3-D-galaktosidaasia liuotetaan edellä kuvattuun puskuriliuokseen. Tämän liuoksen aktiivisuus on noin 0,03 U/ml (valmistajan antamien tietojen mukaan).

34 81 359 b) Mittauksien suorittaminen

Mittaaminen suoritetaan fotometrisesti aallonpituudella 579 nm.

950^,ul reagenssia sekoitetaan 1 cm: n kyvetissä 37°C:n lämpötilassa 50^ul:aan entsyymi liuosta. Reaktion mittana ilmoitetaan ekstinktion kohoaminen aikayksikössä, /mExt/min7· Se lasketaan mitatusta ekstinktiosta jakamalla se reaktioajalla.

Seuraavassa taulukossa on esitetty havaitut mittaustulokset

Reagenssin no. Reaktio /mExt/min7 1 85 2 46 3 76

Esimerkki 19 3-D-galaktosidaasin osoittaminen indikaattorikalvon avulla Seuraavista aineosista valmistetaan homogeeninen massa: 5 ml 0,5 M kaliumfosfaatin ja 0,05 M magnesiumkloridin vesi-liuosta , pH 7,3; 0,13 g natriumalginaattia; 8 g polyvinyylipropionaatin 50%:sta dispersiota 10 g Kieselgeeliä 12 ml vettä 0,4 g Triton X-100:aa 50 mg resoruf iini-5-D-galaktopyranosidia, liuotettuna 5 ml:aan metanolia.

Tämä massa levitetään 0,1 mm paksulle polykarbonaattikalvolle (Pokalon, Fa. Lonza), jonka rakoleveys on 0,2 mm. Tämä kerros kuivataan 50°C:n lämpötilassa, jonka jälkeen se leikataan 6x6 mm suuruisiksi paloiksi. Nämä liimataan liimanauhalla 400^um paksun polystyrolikalvon päälle.

Il 35 81 359 Näin saadut koeliuskat kastetaan lyhyeksi ajaksi määritettävään 3-D-galaktosidaasia sisältävään liuokseen. Kun liuskoja on tämän jälkeen pidetty 2 minuuttia huoneen lämpötilassa, muodostuu punainen reaktioväri, jonka voimakkuus riippuu koeliuoksessa olevan β-D-galaktosidaasin pitoisuudesta. Sellaisten koeliuosten, joissa β-D-galaktosidaasin pitoisuus on tietty ja tunnettu, avulla voidaan saada aikaan väriasteikko, jonka perusteella näytteessä olevan β-D-galaktosidaasin tuntematon pitoisuus voidaan ilmoittaa .

Edellä kuvattuja koeliuskoja voidaan myös käyttää määritettäessä näytteessä olevan β-D-galaktosidaasin aktiivisuus kineettisesti heijastusfotometrian avulla. Myös tässä tapauksessa valmistetaan tavalliseen tapaan standardikäyrä sellaisten näytteiden avulla, joiden näytteiden β-D-galaktosidaasin aktiivisuus tunnetaan, ja tämän standardikäyrän avulla näytteessä olevan g-D-galaktosi-daasin tuntematon aktiivisuus saadaan ilmoitettua.

Esimerkki 20

Vapaan ja konjugoidun β-D-galaktosidaasin aktiivisuuden määrittäminen a) Käytettyjen liuosten valmistaminen

Puskuriliuos: HEPES 100 mmol/1

Natriumkloridi 154 mmol/1

Magnesium-L-aspartaatti 2 mmol/1 ; BSA 10 g/1

Tween-20 0,5 g/1 pH-arvo (asetettu natriumlipeällä) 7,3 (3 7°c)

Reagenssiliuos:

Edellä kuvattuun puskuriliuokseen liuotetaan 0,8 mmol/1 reso-rutiini-β-D-galaktopyranosidia.

Entsyymiliuos: Tähän puskuriin liuotetaan tavanomaista kaupallisesti saatavaa, Escherichia coli-bakteerista peräisin olevaa β-D-galaktosidaasia.

36 81359 Tämän liuoksen aktiivisuus on noin 0,08 U/ml (valmistajan antamien tietojen mukaan).

Entsyymi-konjuqaattiliuos Tässä käytetään 3-D-galaktosidaasi-vasta-aine-preparaattia. Tällaisten entsyymi-vasta-aine-konjugaattien valmistaminen on tunnettua. Se on esitetty esimerkiksi julkaisussa Biochem. Biophys. Acta 612, 40-49 (1980). Tämä preparaatti laimennetaan puskurilla siten, että sen aktiivisuus on suurin piirtein verrattavissa edellä kuvattuun entsyymiliuoksen aktiivisuuteen.

b) Mittauksen suorittaminen

Mittaaminen suoritetaan fotometrisesti aallonpituudella 578 nm.

950 ^ul reagenssiliuosta sekoitetaan kulloinkin 1 cm:n kyvetissä 37°C:n lämpötilassa 50 /ul:aan entsyymiliuosta tai 50 ^ul:aan entsyymi-konjugaattiliuosta. Reaktion mittana ilmoitetaan ekstinktion kohoaminen aikayksikköä kohden, yksikössä _/mExt/min_/.

Vapaalla 3-D-galaktosidaasilla suoritetussa reaktiossa mitataan tulokseksi 85 mExt/min; 3-D-ga1aktosidaasi-vasta-aine-konjugaa-tilla suoritetussa reaktiossa mitataan tulokseksi 92 mExt/min.

Molemmat mitatut arvot osoittavat, että sekä vapaalla että konju-goidulla 3-C>~galaktosidaasilla saadaan erittäin hyvin mitattava ekstinktion ero.

Tästä seuraa, että kuvatut yhdisteet sopivat samalla tavalla substraateiksi sekä vapaalle glykosidaasilie että glykosidaasi-konju-gaatille. Maita uusia substraatteja ei täten voida käyttää pelkästään diagnostisisina aineina vapaiden glykosidaasien määrittämiseksi. Niitä voidaan käyttää myös edullisesti sellaisissa immunologisissa määritysmenetelmissä, joissa indikaattorientsyyminä käytetään jotakin glukosidaasia.

Esimerkki 21 a-amylaasin aktiivisuuden määrittäminen

Suodatinpaperi kyllästetään sitraattipuskuriin liuotetulla reso-

II

37 81 359 rufiini-maltoheptaosidilla (valmistettu esimerkin 17 mukaisesti). Näin saatu reagenssipaperi laitetaan peräkkäin a-amylaasia sisältävään näytteeseen sekä a- ja β-glukosidaasiin. Muutaman minuutin kuluttua voidaan todeta selvästi nähtävä punainen väri, jonka voimakkuus on verrannollinen näytteen α-amylaasipitoisuuteen.

Tunnettuja a-amylaasipitoisuuksia sisältävien näytteiden avulla voidaan valmistaa standardikäyrä, jonka perusteella näytteen tuntematon a-amylaasipitoisuus voidaan määrittää.

Edellä olevissa esimerkeissä käytettiin seuraavia lyhenteitä: HEPES 2-/4- (2-hydroksie tyyli ) - l-piperatsinyyl_i/-etaanisulfonihappo BSA Naudan seerumin albumiini (bovine serum albumin)

Tween 20 Polyoksietyleeni(20)sorbitaanimonolauraatti.

Claims (12)

38 8 1 359

1. Yleisten kaavojen Ia tai Ib R1 R6 VV vVrs ! (Ia) Glykosidi A1 2 R3 4 R1 R,6 <-^K-^ynVY'r5 I (Ib) ^ Qy O-Glvkosidi ° I | R2 mukaiset resorufiini-johdannaisten glykosidit, joiden kaavoissa Ia ja Ib R^ tarkoittaa vetyä, 2 3 5 R , R ja R , jotka voivat olla samoja tai erilaisia, tarkoittavat vetyä, halogeenia tai alempaa alkyyliryhmää, 4 6 R ja R , jotka voivat olla samoja tai erilaisia, tarkoittavat vetyä, halogeenia, syanoryhmää, alempaa alkyyliryhmää, alempaa alkoksiryhmää, karboksiryhmää, alempaa alkoksikarbonyyliryhmää, alempaa karboksialkyyliryhmää, alempi-alkoksikarbonyyli- alempi-alkyvliryhmää tai mahdollisesti yhteen tai kahteen kertaan substituto.itua karboksiamidoryhmää tai ryhmää -COO-(CHoCH„0) -R7 2 n 7 jossa R tarkoittaa vetyä tai alempaa alkyyliryhmää ja n on kokonaisluku 1-4, jolloin R^ voi lisäksi tarkoittaa sulfonyyli- tai nitroryhmää, ja Y tarkoittaa typpeä tai ryhmää N—> 0. II Patenttivaatimuksen 1 mukaiset glykosidit, tunnetut 2 siitä, että glykosidijäännös tarkoittaa β-D-galaktopyranosidi-, 3 α-D-galaktopyranosidi-, 2-D-glukopyranosidi-, a-D-glukopyrano- 4 sidi- tai α-D-mannopyranosidijäännöstä. 39 81 359

2 Ri R6 -^ I I I (3 Ib) Q> f °' "Y’ ^0H i3 L4 joissa symboleilla R^-R^ ja Y on edellä esitetty merkitys, mukaiset yhdisteet muunnetaan sinänsä tunnetulla tavalla per-O-substi-tuoiduiksi glykosideiksi mono- tai oligosakkaridilla tai näiden 1-halogeno-johdannaisella, jolloin kulloinkin kaikki hydroksi-ryhmät on substituoitu jollakin hiilihydraattikemiassa tavallisella suojaavalla ryhmällä, jonka jälkeen näistä per-O-subs-tituoiduista glykosideista saadaan yleisten kaavojen Ia tai Ib mukaiset resorufiini-johannaisten glykosidit irroittanalla suojaavat ryhmät sinänsä tunnetulla tavalla.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset glykosidit, tunnetut siitä, että glykosidijäännös tarkoittaa sellaista oligosakkaridia, joka käsittää 2-10 monosakkaridiyksikköä.

4. Menetelmä yleisten kaavojen Ia tai Ib R1 R6 y J^r5 "Γη ! ! (Ia) o' 'X. Glykosidi-0 | | o R3 R4 R1 R6 D2 ! | 5 R Y R ! r " |i (it,) O j O-Glykosidi R3 R4 -· : mukaisten resorufiini-johdannaisten glykosidien valmistamiseksi, " joiden glykosidien kaavoissa Ia ja Ib 1 2 3 5 , R tarkoittaa vetyä, R , R ja R , jotka voivat olla samoja tai erilaisia, tarkoittavat vetyä, halogeenia tai alempaa alkyyli- ryhmää, 4 r R ja Ro, jotka voivat olla samoja tai erilaisia, tarkoittavat vetyä, halogeenia, syanoryhmää, alempaa alkyyliryhmää, alempaa alkoksiryhmää, karboksiryhmää, alempaa alkoksikarbonyyliryhmää. ' : alempaa karboksialkyyliryhmää, alempi-alkoksikarbonyyli- alempi-alkyyliryhmää tai mahdollisesti yhteen • · tai kahteen kertaan substituoitua karboksiamidoryhmää, tai ryhmää -COO- ( Cll _CH ,,0 ) -R7, 2. n jossa R7 tarkoittaa vetyä tai alempaa alkyyliryhmää ja n on kokonaisluku 1-4, 40 81 359 jolloin R^ voi lisäksi tarkoittaa sulfonyyli- tai nitroryhmää, ja Y tarkoittaa typpeä tai ryhmää N—> 0, tunnettu siitä, että yleisten tautomeeristen kaavojen Ha ja Hb R1 H6 | ( 11 a ) HO T Y Xs-0 <3 1 4 R R 1 fi

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisten resorufiini-johdannaisten glykosidien käyttö vastaavien glykosidaasien aktiivisuuden määrittämiseen.

6. Patenttivaatimuksen 1 tai 3 mukaisten resorufiini-johdannaisten glykosidien käyttö sakkaridiketjuja pilkkovien entsyymien aktiivisuuden määrittämiseen.

7. Diagnostinen aine glykosidaasien osoittamiseksi, sisältäen yhden tai useamman kromogeenisen ja/tai fluorogeenisen subs- 4i 81359 straatin, sopivan puskuriaineen sekä mahdollisesti muita tavallisesti käytettyjä apuaineita, tunnettu siitä, että kromogeenisina ja fluorogeenisina substraatteina käytetään patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisia resorufiini-johdannaisten glykosideja.

8. Diagnostinen aine sakkaridiketjuja pilkkovien entsyymien osoittamiseksi, sisältäen yhden tai useamman kromogeenisen ja/tai fluorogeenisen substraatin, sopivan puskuroivan aineen, mahdollisesti muita tavallisesti käytettyjä apuaineita, sopivan glykosidaasin sekä mahdollisesti muita apu-entsyymeitä, tunnettu siitä, että kromogeenisina ja fluorogeenisina substraatteina käytetään patenttivaatimuksen 1 tai 3 mukaisia resorufiini-johdannaisten glykosideja.

9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen diagnostinen aine, tunnettu siitä, että apuaineina käytetään lisäksi kostutusainetta, galeenisia lisäaineita ja/tai rungon muodostajia .

10. Resorufiini-johdannaiset, joilla on yleiset tautomeeri-set kaavat II'a ja II'b R1' R6' R2 Rs' Il I (ll'a) HO o R3' R4' Rl , R6 / J 0 ^-1 <ii,b> R3' R4' 42 81 359 joissa R1' tarkoittaa vetyä R2', R3' ja R5', jotka voivat olla samoja tai erilaisia, tarkoittavat vetyä, halogeenia tai alempaa alkyyliryhmää, R4' ja R^', jotka voivat olla samoja tai erilaisia, tarkoittavat vetyä, halogeenia, syanoryhmää, alempaa alkyyliryhmää, alempaa alkoksiryhmää, karboksiryhmää, alempaa alkoksikar-bonyyliryhmää, alempaa karboksialkyyliryhmää, alempi-alkok-sikarbonyyli-alempi-alkyyliryhmää tai mahdollisesti yhteen tai kahteen kertaan substituoitua karboksiamidoryhmää tai ryhmää -C00-(CH2CH20)n-R7 jossa R7 tarkoittaa vetyä tai alempaa alkyyliryhmä ja n on kokonaisluku 1-4, jolloin R·1 -R° eivät voi kaikki samanaikaisesti tarkoittaa vetyä, ja Y tarkoittaa typpeä tai ryhmää N -» 0, ja jolloin vähintään yksi ryhmistä R4' ja R6' tarkoittaa alempaa alkoksikar-bonyyli-, mahdollisesti yhteen tai kahteen kertaan substituoitua karboksiamidoryhmää tai ryhmää -C00-(CH2CH20)n-R7, kun Y tarkoittaa typpeä.

11. Yleisten tautomeeristen kaavojen Ila ja Hb R1 R6 r2 y r5 ^ . Il I ^ (ixa) H0 o R3 R4 R1 R6 ^ «2γΑγ*γ r5 ^ j} (Hb) 0 0 R3 R4 II 43 81359 joissa R1 tarkoittaa vetyä R2, R3 ja R5, jotka voivat olla samoja tai erilaisia, tarkoittavat vetyä, halogeenia tai alempaa alkyyliryhmää, R4 ja R6, jotka voivat olla samoja tai erilaisia, tarkoittavat vetyä, halogeenia, syanoryhmää, alempaa alkyyliryhmää, alempaa aikoksiryhmää, karboksiryhmää, alempaa alkoksikar-bonyyliryhmää, alempaa karboksialkyyliryhmää, alempi-alkok-sikarbonyyli-alempi-alkyyliryhmää tai mahdollisesti yhteen tai kahteen kertaan substituoitua karboksiamidoryhmää tai ryhmää -C00-(CH2CH20)n-R7 jossa R7 tarkoittaa vetyä tai alempaa alkyyliryhmä ja n on kokonaisluku 1-4, jolloin R6 voi lisäksi tarkoittaa sulfonyyli- tai nitroryh-mää, ja Y tarkoittaa typpeä tai ryhmää N -> 0, mukaisten resorufiini-johdannaisten käyttö patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisten resorufiiniglykosidien valmistamiseksi . « 81359