HU198734B

HU198734B - Process for producing glycosides of resorufin derivatives, process for determining the activity of glycosidases and enzymes splitting saccharide chain, and diagnostics for detecting enzymes

Info

Publication number: HU198734B
Application number: HU851183A
Authority: HU
Inventors: Christian Klein; Hans-Georg Batz; Manfred Sernetz; Juergen Hofmann
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1984-03-29
Filing date: 1985-03-28
Publication date: 1989-11-28
Also published as: AU4037585A; EP0156347A3; ES8603192A1; SU1574173A3; DK140385A; CS273162B2; ATE66929T1; KR850006427A; JPH02160771A; DE3411574A1; JPH0579064B2; CS206485A2; JPH027589B2; FI851248L; HUT38104A; FI81359B; JPS60218397A; CA1257253A; EP0156347A2; EP0156347B1

Description

A találmány tárgya eljárás rezofurin-származékok glikozidjainak előállítására, eljárás glikozidázok és szacharid-láncokat hasító enzimek aktivitásának meghatározására és diagnosztikum enzimek kimutatására.

A glikozidázok mind az emberek, mind az állatok szervezetében sokféle fiziológiai funkciót töltenek be. fgy pl. a β-D-galaktozidáznak a szénhidrát-anyagcsere folyamatában van fontos szerepe, minthogy általa a laktóz hidrolízise következik be. Ezen túlmenően a β-D-galaktozidáz kulcsenzim a glikoproteidek, a mukopoliszacharidok és a glikoproteinek lebontásánál. Fiziológiai szempontból jelentős további glikozidázként még az α-D-galaktozidázt, az α-D- és a β-D-glükozidázt, valamint az α-D-mannozidázt nevezzük meg. ^r

Fiziológiai értékük miatt a glikozidázok fontossága és jelentősége az utóbbi években mind a diagnosztikai, mind a biotechnológia területén megnőtt. így például a nevezett enzimeket egyre nagyobb mértékben alkalmazzák indikátorenzimként az úgynevezett enzimimmunoassay eljárásokban. Ebben a vonatkozásban különösen a β-D-galaktozidáz használata előnyös [lásd például: annals of Clinical Biochemistry, 16, 221-240(1979)].

A glikozidázok aktivitásának meghatározása ennélfogva mind a klinikai kémiában, mind a diagnosztikában egyre fokozódó jelentőségű. Egészen általánosan ezt a meghatározást úgy végzik, hogy a glikozidázt tartalmazó próbamintát egy alkalmas szubsztrátummal elegyítik, amikor is az enzim hasítja a szubsztrátumot. Ezután valamelyik hasítási terméket alkalmas módon meghatározzák. Akár az enzim hatására felszabaduló glikont, akár az aglikont lehet mérni, de rendszerint az utóbbit szokták meghatározni.

Szubsztrátumként gyakran a meghatározandó enzimnek megfelelő természetes szubsztrátum kerül alkalmazásra, de különösen előnyös módon olyan glikozidokat használnak, melyek aglikonja valamilyen spektroszkópiai úton könnyűszerrel kimutatható maradék.

Számos glikozidáz-szubsztrátum ismert, melyekből a megfelelő glikozidázzal végzett hasítás után olyan aglikont kapnak, melyet mind a látható fény, mind az UV-fény tartományban spektroszkópiával vagy fluorometriával mérni lehet.

így a Biochem. Z. 333, 209 (1960) irodalmi helyen a β-D-galaktozidáz szubsztrátumaként a fenil-^-D-galaku időt és ennek az aromás gyűrűn helyettesített további származékait (mint például az o-nitro-fenil- és a p-nitro-fenil-^-Dgalaktozidot) ismertetik. A hidrolízissel felszabadult fenolokat az UV-tartományban fotometriásan határozzák meg, illetőleg a nitro-fenolokat a látható fény hullámhossz-tartományban a rövidebb hullámhosszakon, ugyancsak fotometriás módszerrel mérik. Indikálásra még az aminoantipirinnel történő oxidatív kapcsolási reakciót is alkalmazni lehet (Analytical Biochem. 40, 281 (1971)).

Hisztokémiai vizsgálatokhoz naftalin-^-D-galaktozidokat alkalmaznak, így például használják az 1-naftil-vegyületet (Histochemie, 35, 199 (1973)], a 6-bróm-2-naftil-származékot [J. Bioi. Chem., 195, 239 (1952)] vagya naftol-^-D-galaktozidot [ Histochemie, 37, 89 (1973)]. A láthatóvá tétel érdekében a keletkezett naftolokat különféle diazóniumsókkal reagáltatják és így azokat azoszínezékké alakítják át.

Az enzimaktivitások fluorogén szubsztrátummal végzett meghatározása széles körben elterjedt, mivel a fotometriás módszerekhez képest a fluoromét riás meghatározás gyakran egy-két nagyságrenddel nagyobb érzékenységet biztosít. Bizonyos esetekben feltétlenül fluorogén szubsztrát uniókat kell alkalmazni. Ez a helyzet pédlául az enzimatikus aktivitás sejtekben történő vizsgálatánál, melyet sejtdifferenciálás végett automatikus berendezésekben végeznek (citofluorometria), illetve az immobilizált enzimek úgynevezett átfolyásos mikrofluorometriás analízisénél. Más esetekben, így például kísérleti rendszerek enzimatikus megjelölésének meghatározásánál (enzimimmunoassay) az enzimatikus katalízis multiplikációs effektusát jelentősen meg lehet erősíteni a fluorogén szubsztrátumok alkalmazásával.

A β-D-galaktozidázhoz és másféle glikozidázokhoz eddig ismertté vált fluorogén szubsztrátumok fluorofor-része valamilyen fluoreszcein-, indoxil- vagy metil-umbelliferon-származék. Komplex rendszerek kinetikus analizálásánál azonban az említett vegyületeknek többféle, komoly hátrányuk van. A fluoreszcein diszubsztituált származékai többfokozatú reakciósorozat szerint hidrolizálódnak. A monoszubsztituált fluoreszcein-glikozidok már önmagukban fluoreszkálnak. Az indolszármazékok az enzimatikus hasítás után számos kémiai változáson esnek át, ami a kinetikus analízist ugyancsak komplikálja. A melil-ubelliferon-származékokat az UV-tartományban kell gerjeszteni és ennél a biológiai eredetű vagy szintetikusan előállított anyagok saját fluoreszcenciája zavarokat okozhat. Mindezeken túlmenően az ultraibolya fénynyel végzett gerjesztés — különösen lézeroptika alkalmazásával — eléggé költséges. A legtöbb fluorogén szubsztrátumból olyan reakciótermékek keletkeznek, amelyek csak mérsékelt oldhatósággal rendelkeznek. így ezek nem alkalmasak a különféle enzimaktivitások kinetikus analíziséhez, minthogy ehhez kifejezett követelmény, hogy a szubsztrátum és a termék oldhatósága jó legyen.

Mindezek miatt továbbra is szükség van az olyan szubsztrátumokra, melyekkel a különféle glikozidázokat egyszerűen, gyorsan és megbízhatóan meg lehet határozni, emellett az ilyen szubsztrátumoknak lehetőleg mind a fotometrikus, mind a fluorometrikus mérési eljárásokhoz alkalmasnak kell lenniök. A találmány célkitűzése az volt, hogy ezt a szükségletet kielégítse.

A fenti feladatot rezorufin-származékok új glikozidjaival oldottuk meg, amelyeket glikozidázok segítségével cukorrészre és rezorufinszármazékra lehet hasítani. Az utóbbiak vízben jól oldható vegyületek és a látható tartományban

HU 198734 Β jól mérhető adszorpcióval rendelkeznek, továbbá könnyen fluoreszcenciára gerjeszthetők.

A találmány tárgya tehát eljárás rezorufinszár mázé kok (la) vagy (lb) általános képletű glikozidjainak, amely képletben Glikozid jelentése monoszacharid vagy egy max. 10 aldohexóz vagy aldopentóz egységet tartalmazó oligoszacharid, és monoszacharid jelentése aldohexóz, aldopentóz vagy uronsav, előállítására, valamint eljárás — ezek alkalmazásával — glikozidázok és szacharid-láncokat hasító enzimek aktivitásának meghatározására és diagnosztikum ezen enzimek kimutatására.

Az (la), illetve az (lb) általános képletben

R¹ és R⁶ jelentése hidrogénatom-, -COOH csoport, 1 — 4 szénatomos alkilcsoporttal észterezett karboxilcsoport, -COO^éNH(C₂H5)₃ ^e képletű csoport vagy -COOC2H4OC2H4OC2H5 képletű csopot,

R³ és R⁴ jelentése hidrogénatom vagy karbonsav-morfolid, azzal a megkötéssel, hogy R¹ és R⁶, illetve R³ és R⁴ közül az egyik mindig hidrogénatom, és

Y jelentése nitrogénatom vagy ,N O képletű csoport és

Glikozid jelentése aldohexózból, aldopentózból vagy a megfelelő uronsavtól származó gyök.

A továbbiakban már (I) általános képletű vegyületeknek nevezett glikozidok új vegyületek.

Az (I) általános képletű vegyületek találmány szerinti előállítási módszere előnyösen abból áll, hogy az egymással tautomer (Ila) vagy (llb) általános képletű rezorufin-származé kokat, ahol R¹, R³, R⁴, R⁶ és Y jelentése a fentiekben megadott, egy, az előbbi Glikozid jelentésben meghatározott monoszachariddal vagy oligoszachariddal, illetve ezek l-halogénszármazékával, melyekben valamennyi hidroxilcsoport a szénhidrát-kémiában szokásosan alkalmazott bármilyen védőcsoporttal védett, per-O-szubsztituált glikozidokká alakítjuk át, majd ezekről a védőcsoportokat önmagában véve ismert módon lehasítjuk és így a rezorufin-származékok (I) általános képletű glikozidjaihoz jutunk.

A (II) általános képletű vegyületeket előnyösen valamilyen savmegkötő szer, mint például egy aikálifém-hidroxid vagy -karbonát jelenlétében, vizes acetonban, vagy fázistranszfer körülmények között víz és benzol vagy víz és kloroform keverékében reagáltatjuk a per-O-szubsztituált l-halogén-szacharidokkal.

Ezen túlmenően a fenti eljárást úgy is megvalósíthatjuk, hogy a (II) általános képletű rezorufin-származékokat előbb egy alkálifém-hidroxiddal vagy -alkoholáttal a megfelelő alkálifémsóvá, illetve adott esetben helyettesített aminokkal valamilyen ammóniumsóvá alakítjuk át, majd ezeket reagáltatjuk a per-O-szubsztituált l-halogénszacharidokkal, egy dipoláros aprotonos oldószerben, mint például acetonban, dimetil-szulfoxidban, diklór-metánban, tetrahidrofuránban vagy dimetil-formamidban.

A pcr-O-szubsztituált glikozidok (II) általános képletű rezorufinszármazékokból és a perO-szubsztituált 1-halogén-szacharidokból történő szintézisnél hozzá tétanyagként jól beváltak bizonyos ezüstsók vagy ezüstsókból álló keverékek (ezüst-oxid, ezüst-karbonát, celitre lecsapott ezüst-karbonát, ezüst-triflát, ezüst-szalicilát) és/vagy bizonyos higanysók vagy higanysókból álló keverékek (higany-bromid, higany-cianid, higany-acetát, higany-oxid), továbbá adott esetben szárítószereket, mint például kalcium-kloridot, molekulaszitát vagy drieritet alkalmazhatunk és a reakciót valamilyen oldószerben, így metiléndikloridban, kloroformban, benzolban, toluolban vagy dioxánban valósítjuk meg. Az α-kapcsolódású glikozidok szintézisénél a (II) általános képletű vegyületet célszerűen egy Lewis-sav, mint például ón(IV)-klorid, alumínium-klorid vagy előnyösen cink-klorid jelenlétében és olvadékban reagáltatjuk egy olyan szachariddal, melynek hidroxilcsoportjai valamilyen védőcsoporttal, különösen előnyös módon acetilcsoportokkal helyettesítve vannak [lásd: Chem. Bér., 66, 378 — 383 (1933); Methods in Carbohydr. Chem., 2, 345 — 347 (1967)]. A reakció-hőmérsékletet ebben az esetben 80 °C és 150 °C között, előnyösen 110 °C és 130 °C között választjuk meg.

A per-O-szubsztituált glikozidokról a védőcsoportokat a szénhidrátkémiában szokásosan használt módszerekkel hasítjuk le és ezáltal az (I) általános képletű glikozidokhoz jutunk. A módszereket például az Advances Carbohydrate Chem., 12, 157 (1975) irodalmi helyen ismertetik, így például az acilcsoport jellegű védőcsoportokat nátrium-metiláltal, bárium-metiláttal, vagy metanolos közegben ammóniával lehet lehasílani.

R¹ és R⁶ vonatkozásában a rövidszénláncú alkilcsoport meghatározás 1 — 4 szénatomot, előnyösen 1—3 szénatomot tartalmazhó csoportot jelent, emellett a metilcsoport egészen különös módon előnyös.

A szénhidrát-kémiában használatos védőcsoport főleg acetilcsoport, benzoilcsoport, benzilcsoport vagy trimetil-szilil-csoport lehet.

A (II) általános képletű rezorufin-származékokhoz kapcsolódó glikozilcsoportként [az (I) általános képletű glikozidok ezen kapcsolódás eredményeképpen jönnek létre] valamennyi aldohexóz, aldopentóz, a megfelelő uronsavak és

2—10 aldohexóz vagy aldopentóz egységből álló oligoszacharid lánc alkalmas, melyek a megfelelő glikozidázokkal a rezorufin-alapvázról ismét lehasíthatók. A találmány szerinti glikozidok közül példaképpen a /3-D-galaktopiranozidokat, az alfa-D-galaktopiranozidokat, a /?-D-glükopiranozidokat, az alfa-D-glükopiranozidol^at, valamint az alfa-D-mannopiranozidokat említjük meg. Glikozilcsoportként az olyan oligoszacharid-láncok is alkalmasak, melyek szacharidlánchasító enzimekkel monoszacharid-fokozatig, illetve oligoszacharid-fokozatig lebonthatók és amelyeket azután a megfelelő glikozidázokkal közvetlenül le lehet hasítani a rezorufin-alapvázról. Az ilyen oligoszacharid-láncok alatt a 2 —10, előnyösen a 2-7 aldohexóz vagy aldopentózegységből felépült láncokat kell érteni.

HU 198734 Β

A (Il’a) és a (Il’b) általános képletben R¹’, R³’, R⁴’ és R⁶’ jelentése a helyettesítők korábbi jelentésével azonos, de valamennyi helyettesítő nem jelenthet egyidejűleg hidrogénatomot, míg Y a korábbiakban megadott jelentésű.

Ezek a vegyületek alkalmasak arra, hogy a találmány szerinti (1) általános képletű rezorufinglikozidok előállításához ezeket köztitermékként használjuk.

A vegyületeket a továbbiakban (IP) általános képletű vegyületeknek nevezzük. Ezeket a már ismert rezorufin előállítására szolgáló eljárással analóg módon lehet előállítani [a rezorufin a (II) általános képletnek megfelelő azon vegyület, ahol az R¹, R³, R⁴ és R⁶ helyettesítők valamenynyiben hidrogénatomot képviselnek].

A (IP) általános képletű vegyületeket előnyös módon úgy állítjuk elő, hogy valamely (III) általános képletű, nitrozocsoporttal helyettesített rezorcin-származékot egy (IV) általános képletű rezorcin-származékkal — az említett általános képletekben R¹’, R³’, R⁴’, R⁶’ a fentiekben megadott jelentésű - barnakő és kénsav jelenlétében, alacsony hőmérsékleten reagáltatunk. Ilyenkor először olyan (IP) általános képletű vegyületeket kapunk, melyekben Y jelentése > N -+ O képletű csoport. Ezeket a vegyületeket ammónia jelenlétében cinkporral végzett reakcióval könynyen át lehel alakítani olyan (IP) általános képletű vegyületekké, ahol Y nitrogénatomot képvisel.

A (III) általános képletű és a (IV) általános képletű vegyületek reagáltatását rendszerint —10 ’C és 50 ’C közötti, előnyösen 0 ’C — 30 ’C közötti hőmérsékleten valósítjuk meg. A reakció különösen kíméletes körülmények között úgy megy végbe, ha a (III) és a (IV) általános képletű kiindulási vegyületeket kb. 0 ’C hőmérsékleten Összekeverjük és ezt követően a reakcióelegyet szobahőmérsékletre felmelegedni hagyjuk, emellett a barnakő mennyisége célszerűen 0,5— 5 mól/liter, előnyösen 1 — 2 mól/liter és a kénsav koncentrációja 0,5 — 5 mól/liter, előnyösen 1 — 3 mól/liter értékhatárok között van.

Az Y helyettesítőként > N —> O csoportot tartalmazó (IP) általános képletű vegyületeket előnyösen ammonalkalikus közegben cinkporral végzett redukcióval alakítjuk át Y helyén nitrogénatomot tartalmazó (IP) általános képletű vegyületekké [lásd: Nietzki és szerzőtársai, Bér. Dtsch. Chem. Ges., 22, 3020 (1889)]. Oldószerként célszerűen valamilyen alkohol és víz elegyét használjuk, előnyös az 1 rész vízből és 0 — 4 rész metanolból álló elegy. A redukálásra kerülő anyag 1 móljára számítva 1-20 mól, előnyösen 1 — 5 mól cinkport adunk részletekben a reakcióelegyhez, emellett annak hőmérsékletét — 10 “C és + 35 ’C, előnyösen + 5 ’C és +10 ’C között tartjuk. Szükséges, hogy a megadott hőmérséklet-határokat pontosan betartsuk, mert ezzel biztosítani lehel a reakció egyértelmű lefolyását. Hűtés alkalmazása nélkül ugyanis az exoterm reakció melléktermékeket is eredményez és ezek elválasztása meglehetősen nehéz.

A (III) és a (IV) általános képletű vegyületek közötti reakció a választott enyhe reakciókörülmények közölt egyértelműen megy végbe és jó kitermelést biztosít. A kiválasztott szintézisút különféle variációs lehetőségekre nyújt alkalmat, így számos szintézisút nyílik meg, különösen az aszimmetrikusan helyettesített rezorufinszármazékok, illetve az ugyancsak aszimmetrikusan helyettesített rezazurinszármazékok előállítása vonatkozásában.

Azokat a (IP) általános képletű rezorufinszármazékokat, melyekben R⁶ rövidszénláncú alkoxi-karbonil-csoportot, adott esetben valamilyen -COO-ÍCHjCHjOjj-R⁷ általános képletű csoportot képvisel, előnyösen egy (V) általános képletű triacílezett dihidrorezorufin-származékon keresztül állíthatjuk elő. Az (V) általános képletben

R¹ és R⁵ jelentése az előbbiekben megadott,

R⁴” és R⁶” jelentése karboxilcsoport és

R⁷” jelentése hidrogénatom vagy rövidszénláncú alkilcsoport.

A karbonsav-funkciókat a szakirodalomból ismert módszerekkel, mint oxalil-kloriddal dimetil-formamidban vagy kén-diklorid-oxiddal (tionil-kloriddal) ugyancsak dimetil-formamidban végzett reakció útján átalakítjuk savkloriddá, amiből azután egy tetszőleges alkohollal végzett reagáltatással megkapjuk a megfelelő helyettesített karbonsav-észter-származékokat.

A megfelelő (II) általános képletű rezorufinszármazékot úgy kapjuk meg, hogy a fentiek szerint előállított (V) általános képletű acilezett vegyületet valamilyen lúggal, előnyösen 0,1 — 5 mólos nátrium-hidroxid- vagy kálium-hidroxid-oldattal, vagy pedig 1-15 mólos vizes ammóniaoldattal és egy oxidálószerrel — ami előnyösen kálium-[hexaciano-ferrát(III)] - kezeljük, valamilyen vízoldható szerves oldószer, mint például

1,4-dioxán vagy metanol hozzátétele mellett.

Alkoholkomponensként elvileg minden lehetséges alkohol megfelel, de különösen előnyös a dietilénglikol-monoetil-éter, a trietilénglikolmonoetil-éter, illetve az egyszerű alkoholok, mint a metanol vagy etanol. Aminkomponensként is bármelyik lehetséges amin választható. Különösen előnyösek azonban a poláris csoporttal rendelkező aminok, így például a morfolin, a metoxi-etil-amin, a glicin-amid, továbbá az ammónia, valamint a primer vagy a szekunder rövidszénláncú alkil-aminok. Alkalmazhatunk még olyan amino-karbonsavakat is, melyek karboxilfunkciója a szokásos módon védett, így felhasználhatunk például glicin-terc-butil-észtert, glicin-benzil-észtert vagy N^a-BOC-lizin-metil-észtert. A védőcsoportok lehasítása után így (II) általános képletű rezorufinokat, illetőleg alifás karbonsav-funkcióval rendelkező (I) általános képletű rezorufin-glikozidokal kapunk.

Az (V) általános képletű acetilezett dihidrorezorufmokal a megfelelő rezorufinból vagy rezazurinból lehet előállítani valamilyen erős redukálószerrel, mint ón(II)-kloriddal vagy króm(Il)-acetáttal végzett redukálással, vagy pedig elektrokémiai redukcióval, ami után acetilezési

HU 198734 Β műveletet végzünk. Redukálás céljából a rezorufint vagy a rezazurint 10 perctől 1 óráig terjedő időn át 2-10 ekvivalens - előnyösen 2-6 ekvivalens — ón(II)-kloriddal melegítjük 5-25%-os vizes sósavoldatban. A dihidrovegyület lehűléskor kiválik. Az acetilezést a szokásos módon ecetsavanhidriddel valósítjuk meg. Az (V) általános képletű vegyületeket előnyösen úgynevezett egyedényes eljárással megvalósított reduktív acetilezéssel állítjuk elő. A megfelelő rezorufmt vagy rezazurint 2 — 6 ekvivalens mennyiségű ón(Il)-kloriddal 5 perc-5 óra — előnyösen 10 perc — 3 óra — hosszait ecetsavanhidridben forraljuk visszafolyatás közben, de úgy is eljárhatunk, hogy a reakcióelegyet szobahőmérsékleten

4—16 órán át keverjük.

A (II) általános képletű rezorufin-származékok glikozidjainak szintézise során nemfluoreszkáló vegyületek keletkeznek, melyekből a megfelelő glikozidázokkal végzett enzimatikus hasítással a fluoreszkáló rezorufin-származékok ismét felszabadíthatok. A találmány szerinti fluorogén rezorufinszármazékok az eddig ismert glikozidokhoz képest másfajta kromogén, illetve fluorogén csoportokat tartalmaznak és igen előnyös tulajdonságokkal rendelkeznek, fgy a monoszubsztituált származékok az enzimatikus hidrolízis során olyan kinetikát mutatnak, amely igen egyszerűen leírható a Michaelis-Merten-összefüggés segítségével. A rezorufin-/?-D-galaklopiranozid például K_M = 0,38 mmól/liter Michaeliskonstans értéket ad. Ezen hidrolízis gátlása a természetes szubsztrátum laktózzal kompetitív jellegű, fgy a rezorufin-származékok glikozidjainak specifikus átalakulását bizonyos vizsgálatok számára természetes glikozidok - a /?-D-galaktozidáz esetében laktóz — hozzáadásával definiálni és reverzibilisen módosítani lehet.

A rezorufin-származékok találmány szerinti glikozidjai vizes oldalban + 4 °C hőmérsékleten gyakorlatilag korlátlan ideig eltarthatok. A rezorufin-alapváz glikozidjainak oldhatósága a legtöbb kinetikus vizsgálat céljaira már elegendő, a megfelelő glikozid oldhatóságát azonban lényegesen javítani lehet karbonsav-észter-csoport, poláris csoportokkal rendelkező karbonsav-származékok, illetőleg szulfonsav-csoportok bevitelével.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek gerjesztése és emissziója a látható spektrumtartományban van és a kvantumkihasználás kielégítő. A rezorufin maximális fluoreszcenciaintenzitását pH = 7,0 érték felett érjük el és alacsonyabb pH-érték esetén ez csak lassan csökken. Vizes oldatban a rezorufin-glikozidok legtöbbször sárga színűek (A_max kb. 470 nm-nél). Az enzimatikus reakció után kapott termékek színe többnyire vörös (A_max kb. 570 nm-nél), úgy hogy az anyagok fotometriás meghatározásokhoz és műszerek alkalmazása nélküli vizuális eljárásokhoz is kiválóan alkalmasak.

A találmány további tárgya a rezorufin-származékok (I) általános képletű új glikozidjainak alkalmazása a megfelelő glikozidázok, mint például az α-D- és a /9-D-gabktozidáz, az α-D- és a /J-D-glükozidáz, valamint az a-D-mannozidáz aktivitásának meghatározásához.

Azokat az (I) általános képletű rezorufinszármazékokat, melyekben a glikozidcsoport egy oligoszacharid-lánc, még a szacharidláncot hasítani képes enzimek kimutatására is igen előnyösen alkalmazhatjuk. Ennek során a vizsgálandó enzim karakterisztikusan hasítja az olígoszacharid-láncot, amit előnyösen a monoszacharid-fokozatig történő hasítást jelent. Szükséges esetben további segédenzimeket is alkalmazhatunk. A monoszacharid-fokozatig lebontott glikozidot azután az előbbiekben leírt módon a megfelelő glikozidázzal - pl. alfa és/vagy béta-glikozidázzal — rezorufin-alapvázra és monoszacharidra hasítjuk.

A találmány tárgyához tartoznak továbbá a glikozidázok aktivitásának meghatározására szolgáló diagnosztikai készítmények, melyek valamilyen (1) általános képletű új rezorufinglikozidol tartalmaznak. A rezorufin-származékok (I) általános képletű glikozidjainak alkalmazása glikozidázok szubsztrátumaként azt eredményezi, hogy a vizsgálati rendszer az eddigi ismeretekhez képest jelentős mértékben érzékenyebbé válik. Az új szubsztrátumokat glikozidázok aktivitásának meghatározására igen előnyösen alkalmazhatjuk mind a biokémia és a biotechnológia, mind a klinikai kémia szakterületein. A nagyobb érzékenység az alább felsorolt előnyöket biztosítja:

a) alacsonyabb enzimaktivitások is meghatározhatók,

b) kisebb mintamennyiséget alkalmazhatunk,

c) az aktivitás meghatározását lényegesen rövidebb idő alatt el lehet végezni,

d) a kisebb mintamennyiség és a kedvező mérési hullámhossz folytán csökken a módszernek a próbában levő többi anyag által okozott zavarokra való hajlama,

e) hordozómátrixokban levő immobilizált enzimek aktivitását is meg lehet határozni.

Kimutattuk, hogy a találmány egyik tárgyát képező szubsztrátumok bármilyen eredetű glikozidázok aktivitásának meghatározására alkalmasak. A találmány szerinti diagnosztikai készítmények, melyek valamilyen (I) általános képletű szubsztrátumot tartalmaznak, kifejezetten érzékenyebben reagálnak, mint az ilyen célra eddig ismert készítmények.

A rezorufin-származékok (I) általános képletű új glikozidjai olyan immunológiai meghatározásokra szolgáló módszerekhez is alkalmasak, melyeknél a glikozidázokat indikátorenzimként használják és az aktivitást az immunológiai reakció lefolytatása után kell meghatározni. Az ilyen enzimatikus indikálással végzett immunológiai meghatározási módszerek a szakemberek előtt enzimimmunoassay elnevezéssel ismertek. Ezek a módszerek a 10'⁵ —10'¹² mól/liter tartományon belül proteinek, poliszacharídok, hormonok, gyógyszerhatóanyagok és másféle alacsony molekulatömegű anyagok koncentrációjának meghatározására szolgálnak. A fáziselválasztó lépésekkel szembeni követelmények sze-51

HU 198734 Β rint homogén és heterogén mérési elrendezést, egy további csoportosítás alapján pedig kompetitív és nem kompetitfv kísérleti alapelvet lehet megkülönböztetni.

Valamennyi mérési alapelv szerint azonban vagy enzim-antigén, vagy enzim-antitest konjugálumokkal dolgozunk. Az enzimatikus indikátorreakció az összes enzim immunoassay-módszer esetén közös. Ilyen célra alkalmas enzimek (indikátorenzimek) például a glikozidázok, különösen alkalmas a /í-D-galaktozidáz. Az ilyen enzimimmunoassay méréseknél a glikozidázokat a szokásos módszerrel határozzuk meg, amenynyiben egy alkalmas szubsztrátumot adunk hozzá, amelyet az enzimatikus hasítást követően ismert módon folometrikus vagy fluorometrikus módszerrel mérünk.

Az ilyen enzimimmunoassay meghatározásoknál a glikozidáz-tesztrendszer tökéletesítése ugyancsak jelentős előnyöket eredményez. így

1. a nagyobb érzékenység folytán itt is lehetséges a kimutatás határértékének további csökkentése, a rövidebb reakcióidő és a szükséges próbamennyiség csökkentése, ezáltal a próba többi komponense állal okozott zavarok is mérsékelhetők;

2. a kedvezőbb mérési hullámhossz bizonyos reakciófeltételek fennforgása esetén csökkenti a módszer zavarok iránti hajlamát, amit az oldhatatlan komponensek, például a rendszer zavarosodása okoz.

A diagnosztikai készítmény egy vagy több találmány szerinti (1) általános képletű szubsztrátumot, emellett valamilyen alkalmas pufferrendszert, adott esetben további alkalmas hozzátétanyagokat, mint például nedvesítőszereket, stabilizátorokat stb. tartalmaz. Ezek a hozzátétanyagok egyébként az ilyen jellegű diagnosztikai készítményeknél szokásosan használt anyagok lehelnek. A diagnosztikai készítmény kiszerelési formája lehet oldat, liofilizátum, porkeverék vagy reagenstabletta, illetve az valamilyen szívóképes hordozóanyagra felvitt készítmény alakjában is előfordulhat.

Amennyiben a találmány szerinti diagnosztikai készítmény oldat formájában van, úgy az oldat előnyösen a mérés lefolytatásához szükséges összes reagenst tartalmazza. Oldószerként a víz, vagy víz és egy vízoldható szerves oldószer — mint például metanol, etanol, aceton és dimetil-formamid - elegye jön tekintetbe. Az eltarthatóság szempontjából előnyös lehet, ha a méréshez szükséges reagensekből két vagy több oldatot készítünk és ezeket csak közvetlenül és tényleges vizsgálat előtt keverjük össze egymással.

Liofilizátum formájában levő diagnosztikai készítmény előállítására az oldatot fagyasztva szárítjuk. Az oldat a meghatározáshoz szükséges összes reagensek mellett még szokásosan használt vázképzőket, így például poli(vinil-pirrotidon)-t és esetleg további töltőanyagokat, mint például mannitot, szorbitot vagy xilitet tartalmaz. A liofilizált készítmény összes tömege 5-20 mg, előnyösen 10 mg.

A porkeverék vagy reagenstabletta formájában levő diagnosztikai készítményeket úgy állíthatjuk elő, hogy a teszthez szükséges anyagokat a galenikus készítményekhez szokásosan használt hozzátétanyagokkal Összekeverjük és granuláljuk. Az ilyen jellegű hozzátétanyagok például cukoralkoholok, így mannit, szorbit vagy xilit, illetve egyéb oldható inért vegyületek, így polietilénglikolok vagy poli(vinil-pirrolídon) lehetnek. A porkeverékek és a reagenstabletták végső tömege általában kb. 30-200 mg, előnyösen 50— 80 mg között van.

Tesztcsík alakjában levő diagnosztikai készítmény előállítása céljából valamilyen szívóképes hordozót, így szűrőpapírt, cellulózt vagy gyapjú típusú műszálat impregnálunk egy oldattal, amely tartalmazza a szükséges és tesztcsíkok előállításához szokásosan használt reagenseket, valamilyen illékony oldószerben, mint például vízben, metanolban, etanolban vagy acetonban oldva. Ez egyetlen impregnálási lépésben is történhet, de gyakran az bizonyult célszerűnek, ha az impregnálást több lépésben valósítjuk meg és ennek során olyan oldatokat használunk, melyek a diagnosztikai készítményhez szükséges anyagoknak csak egy bizonyos részét tartalmazzák. így például az első lépésben a puferanyagokat és a többi vízoldható hozzátétanyagokat tartalmazó vizes oldattal impregnáljuk a hordozót és ezt követően egy második lépésben végezzük a glikozidáz-szubsztrátum-oldattal történő impregnálást. A kész tesztcsíkokat vagy ebben a formában használjuk, vagy önmagában véve ismert módon valamilyen nyélre ragasztjuk fel őket, vagy előnyösen a DBP 2,118,455. számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás szerint egy műanyaglap és egy kisnyílású háló között rögzítjük.

Az alábbiakban következő példák bemutatnak néhány eljárásváltozatot a találmány szerinti vegyületek előállítására szolgáló sokféle lehetséges eljárás közül és példa jelleggel bemutatják a rezorufinszármazékok új glikozidjainak alkalmazását is, glikozidázok és szacharid-láncokat hasító enzimek aktivitásának meghatározására, illetve kimutatására.

Ezek a példák azonban semmiféle formában sem korlátozzák a találmány oltalmi körét.

1. példa

Rezorufin-fl-D-galaktopiranozid

a) Rezorufin előállítása

A rezorufint a rezazurin nevű oxidációs termékéből kiindulva állítjuk elő, melyet kellően tiszta minőségben be lehet szerezni a kereskedelemben. Az előállítást a Nietzki és szerzőtársai (Bér. Dtscb, Chem. Ges., 22, (1889) 3020 - 3028. oldal] által leírtak szerint végezzük. Úgy járunk el, hogy 10 g (43 mmól) rezazurint [Fluka, Buchs, Svájc] egy hengerpohárban 50 ml 25%-os ammónia-oldattal, 25 ml 37%-os nátrium-hidrogén-szulfit-oldattal és 50 ml vízzel 30 percig for-61

HU 198734 Β lunk. Ilyen rendszerben az alábbi Rf értékeket ró vízfürdőn melegítünk. Ezután további 20 ml fenti ammóníaoldatot, 7 ml fenti hidrogén-szulfit-oldatot és 20 ml vizet adunk hozá és a reakcióelegyet további 30 percen át melegítjük, Az átalakulást az elegy színváltozásával (kékből vörös lesz), vagy vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálattal követjük. A reakció teljes végbemenése után az elegyhez 10 ml 32%-os sósavoldatot adunk pH = 5 érték éeléréséig. Ezután a reakcióoldatot egy napig hűtőszekrényben állni hagyjuk. Ezt követően a barnás színű csapadékot leszívatjuk, 4 pH-jú jéghideg sósavoldattal mossuk és 110 ’C hőmérsékleten megszárítjuk. A kitermelés 7,8 g (36,7 mmól), ami az elméleti kitermelés 85%-ának felel meg.

b) A rezorufin glikozidálása rezorufin-/J-D-galaktopiranoziddá

A fenolos hidroxilcsoportokon végzett glikozidálásl a tetraacetát közbenső fokozaton keresztül az alábbiakban leírt eljárással valósítjuk meg: 2,13 g (10 mmól) finoman porított rezorufint, 4,12 g (10 mmól) acetobromo-a-D-galaktózt (Sigma, München), 1,16 g (5 mmól) ezüst(l)-oxidot (Fluka, Buchs, Svájc), 5 g kalciumszulfátot (CaSO₄ . 1/2H₂O; Drierit), néhány szemcse jódot és 50 μΐ kinő,int 50 ml melilén-dikloridban szobahőmérsékleten 40 óra hosszat keverünk. A rezorufin 40%-a átalakul rezorufin•/?-D-galaktopiranozid-tetraacetáttá. Ennek a reakciónak az ellenőrzését is vékonyréteg-kromatográfiás eljárással végezzük. A szilárd alkatrészeket redős szűrőpapír segítségével, majd centrifugálással elválasztjuk, ezután a metiléndikloridot forgó bepárlóberendezésben eltávolítjuk. A rezorufin-/3-D-galaktopiranozid-tetraacetát barnássárga szirup formájában marad vissza. A kitermelés kb. 2 g, ami az elméleti kitermelés 36%-a.

A 2 g rezorufin-/J-D-gaIaktopiranozid-tetraacetátot minden további tisztítás nélkül 80 ml vízmentes metanollal felvesszük. Kis darabokban levő 0,5 g nátriumsót külső jeges hűtés közben feloldunk 20 ml vízmentes metanolban. Ezután keverés és külső jeges hűtés közben 6 —8 ml fenti metoxidoldatol 1 ml-es részletekben 30 perc leforgása alatt hozzáadunk a rezorufin-/J-D-galaktopiranozid-tetraacetát-oldathoz és a dezacetilezésl vékonyréteg-kromatográfiás eljárással követjük. A kivált, narancsszínű rezorufin-/J-Dgalaklopiranozidot leszivatjuk és kevés jéghideg metanollal mossuk. Körülbelül 1 g nyers terméket kapunk, ami az elméleti kitermelés 70%ának felel meg. Ezt a nyers terméket metanolból átkristályosítjuk, majd 60 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten szárítjuk. Ilyen módon 0,2 g tiszta terméket kapunk.

A reakció lefolyásának ellenőrzésére szolgáló összes vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatot Kieselgel 60 (Merck, Darmstadt) szilikagéllemezen végezzük és ennek során futtatószerként metilén-diklorid —metanol (9:1) elegyet hasznákapjuk:

Rezorufin 0,40;

Rezazurin 0,35;

Rezorufin-/?-D-galakiopiranozid-tetraacetát 0,90;

Rtzorufin-/?-D-galaktopiranozid 0,10.

A rezorufin-/?-D-galaktopiranozid néhány fizikaijellemzője:

‘H-NMR (DMSO-d₆): 3,4-3,8 (m, 6H);

4,5, 4,65, 4,85 és 5,2 (mindegyik széles váll, 4H); 5,04 (d, J = 7,8Hz, IH); 6,25 (d, J = 2Hz, IH); 6,75 (dd, J = 10 és 2Hz, IH); 7,1 (m, 2H); 7,48 (d, J = 10Hz, IH); 7,73 ppm (d, J = 10Hz, IH).

UV/V1S (0,1 mólos kálium-foszfát-puffer, pH 7,55): A_max = 469 nm.

2. példa

Rezorufin-/»-D-glükozid

2,13 g (10 mmól) rezorufint (előállítását lásd az 1. példa a) pontjában), 4,11 g (10 mmól) acetobromo-a-D-glükózt és 3,64 g (10 mmól) hexadecil-trimelil-ammónium-bromidot 4 órán keresztül 11,5 ml 1 n nátrium-hidroxid-oldat és 50 ml kloroform keverékében, visszafolyatás közben forralunk. Ezután az elegyet szárazra pároljuk, majd etil-acetáttal eldörzsöljük. Az etil-acetátos oldatot újból szárazra bepároljuk, majd a kapott maradékot 20 ml etanollal felvesszük. Ebből az oldatból kiválik a tetraacetil-rezorufm-/?-D-glükozid, melyet aktív szén hozzátétele mellett metanolból átkristályosítunk.

Dezacetilezés céljából az anyagot 10 ml metanollal felvesszük és szobahőmérsékleten végzett 2 órás keverés után a kivált terméket leszivatjuk, majd megszárítjuk. A kitermelés 50 mg.

Ή-NMR (DMSO-d₆): 6 = 3,15-3,80 (m, 6H); 4,5-6,5 (széles, 4H); 5,12 (d, J = 6,9Hz, IH); 6,29 (d, J = 2,0Hz, IH); 6,80 (dd, J = 9,6 és 2,0 Hz, IH); 7,12 (dd, H = 8,5 és 2,0Hz, IH); 7,16 (d, J = 2,0Hz, IH), 7,55 (d, J = 9,6Hz, IH);

7,80 (d, J=8,5Hz, IH).

3. példa

Rezorufin-l-karbonsav-metil-észter g nitrozo-rezorcint, 53,3 g 3,5-dihidroxi-benzoesav-metil-észtert és 28,0 g mangán-dioxidot (barnakő) 500 ml metanolban oldunk, illetve szuszpendálunk. Ehhez jeges hűtés és keverés közben, 5-10 ’C hőmérsékleten hozzácsepegtetünk 34,4 ml tömény kénsavat. A hűtőfürdő eltávolítása után az elegyet még két órán keresztül tovább keverjük. Ezután hűtés közben 200 ml vizes ammóniaoldatot adunk az elegyhez. A kivált csapadékot üvegszálas szűrőn végzett szűréssel kiszűrjük. A szürlethez 5 —10 ’C hőmérsékleten részletekben 10 g cinkport adagolunk, majd a reakcióelegyet szobahőmérsékleten addig keverjük, amíg a redukció teljesen végbemegy (vékonyréteg-kromatográfiás ellenőrzés, futtatószer: etil-acetát — metanol (4:1) elegy, a reakció-71

HU 198734 Β idő kb. 1,5 óra). Ezután a reakcióelegyet 25 ’C hőmérsékletű fürdővel melegítve forgó bepárlóberendezésben térfogatának 1/3 részére bepároljuk, majd hűtés közben tömény sósavval színátváltás bekövetkeztéig megsavanyítjuk az elegyet, melynek hatására a kivánt termék kiválik. Ezt híg sósavval mossuk, majd vákuumban kalciumklorid felett szárítjuk és így rezorufin-l-karbonsav-metil-észtert kapunk. A kitermelés 30,9 g, ami az elméletire számított kitermelés 36%ának felel meg.

’H-NMR (DMSO-d₆): 5= 3,98 (s, 3H); 6,47 (d, J = 2,2Hz, IH); 6,85-6,95 (m, 2H); 7,09 (d, J =2,2Hz, IH); 7,60 (d, J =9,6Hz, IH).

Fluoreszcencia: abszorbció: A_max = 570 nm, emisszió: A_max = 588 nm.

Analóg módon állítjuk elő

a) 3,5-dihidroxi-benzoesavból és nitrozo-rezorcinból rezazurin-l-karbonsavon keresztül a rezorufin-1-karbonsavat. UV/VIS (0,1 mólos kálium-foszfát-puffer, pH = 7,5): A_max = 569 nm;

b) 4-0-metil-galluszsav-metilészterből és nitrozo-rezorcinból 4-meloxi-rezazurin-l-karbonsav-metil-észteren keresztül a 4-metoxirezorufin-1 -karbonsav-metil-észtert, UV/VIS (0,1 mólos kálium-foszfát-puffer, pH= 7,5): A_max = 592 nm;

c) 3,5-dihidroxi-benzoesav-metil-észterbőI és

4-klór-6-nitrozo-rezorcinból 8-klór-rezazurin-l-karbonsav-metil-észteren keresztül a 8-klór-rezorufin-l-karbonsav-metil-észtert;

d) 4-0-metil-galluszsav-metil-észterből és 4-bróm-6-nilrozo-rezorcinból 8-br6m-4-metoxi-rezazurin-l-karbonsav-metil-észteren keresztül a 8-bróm-4-metoxi-rezorufin-l-karbonsav-metilésztert,

e) 5-nitro-rezorcinból és nitrozo-rezorcinból 1-nitro-rezazurinon keresztül az 1-nitro-rezorufint; valamint

f) rezorcin-5-szulfonsavbóI és nitrozo-rezorcinból rezazurin-l-szulfonsavon keresztül a rezorufin-l-szulfonsayat.

4. példa

Rezazurin-4-karbonsav

1,60 g (10,5 mmól) nitrozo-rezorcint, 1,55 g (10,0 mmól) 2,6-dihidroxi-benzoesavat és 0,86 g (10 mmól) mangán-dioxidot felveszünk 20 ml metanolba. A keveréket 0 ’C hőmérsékletre lehűljük, majd keverés közén 1,06 ml tömény kénsavat csepegtetünk hozzá. A reakcióelegyet még 2 órán át hűtés ndkül tovább keverjük. A kivált vörös színű terméket szűréssel elkülönítjük, metanollal mossuk és szárítjuk. A kitermelés 2,3 g, ami az elméleti kitermelés 85%-ának felel meg.

UV/VIS (0,1 mólos kálium-foszfát-puffer, pH- 7,5): A_max = 614 nm (t - 48 cm² mól'¹)· megsavanyítás után A_max- 522 nm («« 32 cm²mól¹).

5. példa

Re zorufin-4-karbonsav

A 4. példa szerint előállított rezazurin-4-karbonsavból 2,3 g-ot feloldunk 20 ml víz és 5 ml

25%-os ammóniaoldat elegyében. A kék színű oldalhoz jeges hűtés közben 5 g cinkport adagolunk. Ezután a jeges hűtőfürdőt eltávolítjuk és így az oldat lassan szobahőmérsékletre melegszik fel. A redukció lefolyását könnyen követhetjük a színváltozás megfigyelésével (kékből sötétibolya színű lesz), illetve vékonyréteg-kromatográfiával [futtatószer: metanol-etil-acetát (1:1) elegyJ.A felesleges cinkport kiszűrjük és a reakcióoldatot 5 ml ecetsav-tömény sósav eleggyel megsavanyítjuk. A kicsapódott terméket kiszűrjük, híg sósavval mossuk és vákuumban, kalciumklorid felett szárítjuk. A kitermelés 1,8 g, ami az elméleti kitermelés 82%-a.

UV/VIS (0,1 mólos kálium-foszfát-puffer, pH = 7,5): >_max = 579,4 nm (e = 48,6 cm² mól'¹); megsavanyítás után: A_max = 485,9 nm (e = 34,7 cm² mól¹).

Fluoreszcencia: Abszorpció: A_max = 579 nm, Emisszió: A_max = 593 nm.

6. példa l-Metil-rezorufin-4-karbonsav

A 4. példában leírtakkal analóg módon 840 mg 2,6-dihidroxi-4-metil-benzoesavat, 760 mg nitrozo-rezorcint, 430 mg mangán-dioxidot és 0,53 ml kénsavat reagáltatunk és így 0,8 g 1-metil-rezazurin-4-karbonsavat kapunk. Az 1-metilrezazurin-4-karbonsaval azután az 5. példában leírtakkal analóg módon l-metil-rezorufin-4karbonsawá redukáljuk. A kitermelés: 0,4 g.

UV/VIS (0,1 mólos kálium-foszfát-puffer, pH = 7,5): A _max =571 nm.

7. példa

Rezorufin-4-karbonsav-morfolid

1) N,O,O-triacetil-dihidrorezorufin-4-karbonsav

a) változat g (19,4 mmól) rezorufin-4-karbonsavat vagy

5,3 g (19,4 mmól) rezazurin-4-kabonsavat 100 ml 10%-os sósavban 7 g (38 mmól) ón(II)-kloriddal 0,5 óra hosszat visszafolyatás közben forralunk, miközben az oldat zöldre elszíneződik. Ezután hagyjuk az oldatot lehűlni, majd a kivált dihidrorezorufin-4-karbonsavat nitrogén alatt kiszűrjük és ezt vákuumban difoszfor-pentaoxid felett szárítjuk. Az így kapott nyers terméket 30 percig 20 mg nátrium-acetátot tartalmazó 30 tnl ecetsavanhidridben visszafolyatás közben forraljuk. Ezt követően a reakcióelegyet 200 ml jeges vízre öntjük és 14 óra hosszat keverjük. A csapadékot etanol-víz elegyből átkristályosítjuk. így a kívánt vegyületből 4,8 g-ot kapunk, ami 65%-os kitermelésnek felel meg.

Olvadáspont: 197 - 199 C.

Vékonyréteg-kromatográfia [szilikagél, futtatószer: kloroform—metanol —ecetsav (9:1:0,1)], Rf= 0,33.

b) változat

5,1 g (20 mmól) rezorufin-4-karbonsavat 20 ml ecetsavanhidridben 11 g (60 mmól) ón(II)kloriddal 1 óra hosszat 80 ’C hőmérsékleten ke-8HU 198734 Β verünk. Az elegyet ezután 230 ml jeges vízre öntjük, egy óráig keverjük, majd szűrjük és az anyagot az a) változattal analóg módon feldolgozzuk. A kitermelés 5,4 g, ami 71%-nak felel meg.

2) N,O,O-Triacetíl-dihidrorezorufin-4-karbonsav-klorid

3,85 g (10 mmól) Ν,Ο,Ο-triacetil-dihidrorezorufin-4-karbonsavhoz 5,4 ml (60 mmól) oxalilkloridot adunk és az elegyet —10 °C hőmérsékletre lehűtjük. Ehhez egy csepp dimetii-formamidot adunk és a reakcióelegyet keverés közben hagyjuk szobahőmérsékletre felmelegedni, miközben az eduktum gázfejlődés közben feloldódik. A gázfejlődés befejeződése után az elegyet még 0,5 óra hosszat keverjük, majd bepároljuk. Ezután a maradékot három ízben, alkalmanként 20 — 20 ml vízmentes metilén-dikloriddal felvesszük és szárazra pároljuk. Ilyen módon 4 g nyers terméket kapunk és ezt minden további tisztítás nélkül tovább feldolgozzuk.

Vékonyréteg-kromatográfia [szilikagél, futtatószer: kloroform —metanol—ecetsav (9:1:0,1)). R_f = 0,42; színtelen folt, amely néhány óra múlva vörösre színeződik.

3) N,O,O-Triacetil-dihidrorezorufin-4-karbonsav-raorfolid

11,3 g (31,4 mmól) nyers savkloridot feloldunk 150 ml vízmentes metilén-dikloridban. Ehhez hozzácsepegtetünk előbb 8,7 ml (63 mmól) trietil-amint és ezt követően 3,3 ml (37,7 mmól) morfolint. Az elegyet további 2 órán át keverjük, majd az oldatot 1%-os citromsavoldattal, nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és vízzel mossuk, ezután a szerves fázist magnézium-szulfát felett szárítjuk, végül bepároljuk. A maradékot etanolon kristályosítjuk. Kitermelés: 8,1 g (ez 63%nak felel meg), a vegyület olvadáspontja: 133-135 °C (bomlás).

4) Rezorufin-4-karbonsav-morfolid

3,7 g (9 mmól) triacetil-dihidrorezorufin-4-karbonsav-morfolidot felveszünk 250 ml metanol és 250 ml víz elegyébe. Ehhez 36 ml 1 n nátrium-hidroxid-oldatot és 6,0 g (18 mmól) kálium-[hexaciano-ferrát(III)]-at adunk és az elegyet 14 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezt követően az elegyet sósavval pH - 3 értékűre megsavanyítjuk, majd szárazra pároljuk és a maradékot acetonnal eldörzsöljük. A színezékanyag-oldatot 511 ml szilikagélen keresztül aceton futtatószerrel szűrjük. A színezéktartalmú eluátum bepárlása után 2,3 g (80%) terméket kapunk. UV/VIS (0,1 mólos kálium-foszfát-puffer, pH- 7,5): A_max- 575 nm, <- 55,000 cm²mól'*.

Vékonyréteg-kromatográfia (futtatószer: lásd a 2. pontban), R_f- 0,52.

^lH-NMR (DMSO-d₆): ¢- 3,3-3,8 (m, 8H),

6,50 (d, J-2Hz, IH), 6,64 (d, J-lOHz, IH);

6,76 (dd, J -10 és 2Hz, ÍH); 7,44 és 7,51 (mindegyik d, J - 10Hz, 2H).

8. példa

Tetraacetil-rezorufin-l-karbonsav-metil-észter-ff-D-galaktopiranozid és tetraacetil-rezorufin-9-karbonsav-metilészter¹ ff-D-galaktopiranozid

6,8 g rezorufin-l-karbonsav-metil-észtert (melyet a 3. példa szerint állítottunk elő), 5,75 g ezüst (I)-oxidot, 6,75 g ezüst-karbonátot, 15 g molekulaszitát (0,4 nm) és 10 g a-bróm-tetraacetil-galaktózt 250 ml abszolút kloroformban 4 órán át szobahőmérsékleten keverünk. Ezután az elegyhez további 5 g a-bróm-tetraacetil-galaktózt adunk és egy éjjelen át tovább keverjük. Ezt követően a reakcióelegyet üvegszálas szűrőn keresztül szűrjük, majd bepároljuk. Az olajos nyers terméket 2 liter szilikagélen, kloTOform — etil-acetát (2:1) eluálószerrel kiomatografáljuk. 2,5 g sárga színű frakciót eluálunk, melynek Rf értéke 0,28 [magas nyomáson végzett vékonyréteg-kromatográfia (HPTLC) szilikagélen, a fenti futtatószerrel]. Metanollal végzett keverés révén narancsszínű kristályok formájában tetraacetil-rezorufin-9-karbonsav-metilészter-/?-D-galaktopiranozidot kapunk. A kitermelés: 1,5 g.

¹ H-NMR (DMSO-d₆): 6 = 1,95, 2,03, 2,04 és

2,14 (mindegyik s, 12H); 3,88 (s, 3H); 4,11 (d, J = 7Hz, 2H); 4,51 (t, J=7Hz, 2H); 5,24 (m, 2H); 5,36 (m, ÍH); 5,69 (m, IH); 6,31 (d, J = 2Hz, IH); 6,97 (d, J = 2Hz, IH); 7,04 (dd, J = 8,8 és 2,4Hz, IH), 7,14 (d, J = 2,4Hz, IH);

7,78 (dd, J = 8,8Hz, IH).

Ezután egy ugyancsak sárga színű frakciót eluálunk, melynek tömege 1,6 g és az R_f értéke 0,24. Ebből metanollal végzett kristályosítással narancssárga színű kristályok formájában megkapjuk a tetraacetil-rezorufin-l-karbonsav-metil-észter-ff- D-galaktopiranozidot. A kitermelés: l,2g’H-NMR (DMSO-d₆): 6= 1,95, 2,04 és 2,14 (mindegyik s, 12H); 3,90 (s, 3H); 4,09 (m, 2H);

4,51 (m, IH); 5,24 (d, J=7Hz, IH); 5,25 (m, IH); 5,36 (m, IH); 5,71 (m, IH); 6,50 (d, J =2Hz, IH); 6,83 (dd, J = 10 és 2Hz, IH); 7,20 és 7,24 (mindegyik d, J = 2Hz, 2H); 7,47 (d, J = 10Hz, IH).

A tiszta termékek között még egy kevert frakció is eluálható, ebből metanolból végzett átkristályosítással 2,5 g kristályos anyagot kapunk, amely a két izomer vegyület keverékéből áll.

9. példa

Tetraacetil-rezorufin-4-karbonsav-morfolid-Ó-D-galaktopiranozid és tetraacetil-rezorufin-6-karbonsav-morfolid-Ó-D-galaktopiranozid

3,26 g (10 mmól) rezorufin-4-karbonsav-morfolidot a 8. példában leírtakkal analóg módon galaktozidálunk. A nyers terméket 1 liter szilikagélen, etil-acetát - aceton (3:1) futtatószcrrel kromatografáljuk. Ilyen módon 0,9 g tctraacetil-rczorufin-6-karbonsav-morfolid-ff-D-galaktopi-91

HU 198734 Β ranozidot, vékonyréteg-kromatográfia (futtatószer: lásd a 7.példában) Rf- 0,71; továbbá 0,4 g, tetraacctil-rezorufin-4-karbonsav-morfolid-/?-D-galaki opiranozidot kapunk. Vékonyréteg-kromalográfia (ugyanazzal a futtatószerrel), R_f- 0,76.

A fentieken kívül még 1,2 g kevert frakciót is kapunk, amely a két izomerből áll.

10. példa

Rezorufin-l-karbonsav-metil-észter-/?-D-galaktopiranozid

1,2 g tetraaceiil-rezorufin-9-karbonsav-metil-észter-/J-D-galaktopiranozidot a 2. példában leírtakkal analóg módon nátrium-metiláttal/metanollal dezacetilezünk. A kitermelés: 0,8 g.

UV/VIS (0,1 mólos kálium-foszfát-puffer, pH = 7,5): λφ_3Κ= 646 nm (í = 21,8 cm² mól'¹).

0-galaktozidázzal végzett hasítás után megkapjuk a rezorufin-l-karbonsav-metil-észter anioniát. A_max = 572 nm (t = 65,4 cm² mól'¹).

³H-NMR (DMSO-d₆): 6 = 3,20-3,80 (m, 6H); 3,91 (s, 3H); 5,09 (d, J = 7,5Hz, IH); 6,30 (d, J=2,lHz, IH); 6,81 (dd, J = 9,8 és 2,1Hz, IH); 7,30 (m, 2H); 7,51 (d, J = 9,8Hz, IH); OHprotonok, nagyon széles, 5 ppm-nél.

A megfelelő tetraacetátok analóg módon végzett dezacetilezésével még az alábbi vegyületeket állítjuk elő:

a) rezorufin-1 -karbonsav-metil-észter-/?-Dgalaktopiranozid, 'H-NMR (DMSO-d₆): 63,4-3,7 (m, 6H); 5,09 (d, J= 7,5Hz, IH); 6,34 (d, J = 2Hz, IH); 6,97 (d, J = 2Hz, IH); 7,08-7,17 (m, 2H); 7,75 (d, J = 10Hz, IH); OH: nagyon széles, 5 ppm-nél;

b) rezorufin-6-karbonsav-morfolid-/?-D-galaktopiranozid, ¹ H-NMR (DMSO-d₆): í= 3,35-3,90 (m, 14H); 5,04 (d, J=8Hz, IH); 6,81 (d, J-lOHz, IH); 7,14 (dd, J = 9,0 és 2,2Hz, IH); 7,16 (d, J = 2,2Hz, IH); 7,56 (d, J = 10Hz, 1H);

7.80 (d, J = 9,0Hz, IH); OH: 4,5 és 5,2 ppm között, 4H, Rf= 0,3, étil-acetát —izopropanol—víz (9:4:2) futtatószerrel, /J-galaktozidázzal végzett hasítás után: UV/VIS (0,1 mólos kálium-foszfátpuffer, pH = 7,5): A_max = 593 nm; Fluoreszcencia-emisszió: A _max = 593 nm;

c) rezorufin-4-karbonsav-morfolid-/J-D-galaktopiranozid, ¹ H-NMR: ó- 3,2-3,85 (m, 14H); az aromás protonok tartományában 2 rotációs izomer válik láthatóvá (a karbonsav-morfolidcsoportnak a rezorufin gyűrűrendszerhez viszonyított helyzete alapján). Ezek viszonya kb. 6:4.

I. izomer: 5,03 (d, J = 8Hz, IH); 6,23 (d, J = 2,2Hz, IH); 6,770 (dd, J = 10 és 22Hz, IH); 7,23 (d, J-9,0Hz, IH); 7,51 (d, J = 10Hz, IH);

7.81 (d,J-lOHz, IH).

11. izomer: 5,05 (d, J=8Hz, IH); 6,25 (d, J - 2,2Hz, IH); 6,775 (dd, J = 10 és 2,2Hz, IH);

7,27 (d, J - 9,0Hz, IH); 7,551 (d, J = 10Hz, IH);

7,83 (d, J - 10Hz, IH). Rf= 0,3 (etil-acetál- izopropanol - víz (9:4:2) futtatószerrel, /?-galaktozidázzal végzett hasítás után: UF/VIS (0,1 mólos kálium-foszfát-puffer, pH- 7,5): A_max453 nm, fluoreszcencia emisszió: A_mM- 593 nm.

11. példa

Rezorufin-9-karbonsav-/?-D-galaktopiranozid-trietil-ammóniumsó

266 mg rezorufin-9-karbonsav-metil-észter-/3-D-galaktopiranozidot felveszünk 50 ml víz és 20 ml 1,4-dioxán elegyével. Ehhez 0,5 ml-es részletekben összesen 5 ml 0,1 n nátríum-hidroxid-oldatot adunk, emellett az oldat pH-értéke nem lehet 12,5-nél magasabb. Ezután a reakcióelegyet 6 ml karbonát-formában levő DEAE-Sephadex-re visszük és 180 ml vízzel mossuk.

Ezután a terméket 0,1 mólos trietil-ammónium-karbonát-pufferrel (pH = 7,5) eluáljuk. Az eluátumot vákuumban bepároljuk. Ezt követően a maradékot etanollal felvesszük, az etanolt elpárologtatjuk és ezt a műveletet néhányszor megismételjük. Ilyen módon 110 mg rezorufin-9karbonsav-,ö-D-galaktopÍranozid-trietÍl-arom6niumsót kapunk.

UV/VIS (0,1 mólos kálium-foszfát-puffer, pH= 7,5): A_max= 465 nm, /1-galaktozidázzaI végzett hasítás után: A_max = 570 nm.

12. példa

Rezazurin-/?-D-galaktopiranozid

12,6 g rezazurin-nátriumsót 65 ml 1 n nátrium-hidroxid-oldatban és 80 ml vízben oldunk. Ehhez 150 ml kloroformban levő 20,6 g aceto-bróm-ö-D-galaktózt és 18,2 g hexadecil-trimetil-ammónium-bromidot adunk. Ezt a keveréket 3 órán keresztül visszafolyatás közben forraljuk, majd szárazra pároljuk és a maradékot etil-acetáttal eldörzsöljük. Ezt az etil-acetátos oldatot ismét bepároljuk és az anyagot 500 g szilikagélen, metilén-diklorid —etil-acetát (3:1) eleggyel eluálva kromatografáljuk. Ilyen módon 2,13 g tetraacetil-rezazurin-/?-D-galaktopiranozídot kapunk, Rf= 0,5 (nagynyomású vékonyrétegkromatográfiával, a fenti futtatószerrel).

Dezacetilezés céljából a 2,13 g tetraacetilszármazékot 0,1 g nátrium-metiláttal és 100 ml abszolút metanollal egy órán át szobahőmérsékleten keverjük. A kivált terméket leszivatjuk, majd vákuumban kalcium-klorid felett szárítjuk. A kitermelés: 1,0 g. Rf= 0,62 [magasnyomású vékonyrétegkromatográfia szilikagélen, etil-acetát - izopropanol — víz (9:4:2) fut tatószerrel], ’H-NMR (DMSO-d₆): í= 3,30-3,90 (m, 6H); 4,54 (széles, d, J = 4,4Hz, IH); 4,67 (széles, t, J = 4,4Hz, IH); 5,07 (d, J = 7Hz, IH); 5,27 (széles, d, J =4,4Hz, IH); 6,15 (d, J = 2Hz, IH); 6,63 (dd, J =9,6 és 2Hz, IH); 7,2 (m, 2H); 7,96 (d, J =9,6Hz, IH); 8,07 (d, J =9Hz, IH).

13. példa

Rezorufin-9-karbonsav-metil-észter-a-P-galaktopiranozid

3,9 g pentaacetil-galaktózt 0,1 g vízmentes cink-kloriddal elegyítve 125 °C-ra hevítünk. Az anyagot 20 percig 1330 Pa nyomás alatt keverjük. Az olvadékhoz 1 g rezorufin-1-karbonsav-metil-észtcrt adunk, az elegyet ezután 1 óra

-101

HU 198734 Β hosszat 41 ’C hőmérsékleten keverjük, majd a 7. példában leírt módon szilikagélen kromatografáljuk, kloroform-etil-acetát (2:1) eleggyel. így sárga színű olajos anyag alakjában 25 mg letraacetil-rezorufin-9-karbonsav-metil-észter-a-Dgalaktopiranozidhoz jutunk. Rf- 0,22 (nagy nyomás alatt végzett vékonyréteg-kromatográfia (HPTLC) szilikagélen, a fenti futtatószerrel}.

A rezorufin-9-karbonsav-metil-észter-o-D-galaktopiranoziddá történő dezaeetilezést a 10. példával analóg módon végezzük, így a cím szerinti vegyületet kapjuk.

14, példa

Rezorufin-9-karbonsav-(3,6-dioxa-oktil)-észtcr-ff-D-galaktopiranozid

0,6 g tetraacetil-rezorufin-9-karbonsav-melil-észter-/í-D-galaktopiranozidot 50 ml dietilénglikol-monoetil-éterrel és egy spatulahegynyi nátrium-hidriddel elegyítünk és az anyagot 15 percig szobahőmérsékleten keverjük, majd 100 ml acetont adunk hozzá. A kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük és szárítjuk-. A kitermelés: 56 mg rezorufin-9-karbonsav-(3,6-dioxa-oktil)-észter-/y-D-galaktopiranozid.

Rf= 0,54 [nagy nyomás alatt végzett vékonyréteg-kromatográfia (HPTLC) szilikagélen, etilacetát — izopropanol (9:4) futtatószerrel).

15. példa

Rezorufin-maltoheptaozid

Az amiláz (E. C. 2.4.1.19), például a Bacillus macerans-ból nyert amiláz hidrolizáló és ciklizáIó hatása mellett glikozil-átvivő tulajdonságokkal is rendelkezik, amit oligoszacharidok és oligoszacharid-szár mázé kok szintéziséhez ki lehet használni (Methods in Carbohydrate Chemistry, II. 347).

680 mg Bacillus macerans DSM 24 mikroorganizmusból nyert amilázt (liofilizátum: 0,46 E/mg bemérés: a bemérés proteintartalma: 28,5%),

500 mg rezorufin-glükozidot,

3,5 g alfa-ciklodextrint és ml' Soerensen-féle foszfátpuffert (pSH 6,2:0,01 mólos) összekeverünk, majd ezt 24 órán keresztül 37 ’C-on inkubáljuk. Tisztítás céljából ezután az alfa- és a keletkezett /?-ciklodextrint előbb a tetraklór-etilén-zárványvegyületen keresztül elválasztjuk. Térhálós szerkezetű dextránon (Sephadex LH20) végzett kromatografálás után 50 mg liofilizátumot állítunk elő, amely az amiláz-tesztben rendkívüli mértékben aktív rezorufinil-maltoheptaozidból áll. R_{- 0,83 (vékonyréleg-kromatográfia szilikagélen (Merck); futlatószer: metil-etil-keton-jégecet-víz 3:1:1 arányú elegye].

16. példa fl-D-Galaktozidáz aktivitásának meghatározása

a) Az alkalmazásra kerülő oldatok elkészítése:

Puffé roldat:

HEPES 100 mmótyl

Nátrium-klorid 154 mmótyl

Magnézium-L-aszpartát 2 mmótyl

RSA 10 g/l

Tween-20 0,5 g/l j>H-érték (nátrium-hidroxid-oldattal beállítva, 37°C) 7,3

1. számú reagensoldat

A fentiekben leírt pufferoldatban feloldunk 0,8 mmótyl rezorufin-/y-D-galaktopiranozidot.

2. számú reagensoldat

A fentiekben lírt pufferoldatban feloldunk 3,5 mmótyl rezorufin-9-karbonsav-/?-D-galaktopiranozidot.

3. számú reagensoldat

A fentiekben leírt pufferoldatban feloldunk 1,0 mmótyl rezorufin-9-karbonsav-metil-észter>p-D-galaktopiranozÍdot.

Enzimoldat

A fentiekben leírt pufferoldatban Escherichia coli-ból származó /?-D-galaktozidázt oldunk úgy, hogy az oldat aktivitása - a gyártó által megadott adatok alapján — kb. 0,08 U/ml legyen. Az enzim a kereskedelemben beszerezhető készítmény.

b) Mérési módszer

A mérést fotometrikus eljárással végezzük, 579 nm hullámhosszon.

cm-es küvettában 950 μΐ reagensoldatot és 50 μΐ enzimoldatot 37 °C-on összekeverünk. A reakciót úgy mérjük, hogy meghatározzuk az extinkció növekedését időegységenként [mExt/ /min). Ezt úgy számítjuk ki, hogy a mért extinkciós értéket osztjuk a reakcióidővel.

fenti mérések során talált értékeket az alábbi Táblázatban foglaljuk össze:

Reagensoldat száma	Reakció [mExt/min]
1.	85
2.	46
3.	76
17. példa p-D-Galaktozidáz	kimutatása indikátorfilm
segítségével

Homogén masszát készítünk az alábbi anyagokból:

ml 7,3 pH-jú vizes oldat, amely 0,5 mól kálium-foszfátot és 0,05 mól magnézium-kloridot tartalmaz,

0,13 g nátrium-alginát, g 50%-os poli(vinil-propionát)-diszperzió,

-111

HU 198734 Β g szilikagél, ml víz,

0,4 g Triton X-100, mg rc7orufm-0-D-galaklopiranozid, 5 ml metanolban oldva.

Ezt a maszát felvisszük egy 0,1 mm vastagságú polikarbonál-fóliára (Pokalon, Lonza cég) 0,2 mm szélességű sávokban. A rávitt anyagot ezután 50 ’C hőmérsékleten megszárítjuk, majd a fóliát 6x6 mm-es darabokra vágjuk, végül ragasztószalaggal 400 μπ\ vastagságú polisztirol-fóliára felragasztjuk.

Az így kapott tesztcsíkokat rövid időre belemártjuk a £-D-galaktozidázt tartalmazó vizsgálandó oldatba. Két perc várakozási idő után, szobahőmérsékleten vörös elszíneződése lép fel, melynek intenzitása a vizsgált oldat /?-D-galaktozidáz-koncentrációjától függ. Meghatározott és ismert //-D-galaktozidáz-tartalmú tesztoldatok segítségével egy színskálát állíthatunk fel és ennek felhasználásával egy próba ismeretlen β-Ό-galaktozidáz-tartalmát meg lehet határozni.

A fentiekben leírt tesztcsíkokat arra is fel lehet használni, hogy valamilyen minta 0-D-galaktozidáz-aktivitását kinetikusán — reflexiófotometriás úton - meghatározzuk. Ennek érdekében a szokásos módon, vagyis ismert mértékű β-D-galaktozidáz-aktivitást tartalmazó próbák alapján, egy hirdetési görbét veszünk fel. A hitelesítési görbe segítségével azután meg lehet határozni egy bármilyen minta még nem ismert β-D-galaktozidáz aktivitását.

18. példa

Szabad és konjugált ff-D-galaktozidáz aktivitásának meghatározása

a) Az alkalmazásra kerülő oldatok elkészítése:

Pufferoldat:

HEPES 100 mmól/l

Nátrium-klorid 154 mmól/l

Magnézium-L-aszpartát 2 mmól/l

BSA 10 g/1

Tween-20 0,5 g/1 pH érték (nátrium-hidroxi-oldattal beállítva, 37’C) 7,3

Reagensoldat

A fentiekben leírt pufferoldatban feloldunk 0,8 mmól/l rezorufin-^-D-galaktopiranozidot.

Enzimoldat

A fentiekben leírt pufferoldatban Escherichia coli-ból származó /?-D-galaktozidázt oldunk úgy, hogy az oldat aktivitása - a gyártó által megadott adatok alapján - kb. 0,08 U/ml legyen. Az enzim a kereskedelemben beszerezhető készítmény.

Enzim-konjugátum-oldat

Egy /)-D-galaktozidáz-antitesl-készítményt használunk. Az ilyen enzim-antite&t-konjugátumok előállítása ismert, így például a Biochem. Biophys. Acta, 612, 40-49 (1980) irodalmi forrásban ilyen eljárás leírása található. A készítményt pufferoldattal hígítjuk olyan mértékben, hogy annak aktivitása a fentiekben leírt enzimoldatával nagyjából megegyező legyen.

b) Mérési módszer

A mérést fotometrikus eljárással végezzük 578 nm hullámhosszon.

cm-es küvettában 950 pl reagensoldatot 37 ’C hőmérsékleten összekeverünk 50 μί enzimoldattal, vagy pedig 50 μί enzim-konjugátum-oldattal. A reakció mértékeként meghatározzuk az időegységenként bekövetkező extinkciónövekedésl [mExt/min],

A szabad /?-D-galaktozidázzal végzett reakciónál 85 mExt/min értéket, míg a /J-D-galaktozidáz-antilest-konjugátummal végzett reakció esetén 92 mExt/min értéket mértünk. Mind a két mért érték azt mutatja, hogy mind a szabad, mind a konjugált /)-D-galaktozidáz esetében jól mérhető extinkciós különbség van.

Ebből következik, hogy az ismertetett vegyületek szubsztrátumként a szabad glikozidázokhoz és a glikozidázkonjugátumokhoz egyaránt alkalmasak. Az új szubsztrátumokat tehát nemcsak a szabad glikozidázok meghatározásához lehet diagnosztikai készítményként hasznosítani, hanem azokat előnyös módon olyan immunológiai meghatározási módszerekhez is felhasználhatjuk, melyeknél valamilyen glikozidáz az indikátorenzim szerepét tölti be.

19. példa o-Amiláz-aktivitás meghatározása

Citrátpufferben (pH = 6) oldott rezorufin-maltoheptaoziddal ( előállítását lásd a 15. példában) szűrőpapírt itatunk át. Az így kapott reagenspapírt egymás után egy α-amilázt tartalmazó, majd egy a- és /f-glüközidázt tartalmazó próbaoldalba mártjuk. Néhány perc múlva igen jól látható vörös elszíneződés lép fel, melynek intenzitása a próba α-amiláz-koncentrációjával arányos.

Az α-amilázt ismert koncentrációban tartalmazó próbák segítségével egy hitelesítő görbét tudunk felvenni és ennek alapján egy minta ismeretlen α-amiláz-tartalmát meg lehet határozni.

A fenti 15 -19. példában használt rövidítések jelentése az alábbi:

HEPES 2-[4-(2-hidroxi-etil)-l-piperazinil]-etán-szulfonsav,

BSA szarvasmarha-szérumból kinyert albumin (bovine serum albumine),

Tween - 20 polioxietilén(20)szorbitán-monolaurát,

Triton X 100 alkilfenol-polietilénglikol-éter.

20, példa

a) Peracetil-ft-D-maltopentaozid

100 g (0,12 mól) maltopentaózt és 81,8 g (1,0 mól) vízmentes nátriumacetátot 1,1 liter (11,7

-121

HU 198734 Β mól) ecetsavanhidridben szuszpendálunk és lassan, a nedvesség kizárása mellett addig melegítjük (kb. 110 °C-ra), amíg a reakció megindul. Ezután jeges vízzel lehűtjük, amíg a reakció be nem fejeződik és végül, az átalakulás teljessé té- 5 telére még 1 órán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk. A reakcióelegyet kb. 70 °C-ra hűtjük le és 4 liter jeges vízbe öntjük. 60 perces kevertetés után a felülúszót leöntjük és a maradékot 500 ml diklórmetánban oldjuk. A diklórmetános fázist 10 egymás után vízzel, telített NaHCO₃ oldattal és vízzel kirázzuk és Na₂SO₄ fölött szárítjuk. Az oldószer vákuumban való ledesztillálása után a maradékot 1,5 liter 1:1 etanobizopropanol elegyből, A-szén hozzáadása mellett átkristályositjuk. 15

Kitermelés: 166,2 g (az elméleti 89,8%-a) színtelen kristály; Op.: 120-125 °C; [q]²⁰d+123,5°; Vékonyréteg-kromatográfia: (Merck) szilikagél 60 lemezek toluol/aceton 7/4 R_f= 0,52.

’H-NMR. (DMSO-d_ó): 1,8-2,2 (s, 51H, COOCH₃), 3,8-5,5 (m, 35H, H-l -H-6).

Irodalom: Herzfeld, Chem. Bér. 13, 1880, p. 267.

Az előzőekben leírtak szerint a következő peracet il-/?-D-maltozidokat szintetizáljuk, a maltopentaóz helyett azonos mennyiségű maltózt, maltolriózt, maltotetraózt, maltohexaózt és maltoheptaózt alkalmazva.

Cukor O.p. (°C)	Kitermelés	H²⁰d (CHC1₃^_%)	R_f (szilikagél 60:0	toluol/aceton 7/4
maltóz	159-160	90	+ 62,5	0,64
maltotrióz	—	85	+100,3	0,59
maltotetraóz	—	88	+109,7	0,56
maltopentaóz	120-125	90	+123,5	0,52
maltohexaóz	140-145	91	+130,0	0,49
maltoheptaóz	160	82	—	0,46

b) H idroxi-u - D- peracetil-maltopentaozid

150 g (0,096 mól)’peracetil-/J-D-maltopenlaozidot 200 ml absz. tetrahidrofuránban oldunk. Kevertetés közben az elegyhez adunk 33 ml (0,3 mól) benzilamint és 2 órán át szobahőmérsékleten, nedvesség kizárásával kevertetjük. Végül vákuumban szárazra pároljuk, a maradékot 400 ml diklórmetánban oldjuk és a diklórmetános fázist egymás után 400 — 400 ml 5 n sósavval, vízzel, telített NaHCO₃ oldattal és vízzel mossuk. A szerves fázist ezután Na₂SO₄ fölött szárítjuk és Aszénnel visszafolyatás közben forrásig melegítjük. Az A-szén kiszűrése után a szűrletet vákuumban szárazra pároljuk. A termék további tisztítás nélkül felhasználható a következő lépésben. Kitermelés: 140 g (az elméleti 97%-a).

Vékonyrétegkromatográfia: szilikagél 60 (Merck toluol/aceton 7/4) R_f = 0,42.

’H-NMR (DMSO-d₆): 1,8-2,2 (s, 48H, COOCH₃), 3,8-5,5 (m, 35 H, H-l - H-6), 5,7 (s, IH, OH).

Irodalom: B. Helferich, W. Portz, Chem. Bér. 86,604(1953).

Az előbbi eljárással analóg módon a következő maltozideket állítjuk elő:

Cukor	Kitermelés	Rf szilikagél 60, (toluol/aceton 7/4)
maltóz	96%	0,45
maltotrióz	96%	0,40

c) Peracetil-maltopentaozil-q-D-triklór-acetimidát g (0,05 mól) hidroxi-a-D-peracetil-maltopentaozidot és 25 ml (0,25 mól) triklór-acetonitrilt 150 ml absz. diklórmetánban oldunk. Az oldatot 0 “C-ra hűtjük le, kevertetés közben részletekben 1,5 g (0,055 mól) nátriumhidridet adunk hozzá és végül 2 órán át szobahőmérsékleten a nedvesség kizárása mellett kevertetjük. A felesleges nátriumhidridet Uvegszűrővel távolítjuk el. A szűrletet kovasavgél oszlopon vezetjük át (60 Merck, kb. 200 ml, 0 6 cm) és 2 liter etil-acetáttal utána mossuk az oszlopot. A szűrletet A-szénnel visszafolyató hűtő alatt forrásig melegítjük, majd az A-szenet kiszűrjük és a szűrletet vákuumban szárazra pároljuk.

Kitermelés: 72 g (az elméleti 87,5%-a) színtelen, habszerű termék. Vékonyréteg-kromatográfia: Fj^ szilikagél 60 (Merck) Rf» 0,58.

-131

HU 198734 Β ’H-NMR (DMSO-dfc): 1,8-2,2 (s, 48H, COOCH₃), 3,8-5,5 (tn, 35H, H-l - H-6); 6,3 (s, IH, NH).

Irodalom:

R. Schmidt, M. Stumpp. Liebig’s Ann. Chem. 1983. 1249-1256.

Az előbbiekhez hasonlóan állítjuk elő még a peracelil-maltolrióz-triklóracelimidátot is.

Kitermelés: 93%. R₍ = 0,45.

d) Rezorufinil-0-D-maltopentaozid g ()0,44 mól) peracetil-maltopentaozil-o-D-triklóracetimidátot és 4,4 g (0,02 mól) rezorufint 1 liter absz. DMF-ben szuszpendálunk. Hozzácsepegtetünk - szobahőmérsékleten —

6,3 ml (0,05 mól) BF₃.OEt₂-t és az elegyet 8 órán át a nedvesség kizárása mellett 60 °C-on kevertetjük. Szobahőmérsékletre való lehűlés után kb. 500 ml Al₂O₃-on szűrjük és az oxidot 5 liter etilacetáttal utánamossuk. A szűrletet vákuumban szárazra pároljuk, a maradékot 100 ml absz. metanolban oldjuk és 2 g NaOCH₃-al 3 órán át a nedvesség kizárása mellett reagáltatva dezacetilezzük. A szuszpenziót vákuumban szárazra pároljuk, a maradékot 100 ml vízben felvesszük, 2 n sósavval pH 6-ra állítjuk be és felvisszük egy kb. 500 ml térfogatú (0 8 cm) diaion oszlopra. Ezt először 4 liter vízzel, majd 3 liter 20%-os izopropanolos oldattal eluáljuk. Az eluátumot kb. 40 ml-re bepároljuk és RP-18-Flash oszlopon (0 = 4 cm, h = 39 cm) eluálószerként 15%-os izopropanollal 50 ml-es részletekben kromatografáljuk. A rezorufinil — maltopenaozidot tartalmazó frakciókat egyesítjük, vákuumban kb. 20 ml térfogatra pároljuk be és RP—18 —MPLC oszlopon 10 ml-es részletekben 15%-os izopropanollal mint eluálószerrel kromatografáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, vákuumban bepároljuk, végül liofilizáljuk.

Kitermelés: 2,8 g (az elméleti 14%-a) narancsszínű liofilizátum, HPLC: RP-18 oszlop, 1 ml/perc, 17% izopropanol, ^rt = 2,95 perc, rezorufin-tartalom (G5): 97%.

'H-NMR (DMSO-d₆): 3,0-6,0 (m, 51H, OH, H-l - H-6); 6,2 -8,0 (m, 6H, ArH).

Irodalom:

R. Schmidt, G. Jrundler: Synthesis 1981, 885-887.

21. példa

a) Br-n-D-maltozid

A peracetilezett cukorból 25 mmólt 50 ml etilacetátban oldunk. Csepegtetéssel hozzáadunk 50 ml (30%-os) jégecetes HBr oldatot és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten a nedvesség kizárása mellett kevertetjük. Végül 300 ml diklórmetánt adunk hozzá és 1 liter jeges vízre öntjük. A szerves fázist elkülönítjük és egymás után vízzel, telített NaHCO3 oldattal és vízzel kirázzuk. A szerves fázist Na2SO4 felett szárítjuk, majd vákuumban szárazra pároljuk. A termék további tisztítás nélkül felhasználható a következő reakcióban.

Cukor	Kitermelés	Rf szilikagél 60,(toluol/aceton 7/4)
maltóz	88%	0,72
maltotrióz	88%	0,65
maltotetraöz	93%	0,61
maltopentaóz	91%	0,57
maltohexaóz	93%	0,53
maltohaptaóz	95%	0,55

Irodalom:

Brauns, J. Am. Chem. Soc. 51, 1929,1830.

b) Rezorufinil-/i-D-maltozid (a cukor-komponenseket az alábbi táblázatban adjuk meg):

mmól rezorufint és 25 mmól Ag₂O-t 800 ml absz. CH₃CN-ben 3A molekulaszitával szuszpendálunk és 4 órán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk az elegyet, a nedvesség kizárása mellett. 62,5 mmól Br-n-D-peracetil-maltozidot 200 ml absz. CHH₃CN-ban oldunk, ezt hozzáadjuk a rezorufin oldathoz és az elegyet 6 órán át visszafolyató hűlő alatt forraljuk. További 18 órán át kevertetjük az elegyet szobahőmérsékleten, majd 10 g A-szenet adunk hozzá és rövid időn át viszszafolyató hűtő alatt forraljuk. Az elegyet 100 g Al₂O₃-n (III/N aktivitási fok) szűrjük át és a szűrőt 5 liter ecetsawal utánamossuk, A szűrletet vákuumban szárazra pároljuk, a maradékot 1 liter absz. alkoholban oldjuk és 5 g NaOCH₃hozzáadása után, a nedvesség kizárása mellett szobahőmérsékleten kevertetjük, A szuszpenzlót vákuumban szárazra pároljuk, a maradékot 200 ml vízben oldjuk, a pH-ι 7-re állítjuk be és az oldatot felvisszük egy 500 ml-es Diaion HP —20 oszlopra (Mitsubishi, Japán). Ezt 15 liter vízzel mossuk és 10 liter 15%-os izopropanol oldattal eluáljuk. Az eluátumot vákuumban 100 ml-re pároljuk be, az imidát módszer szerint RP-18MPLC oszlopon izopropanol oldattal kromatografáljuk és liofilizáljuk.

-141

HU 198734 Β

Rezorufinil-glikozidok jellemző adatai;

Cukor	Kitermelés (%)	HPLC rt/ /izopropanol (%)	Rf szilikagél) butanol/ecetsav/ /víz = 50/15/25
maltotrióz⁸	15	3,52 perc/17%	0,32
maltotetraóz	16	3,27 perc/17%	0,29
maltopentaóz	14	2,95 perc/17%	—
maltoheptaóz	10	2,60 perc/17%·	—
maltóz^b	15	-	0,39

a) A rezorufinil-^-D-maltotrióz esetében a

Diaion oszlop eluálását 25%-os izopropanollal, az RP-18 oszlopon a kromatografálást pedig 25%-os izopropanollal végezzük. ^υ

b) A rezorufinil-/J-D-maltozid esetében a Diaion oszlop eluálását 40%-os izopropanollal végezzük. A terméket vákuumban szárazra pároljuk, majd DMF-ben oldjuk és a terméket vízzel kicsapjuk. A csapadékot leszivatjuk és vá- “ kuumban szárítjuk.

’H-NMR (DMSO-d₆): maltóz= 3,1-3,9 (m,

11H, OH, H-6); 4,4-5,7 (m, 10H, H-l-H-5);

6,2-8,0 (m, 6H-ArH); maltotrióz: 3,0-5,9 (m,

32H, OH, Η-1 - H6); 6,2 - 8,0 (m, 6H, ArH). ³⁰

22. példa

Rezorufinil-q-D-mannopiranozid

2,13 g (10 mmól) rezorufint és 2,75 g (10 mmól) ezüstkarbonátot 100 ml acetonitrilben szuszpendálunk és a szuszpenziót nedvesség és fény kizárása mellett 12 órán át szobahőmérsékleten kevertetjük. Végül hozzáadjuk 4,11 g (10 mmól) aceto-bróm-a-D-mannóz 70 ml acetonit- ^wrillel készített oldatát és az elegyet 1 órán át viszszafolyató hűtő alatt forraljuk. Lehűlés után a nem oldódott anyagot szűrjük, a szűrletet rotációs bepárlón bepároljuk és szilikagélen kromatografáljuk (szilikagél 60, Merck Darmstadt; futta- ⁴³tószer; klorofornrtetrahidrofurán 10:1); Rf =

0,3.

A rezorufinil-a-D-mannopiranozid-tetraacetát kitermelése: 0,5 g (9%).

0,5 g rezorufinil-a-D-mannopiranozid-tetraacetálhoz fény kizárása mellett és kevertetés közben részletekben hozzáadunk egy oldatot, amely 0,10 g nátrium-metilátot tartalmaz 50 ml metanolban oldva. A teljes átalakulás után (ellenőrzés vékonyrétegkromatográfiával) a kivált ³³narancssárga rezorufinil-a-D-mannopiranozid csapadékot szűrjük és metanolból kristályosítjuk.

Vékonyrétegkromatográfia: szilikagél 60 (Merck, Darmstadt); futtatószer etilacelát/izo- „ propanol/víz 9/4/2; R_f = 0,5. A rezorufinil-a-D- ⁶⁰mannopiranozid kitermelés: 0,3 g (88%). A CjgHpNOg képletre;

számított: C: 57,60, H: 4,57, N: 3,73%; talált: C: 57,42, H: 4,66, N: 3,66%. ,,

23. példa

Rezorufinil-béta-D-glukuronid

2,13 g (10 mmól) rezorufint és 2,75 g (10 mmól) ezüst-karbonátot 100 ml acetonitrilben a nedvesség és a fény kizárása mellett 12 órán át szobahőmérsékleten kevertetünk. Végül az oldathoz hozzáadunk 3,97 g (10 mmól) aceto-bróm-glukuronsav-metilésztert 70 ml acetonitrilben oldva és a reakcióelegyet először 4 órán át szobahőmérsékleten, majd 6 órán át 50 °C-on kevertetjük. Lehűlés után a fel nem oldódott anyagot centrifugálással elkülönítjük, az oldatot rotációs bepárlón betöményítjük és a nyersterméket metanol hozzáadásával kicsapjuk. A tisztítást szilikagél-oszlopkromatográfiával végezzük (Kieselgel 60, Merck, Darmstadt; eluálószer: tetrahidrofurán:kloroform 1:10; Rf = 0,4).

Kitermelés a rezorufinil-béta-D-glukuronsav-metilészter-triacetátra vonatkoztatva: 0,8 g (15%).

Dezacetilezés céljából 0,5 g rezorufinil-béta-D-glukuronsav-metilészter-triacetálot kb. 20 ml nátrium-metilát oldatban szuszpendálunk (ezt 0,5 g nátriumból és 40 ml metanolból állítjuk elő) és a reakció teljes lezajlásáig (kb. 1 óra, vékonyrétegkromatográfiás ellenőrzés mellett) szobahőmérsékleten kevertetjük. Semlegesítés után a kivált csapadékot szűrjük és metanolból átkristályosítjuk. Vékonyrétegkromatográfia: Kieselgel 60, Merck, Darmstadt. Eluálószer: etilacetát:metanol 3:1; Rf = 0,7.

Kitermelés a rezorufinil-béta-D-glukuronsavmetilészterre vonatkoztatva: 0,3 g (79%).

0,2 g rezorufinil-béta-D-glukuronsav-metilésztert 40 ml metanol és 2 ml 0,1 M nátrium-hidroxid elegyében szuszpendálunk és az észter teljes hidrolíziséig (kb. 15 óra, vékonyrétegkromatográfiás ellenőrzés mellett) szobahőmérsékleten kevertetjük. A pH érték ennek során

12,5 — 13 kell, hogy legyen. A nyersterméket szűrjük és Sephadex LH 20 oszlopon (eluálószer: víz) tisztítjuk. Vékonyrétegkromatográfia: Kieselgel 60, Merck, Darmstadt; eluálószer: etil-acetát:metanol 1:1; R_f = 0,4. Kitermelés a rezorufinil-béta-D-glukuronidra vonatkoztatva:

-151

HU 198734 Β mg (20%).

24, példa

Összehasonlító kísérlet amiláz meghatározására p-nitro-fenilmaltoheptaoziddal, illetve rezorufinil-maltoheptaoziddal patogén szérumokban

A következő vizes oldatokat állítjuk elő:

1. sz. oldat:

HEPES 105 mmól/l

MgCU 10 mmól/l alfa-glükozidáz 45 egység/ml ml ilyen oldathoz 0,1 ml béta-glükozidáz-oldatot (56 egység/ml) és 0,025 ml (alfa-amilázt tartalmazó) patogén szérumot adunk.

2. sz. oldat:

10.5 mmól/l rezorufinil-maltoheptaozid

3. sz. oldat:

112.5 mmól/l p-nitro-fenil-malloheptaozid

A) Amiláz meghatározása rezorufinil-maltoheptaozid alkalmazása mellett

1,125 ml 1. sz. oldatot küvettában 0,05 ml 2. sz. oldattal elegyítünk, 25 °C-on. A szín kialakulását fotométerrel — 578 nm-en — mérjük.

B) Amiláz meghatározása p-nitro-fenil-maltoheptaozid alkalmazása mellett

1,125 ml 1. sz. oldatot küvettában 25 °C-on 0,05 ml 3. sz. oldattal elegyítünk. A szín alakulását fotométerrel, 405 nm-en követjük.

C) Eredmény

Amiláz- Az extinkció szubsztrátum változása rezorufinilmaltoheptaozid 72,3 mE/perc p-nitro-fenilmahoheptaozid 38,7 mE/perc

A mért extinkció-változás a találmány szerinti vegyületek alkalmazása esetén lényegesen magasabb. Ez a megállapítás arra az esetre is érvényes, amikor a 3. sz. oldat alkalmazásakor a bevitt szubsztrát-mennyiséget magasabbnak választjuk meg, mint az 1. sz. oldat alkalmazása esetében.

Ezzel a kísérlettel igazoljuk, hogy a rezorufinek mint kromofór csoportok jelentős előnyöket mutatnak az ismert csoportokkal - pl. a p-nitro-fenil-csoporttal — szemben.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás (la), illetőleg (Ib) általános képletű rezorufin-glikozid-származékok előállítására e képletben

R* és R⁶ jelentése hidrogénatom-, -COOH csoport, 1—4 szénatomos alkilcsoporttal észterezett karboxilcsoport, -COO^JHfí^H^jj^képlelű csoport vagy -COOC2H₄OC2H₄OC₂H5 képletű csoport,

R³ és R⁴ jelentése hidrogénalom vagy karbonsav-morfolid, azzal a megkötéssel, hogy R¹ és R⁶, illetve R³ és R⁴ közül az egyik mindig hidrogénatom, és

Y jelentése nitrogénatom vagy =N-*O képletü csoport és

Glikozid jelentése aldohexózból, aldopentózból vagy a megfelelő uronsavtól származó gyök - azzal jellemezve, hogy az egymással tautomér egyensúlyban levő (Iía) és (Ilb) általános képletű vegyületeket — amelyekben a helyettesítők jelentése az előbbiekben megadott — egy aldohexózzal, aldopentózzal vagy uronsawal vagy ezek egy 1-halogén-származékával reagáltatjuk, amelyben valamennyi hidroxilcsoport a szénhidrát-kémiában szokásosan alkalmazott védőcsoporttal védett, per-O-helyettesített glikozidok előállítására, majd ezekből a védőcsoportokat lehasítjuk és kívánt esetben a helyettesítők előbbiekben meghatározott körében

i) egy, az előbbiek szerint előállított észtert savvá, egy savat sóvá, előnyösen trimetil-ammóniumsóvá vagy ii) a kapott észtert egy másik (la) vagy (Ib) általános képletű észterré, előnyösen 3,6-dioxa-oktilészterré alakítjuk át.

(Elsőbbsége: 1984. 03. 29.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy egymással tautomér egyensúlyban levő (Iía) és (Ilb) általános képletű vegyületeket - amelyekben a helyettesítők jelentése az

1. igénypontban megadott - béta-D-galaktopiranózzal, alfa-D-mannopiranózzal, béta-D-glukopiranózzal, alfa-D-glukopiranózzal, alfa-Dmannopiranózzal vagy ezek 1-halogén-származékával reagáltatjuk.

(Elsőbbsége: 1984.03. 29.)
3. Eljárás rezorufinszármazékok (la), illetve (lb) általános képletű glikozidjainak előállítására - a képletben

R^{* l} és R⁶ jelentése hidrogénatom-, -COOH csoport, 1 — 4 szénatomos alkilcsoporttal észterezett karboxilcsoport, -COoQ'ÍH(C₂H₅)3®képletű csoport vagy -COOC2H₄OC₂H₄OC2H5 képletű csopot,

R³ és R⁴ jelentése hidrogénatom vagy karbonsav-morfolid, azzal a megkötéssel, hogy R¹ és R⁶, illetve R³ és R⁴ közül az egyik mindig hidrogénatom, és

Y jelentése nitrogénatom vagy aN-»O képletű csoport és

Glikozid jelentése max. 10 aldohexózból vagy aldopentóz egységből álló oligoszacharid lánc azzal jellemezve, hogy az egymással tautomér egyensúlyban lévő (Ha) és (Ilb) általános képletű vegyületeket, ahol a helyettesítők jelentése a fentiekben megadott, egy max. 10 aldohexóz vagy aldopentóz egységből álló oligoszachariddal, illetve ennek I-halogénszármazékával, amelyben valamennyi hidroxilcsoport a szénhidrát-kémiában szokásosan alkalmazott bármilyen védőcsoporttal védett, per-O-szubszlituált glikozidokká alakítjuk át, majd ezekből a védőcsoportokat lehasítjuk és kívánt esetben

i) az így előállított (la) vagy (Ib) általános képletű vegyületeket - amelyekben a glikozidmaradék 1-9 aldohexóz vagy aldopentóz egysé16

-161

HU 198734 Β get tartalmaz - ciklodextrinnel és egy glikozilítvivö enzimmel olyan (la) vagy (Ib) általános képletű vegyületekké alakítjuk át, ahol a képletben a glikozid-maradék egy 2-10 aldohexóz vagy aldopentóz-egységet tartalmazó oligoszacharid — és/vagy a helyettesítők előbbiekben meghatározott körében ii) egy, az előbbiek szerint előállított észtert savvá, egy savat sóvá, előnyösen trímetil-ammóniumsóvá vagy iii) a kapott észtert egy másik (la) vagy (Ib) általános képletű észterré, előnyösen 3,6-dioxa-oktilészlerré alakítjuk ál.

(Elsőbbsége: 1985.03. 28.)
4. Eljárás glíkozidázok aktivitásának meghatározására, azzal jellemezve, hogy szubsztrátumként az 1. igénypont vagy a 2. igénypont szerinti eljárással előállított rezorufmszármazékok megfelelő glikozidjait alkalmazzuk, (Elsőbbsége: 1984.03. 29.)
5. Eljárás glíkozidázok aktivitásának meghatározására, azzal jellemezve, hogy szubsztrátumként a 3. igénypont szerinti eljárással előállított rezorufin-glikozid-származékokat alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1985.03. 28.)
6. Eljárás szacharid-láncot hasító enzimek aktivitásának meghatározására, azzal jellemezve, hogy szubsztrátumként a 3. igénypont szerinti eljárással előállított rezorufin-glikozid-származékot alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1985. 03. 28.)
7. Glíkozidázok kimutatására szolgáló diagnosztikai készítmény, amely egy vagy több kromogén és/vagy fluorogén szubsztrátumot, alkalmas pufferanyago(ka)t és adott esetben további, szokásos segédanyagokat célszerűen nedvesítőszert, stabilizátort, vázképzőt, töltőanyagot, előnyösen polioxietilén-(20)-szorbitán-monolaurátot, alkilfenol-polietilénglikolétert, marhaszérum-albumint, polivinil-propionátot és kovasavat tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a készítmény kromogén és fluorogén szubsztrátumként az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárással előállított rezorufin-glikozid-származékot tartalmazza, a 0,4— 3,5 mmól/1 koncentráció tartományban. (Elsőbbsége: 1984. 03. 29.)
8. A 7. igénypont szerinti diagnosztikai készítmény, azzal jellemezve, hogy segédanyagként nedvesítőszert, galenikus adalékanyagokat és/vagy vázképzőt tartalmaz.

(Elsőbbsége: 1984. 03. 29.)
9. Szacharid-láncot hasító enzimek kimutatására szolgáló diagnosztikai készítmény, amely egy vagy több kromogén és/vagy fluorogén szubsztrátumot, alkalmas pufferanyago(ka)t és adott esetben további, szokásos segédanyagokat, célszerűen nedvesítőszert, stabilizátort, vázképzőt, töltőanyagot, előnyösen polioxietilén-)20)-szorbitán-monolaurátot, alkilfenol-polietilénglikolétert, marhaszérum-albumint, polivinilpropionátot és kovasavat, valamint valamilyen alkalmas glikozidázt és adott esetben egy vagy több további segédenzimet tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a készítmény kromogén és fluorogén szubsztrátumként a 3. igénypont szerinti eljárással előállított rezorufin-glikozid-származékot tartalmazza, a 0,4 - 3,5 mmól/1 koncentráció-tartományban.