JPS6317895A - 新規なオリゴサツカライド誘導体、及びこれを用いるα−アミラ−ゼ活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なオリゴサツカライド誘導体及びこれを基
質として用いるα−アミラーゼ活性の測定方法に関する
。

〔発明の背景〕

試料、特にヒト生体内の唾液、膵液、血液、尿中のα−
アミラーゼ活性の測定は医学上の診断において重要であ
る。例えば、膵炎、膵臓癌、耳下腺炎においては、血液
や尿中のα−アミラーゼ活性は通常の値に比べて著しい
上昇を示す。

α−アミラーゼ活性の測定方法てついては、これまで種
々の方法が発表されているが、大別すると、でんぷん、
アミロース、アミロペクチン等の長鎖の天然物及びその
修飾物を使用する方法と、グルコース残基数が４〜７個
のオリゴサツカライド及びその誘導体を使用する方法の
２種に分けられる。

しかしながら、最近では、例えばマルトテトラオース、
マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプ
タオース等のオリゴサツカライドを基質に用いる方法（
特開昭５０−５６９９８号公報、特開昭５３−３７０９
６号公報）やｐ−ニトロフェノール等の色原体を還元末
端に結合したオリゴサツカライドを用いる方法（特開昭
５４−５１８９２号公報）等、均一で構造の明確な基質
を用いる方法がこれまで多く使用されてきたデンプンを
用いる方法に代わってアミラーゼ測定法の主流となりつ
つある。

これらの方法では通常、測定用共役酵素としてα−グル
コシダーゼ（Ｅ、Ｃ，３，２，１，２０；α−Ｄ−グル
コシドグル＝ヒドロラーゼ）又はグルコアミラーゼ（Ｅ
、Ｃ，３，２，１，３；　１，４−α−Ｄ−グルカング
ルコヒｒロラーゼ）、又はβ−グルコシダーゼ（Ｅ、Ｃ
。

３．２．１．２１　；β−Ｄ−グルコシドグルコヒドロ
ラーゼ）を必要とする。

これらの共役酵素は、α−１，４−グリコシド結合を有
する糖鎖の非還元曲末端からα−１，４−グリコシド結
合を加水分解するエキソタイプの酵素であシ、α−アミ
ラーゼ反応に関係なく基質を分解してしまう欠点を有す
る。この為これら共役酵素を用いる上記測定法に於ては
、測定用試液が不安定で、試薬盲検値が極めて高くそれ
によシ測定精度を著しく悪くしていた。さらに測定に充
分な量のグルコアミラーゼ、あるいはα−グルコシダー
ゼを使用できず、正確で且つ精度の高い測定法の組立が
困難であった。

かかる問題点を解決すべく、本発明者らは、これまで数
種の新規な修飾オリゴサツカライドを合成し、これらを
用いるα−アミラーゼ活性の測定法について特許出方し
ている。

例えば、α−アミラーゼ活性を測定するに際し、グルコ
ースが４〜７個からなる直鎖状オリゴサツカライドの非
還元末端グルコースの６位の一級アルコール（−ＣＨ２
０Ｈ）が一般式−ＣＨ２Ｒで表わされる基で置換された
下記構造式を有するオリゴサッカライド誘導体を基質と
して使用するα−アミラーゼ活性の測定法がある（特開
昭５９−５１８００号）。

（式中、右端のグルコース単位は還元性基、ｋは２〜５
の整数であυ、Ｒは、例えばピリ・ゾルアミノ基を表わ
す。） これらの基質は、均一で構造が明確であシα−グルコシ
ダーゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコアミラーゼの基
質とならない点に特徴を有している。しかしながら、こ
れらの基質を用いてα−アミラーゼ活性を測定するには
、高速液体クロマトグラフィー法によるか、或いはα−
グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコアミラ
ーゼを共役酵素に用いて生成するグルコースを測定する
方法によらねばならず、前者は特殊な機器を必要とする
点、後者は検体中に含まれるグルコースにより影響を受
ける点等に問題があった。

そこで、本発明者らは更に研究を重ね、このような問題
を有さないα−アミラーゼ活性測定法を見出し、これを
特許出願している（特開昭６１−８３１９５号）。

即ち、グルコースが４〜７個からなる直鎖状オリゴサツ
カライドの非還元末端グルコースの６位の一級アルコー
ル（−ＣＨ２０Ｈ）が−ＣＨ２Ｒｏ’で示される基で置
換され、更に、還元末端グルコースの１位がフェノキシ
基若しくは置換フェノキシ基又はウンベリフェリル基で
置換された、下記構造式〔１〕、を表わす。（但し、Ｒ
ｏ３〜Ｒ，６は水素、低級アルキル基、低級アルコキシ
基、ニトロ基、カルボキシル基、スルホン基又はハロケ
０ンを表わし、夫々同じであっても異なっていても良く
、Ｒｏ　は水素、低級アルコキシ基、ハロケ゛ン又はニ
トロ基を表わす。また、１．８は水素又はメチル基を表
わす。）〕で示されるオリゴサッカライＰ誘導体を基質
として用いるα−アミラーゼ活性測定法がそれである。

この測定法は従来のα−アミラーゼ活性測定法が有する
種々の間頂点を全て解決した優れた測定法であるが、用
いる基質の合成収率がいずれも非常に低いという点で実
用化（企業化）に際し開運が残る。従って、従来のα−
アミラーゼ活性測定用基質が有する問題点を一切有さず
、しかも、合成が容易でより収率よくこれを得ることが
できるα−アミラーゼ活性測定用の合成基質の出現が待
ち望まれている現状にある。

〔発明の目的〕

本発明は上記した如き状況に鑑みなされたもので、従来
のα−アミラーゼ活性測定用基質が有する問題点を一切
有さす、しかも、合成が容易で、収率よく得ることがで
きる新規なα−アミラーゼ活性測定用基質とこれを用い
る実用化が容易なα−アミラーゼ活性測定法を提供する
ことを目的とする。

〔発明の構成〕

本発明は、グルコースが４〜７個からなる盲鋲状オリゴ
サッカライドの非撮元末端グルコースの２位又は３位の
水酸基が一０ＣＲ２ＣＯＯＸ　（但し、Ｘは水素、ＮＨ
４又はアルカリ金属を表わす。）で示される基で置換さ
れ、更に、還元末端グルコースの１位が置換基を有して
いても良いフェノキシ基、置換基を有していても良いナ
フトキシ基、置換基を有していても良いウンベリフェリ
ル基又は置換基を有していても良いインＰキシル基で置
換された、下記構造式ＣＤ又はＣＩＤ 〔式中、Ｒ１は一０ＣＨ２ＣＯＯＸ　（但し、Ｘは水素
、ＮＨ４（但し、Ｒ３−Ｒ６は水素、低級アルキル基、
低級アルコキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、スルホ
ン基又はハロケ゛ンを表わし、夫々同じであっても異な
っていても良く、また、Ｒ３とＲ５又はＲ４とＲ６とが
結合して芳香環を形成していても良い。Ｒ７は水素、低
級アルコキシ基、ハロゲン又はニトロ基を表わす。また
、Ｒ８は水素又はメチル基を表わし、Ｒ９は水素又はハ
ロケ゛ンを表わす。）全表わし、ｎは２〜Ｓの整数を表
わす。〕 で示されるオリゴサッカライド誘導体、及びこれを基質
として用いるα−アミラーゼ活性測定法の発明である。

本発明者らは、α−アミラーゼ活性測定用の合成基質と
して使用し得る、還元末端、非還元末端の両方のグルコ
ースの水酸基に修飾基を有するオリゴサッカライド誘導
体について鋭意研究の途上、非還元末端グルコースの水
酸基がカルボキシメトキシ基（又はその塩）で置換され
たオリゴサッカライド誘導体に於ては、非還元末端グル
コースの修飾基のイＧ飾位置を６位から２位又は３位に
することにより、その収率が著しくカニし、しかも、α
−アミラーゼ活性ｆｆｉ’ｌ定用基質としての効果には
何ら変シがないことを見出し、不発明を完成するに到っ
た。

一役式〔Ｉ〕又は〔ＩＩ〕で示される本発明のオリゴサ
ツカライド誘導体に於て、Ｒ１で示される一０ＣＨ２Ｃ
ＯＯＸなる基としては、刀ルポキシメトキシ基（−０Ｃ
Ｈ２ＣＯＯＨ）又はそのアンモニウム塩若しくはアルカ
リ金属（Ｎａ、に、Ｌｉ等）塩が挙げられる。

もよいフェノキシ基又は、置換基を有していても良いナ
フトキシ基としては、オリゴサツカライドの還元末端に
結合し、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ又はβ
−グルコシダーゼの作用を受けて加水分解され得るもの
であり、更に、氷解後は、ニトロフェノール票の如くそ
れ自体可視部に吸収を有するものか、又はカテコールオ
キシダーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼ又はモノフェノ
ールオキシダーゼ等の酸化酵素の作用を受けてカプラー
とカップリングして色素を生ずるか、或いは酸化剤によ
りカプラーとカップリングして色素を生ずるものであれ
ばいずれにても良い。このような条件を満足す６Ｒ２と
しては、例え）ブ、ｐ−ニトロフェニル基、ｍ−ニトロ
フェニル基、Ｏ−クコロフェニル基、ｐ−クロコフェニ
ル基、２．６−ノクロロフエニル基、ｏ−メトキシフェ
ニル基、ｐ−メトキシフェニル基、０−メチルフニニル
基、０−カルボキシフェニル基、ｏ−スルホフニニル基
、１−ナフチル基、２−スルホ−１−ナフチル基、２−
カルボキシ−１−ナフチル基等が挙げられるが、これら
に限定され力い。

で表わされる置換基を有していてもよいウンベリフェリ
ル基としては、Ｒか水素のウンベリフニリル基又はＲ８
がメチル基の４−メチルウンベリフェリル基が挙げられ
る。

ま念、一般式ＣＤ又は〔ＩＩ〕の−ＯＲ２に於て、でも
よいインドキシル基の置換基としては、例えば、塩素、
臭素等のハロケ゛ンが挙げられる。

大発明のオリゴサツカライド誘導体は、通常デキストリ
ン、アミロース、サイクロデキストリン（α、β、γ）
等の多糖類を原料として、一般に下記合成例の如くして
合成される。

合成例 先ず、非還元末為グルコースの２位又は３位の水散基が
カルボキシメチル基で置換されたオリがサツカライド誘
導体を、公知文献例えば、特開昭５９−３１６９９号公
報に記載の方法に準じて合成する。即ち、先ず、サイク
ロデキストリン、水酸化す）　ＩＪウム、及びモノクロ
ル酢酸を水溶液中で反応させる。このとき、β−サイク
ロデキストリンのグルコース単位　１モルに対し、アル
カリは約０、５〜１０モル、モノクロル酢酸ハ約０．５
〜５モルを使用する。反応は約３０〜７０℃で０．５〜
５時間加熱攪拌することにより進行する。本反応によシ
、サイクロデキストリン　１個毎にカルボキシメチル基
又はそのアンモニウム塩若しくはアルカリ金属塩が１個
入った修飾サイクロデキストリンを得る。次いで、上で
得られた修飾サイクロデキストリンに、例えば、ｐ−ニ
ド：フェニルα−グルコシド、ｏ−メトジンフェニルα
−グルコシｐ、４−メチルウンヘリフエリル　α−グル
コシＰ又バインドキシルβ−グルコシド等ト、バチルス
属由来のサイクロマルトデキストリングルカノトランス
フェラーゼ（Ｅ、Ｃ，２，４，１，１９）を加え反応さ
せる。この反応を式で示せば下記の如くなる。

（ここで、Ｇはグル：−ス凰位を示し、ＰＮＰはｐ−ニ
トロフ二ノキシ基を、ＯＭＦは。−メトキシフェノキシ
基を、ＭＵＦは４−メチルウンベリフェリル基を、また
、ＩＮＤはインドキシル基を夫々表わし、Ｘは水素、Ｎ
Ｈａ又はアルカリ金属を表わす。また、ｍは４から６ま
での整数、ｌは２から４までの整数を夫々示す。） 次に、反応液にグルコアミラーゼを加えて反応を行なう
と、次の２種の生成物が得られる。

反応液なイオン交換クロマトグラフィー、グルクロマト
グラフィー等によシ精製し、本発明のオリゴサツカライ
ド誘導体、即ち、カルボキシメチル基又はその塩が非還
元末端に入！’％ｌ）−二）ロフェノキシ基、０−メト
キシフェノキシ基、４−メチルウンベリフェリル基又は
インドキシル基等゛が還元末端に入ったマルトテトラオ
ース、マルトペンタオースを得る。

かくして得られた非還元末端グルコースの２位又は３位
に−０ＣＨ２ＣＯＯＸ基を有する本発明のオリゴサツカ
ライド誘導体は、−０ＣＨ２ＣＯＯＸ基を非還元末端グ
ルコースの６位の一級アルコールに置換した既存のオリ
ゴサツカライド誘導体と比べて、その収率が２〜１０倍
高いので、裡めて経済的であシ、且つまたα−アミラー
ゼ活性測定用基質としての実用化が大いに期待できる。

本発明のオリゴサツカライド誘導体を基質として用いる
α−アミラーゼ活性測定法の測定原理は概路次の通りで
ある。

グルコアミラーゼ （式中Ｇはグルコース１位を示し、−ｏｃＨ２ｃｏａｘ
は非還元末端グル；−スの２位又は３位に置換されたカ
ルボキシメトキシ基又はそのアルカリ金属塩を表わし、
ｍｌとｍ２はその和が２から５である１以上の整数を表
わし、ＯＲ２は還元末端グルコースの□１位に置換され
た置換基を有していてもよいフェノキシ基、置換基を有
していても良いナフトキシ基、置換基を有していてもよ
いウンベリフェリル基又は置換基を有していてもよいイ
ンドキシル基を表わす。） 即ち、先ず始めに、本発明のオリゴサツカライド誘導体
に試料中のα−アミラーゼが作用して、非還元末端グル
コースの２位又は３位のＯＨ基かいフェノキシ基、置換
基を有していても良いナフトキシ基、置換基を有してい
てもよいウンベリフェリル基又は置換基を有していても
よいインドキシル基がついた貼ルＧ　−ＯＲ２が生成し
、次いで、このＧｍ２−Ｇ−ＯＲＫ　グルコアミラーゼ
、α−グルコシダーゼ又はβ−グルコシダーゼ等の共役
溝素が作用して、（ｒｎ２＋１）ＧとＲ２−ＯＨが生成
する。この’Ｒ２−ＯＨを、例えばＲ−ＯＨがｐ−二ト
ロフェノールの如きニトロフェノール類の場合には、１
接その吸収ス槓りトルを（例えば４０５　ｎｍに於ける
吸光度を）測定することによシ、また、Ｒ２−０ｆ（が
、例えばフェノール、ｏ−クロロフェノール、２．６−
ノクロロフエノール、ｐ−メトキシフェノール等の如き
ニトロ基をもたないにトロ基をもっていても良いが）フ
ェノール類或はナフトール類の場合には、カテコールオ
キシダーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼ又はモノフェノ
ールオキシダーゼの如き酸化酵素類又はヨウ素酸、過ヨ
ウ素酸の如き酸化剤を作用させて、４−アミノアンチピ
リン、３−メチ／、−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾ
ン（ＭＢＴＨ）”４のカプラーとカップリング（酸化縮
合）させ、生成する色素の吸収スぽクトルを測定するこ
とにより、或いはＲ−ＯＨがウンベリフェロン、４−メ
チルウンベリフェロンの如く螢光を有する化合物の場合
には、その螢光強度を測定することにより、更にはＲ２
−ＯＨがインドそシルの場合には、酸化されて生成する
インジゴ色素の吸収スペクトルを測定することにより、
夫々試料中のα−アミラーゼ活性を求めることができる
。

本発明のα−アミラーゼ活性測定法に於て、基質として
用いるオリゴサツカライド誘導体の濃度は特に限定され
るものではないが、通常約０．１〜１０　ｒｎＭが好ま
しく用いられる。

本発明の測定対象となる試料は、α−アミラーゼを含有
する検体なら何れを用いてもよく、例えば生体成分とし
て血液、血清、尿等があげられる。

共役溝素のグルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ又は
β−グルコシダーゼとしては、特に限定されないが例え
ば動物、植物、微生物由来のものが利用出来、夫々単独
で、或いは組み合せて用いられる。これら共役酵素の使
用量は通常０．５〜５０単位／　ｍｉ　、好ましくは２
〜２０単位／　ｒｎｌである。

また、本発明を実施する測定条件として、反応温度は特
に限定されないが、好ましくは約２５〜４０℃であり、
反応時間は目的により自由に選択できる。

至適ＰＨとしては特に限定されないが、ＰＨ約６〜８が
好ましい例である。至適ＰＨを推持する緩衝剤は自由に
選択でき、例えば、リン酸塩、トリスハイドロキシメチ
ルアミノメタン−塩酸、グツｒの緩衝剤などが任意に選
ばれる。

さらにα−アミラーゼの賦活剤として、例えば塩化ナト
リウム、塩化カルシウム、塩化カリウム等が使用される
。

共役酵素の作用により遊離したフェノール類又はナフト
ール類とカップリング（酸化縮合）させるカプラーとし
ては、４−アミノアンチピリン、３−メチル−２−ベン
ゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、ｐ−アミノ−
Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン等が挙げられるが、これらに
限定されるものではない。フェノール類又はナフトール
類とカプラーとをカップリング（酸化縮合）させる為の
酸化簿素としては、ラッカーゼ、カテコールオキシダー
ゼ、チロシナーゼ又はモノフェノールオキシダーゼ等が
挙げられるが、これらは例えば、動物、植物、微生物由
来のものが、いずれも利用でき、通常０．２〜１０ｊ１
位／ｍ１．好ましくは０．５〜４単位／ｍｌの範囲で使
用される。また、カップリング（酸化縮合）させる為の
酸化剤としては、ヨウ素酸又は／及びその塩、過コウ素
酸又は／及びその塩、過酸化水素等が挙げられるが、こ
れらに限定されない。

本発明のオリゴサツカライド誘導体は、その非還元末端
グルコースの２位又は３位の水酸基−ＯＨが一〇ＣＩ（
２ＣＯＯＸ　（Ｘは水素、ＮＨ４又はアルカリ金属）な
る基に置換されている為、そのままではグルコアミラー
ゼ、α−グルコシダーゼ又はβ−グルコシダーゼの基質
とはならず、しかも水に易溶で、α−アミラーゼとの親
和性に優れているので、α−アミラーゼの良好な特異基
質となる。従って、本発明の測定法に於ては、副反応が
起らず試薬盲検値は極めて小さく、測定用試液が裡めて
安定である。また、単一の化合物を基質とすることから
、反応の化学量論が成立し、α−アミラーゼの動力学的
検知が可能となる。

また、本発明の測定法に於ては、グルコアミラーゼ、α
−グルコシダーゼ又はβ−グルコシダーゼ等の兵役酵素
を充分に使用することができるので、α−アミラーゼ反
応以降の反応速度が速く、より正確で精度のよいα−ア
ミラーゼ活性の測定を行なうことができる。

更て、本発明の測定法に於て（ま、検出を遊離してくる
ニトロフェノール類若しくはインジゴ色素類の吸収スペ
クトルを測定するか、若しくは遊離してくるフェノール
類又はナフトール類を４−アミノアンチピリン、ＭＢＴ
Ｈ等と酸化カップリングし、その色素の吸収スペクトル
を測定するか、又は遊離シテくるランベリフェニン類の
螢光強度を測定することによシ行なうので、検体中に共
存するグルコース、マルトース等の糖類ヤ、アスコルビ
ン酸、ビリルビン等の還元性物質の影響を殆んど受けな
い。

本発明のアミラーゼ活性の測定方法は、一定条件での反
応速度を測定するレイトアッセイでも、あるいは反応停
止剤を使用するエンドポイントアクセイとしてもよく、
いずれの′５１１定方法も実施可能でちる。

ま念、本発明の測定法は自動分析装置への適Ｚ性も良く
、必要ζて応じて用手法、自動分析のいずれにて行々う
も可である。

更シてまた、本発明の基質を用いた場合には、色素の呈
色を測定す６、所謂比色法で測定を行なうことができる
ので、周便な試験転注や反応試薬を含有させた多層分析
シート（多層一体塁定量分析フィルム）を使用する所謂
乾式定量法にも応用することができる。

以下に実施例を示すが、本発明はこれら実施例により何
ら限定されるものでないことはいうまでもない。

〔実施例〕

ツカライド誘導体の合成 β−サイクロデキストリン　１０ｙ１水酸化ナトリウム
　１０ｇを蒸留水　１００ｒｎｌに溶解し、４０℃で攪
拌しながら３０％モノクロル酢酸水溶液　１５ゴを滴下
して６時間攪拌反応を行なった。

５０％塩酸　２４Ｍｔとトリクロロエチレン　２０′ｆ
ＩＬｔを加えて攪拌した後、反応液を濾過し、濃縮乾固
後、水　２Ｑｍｔで溶解してケ゛ルーｊ５過した。カラ
ムは５０　ｍＭＭ酢酸平衡化し念Ｂｉｏｇｅｌ　Ｐ−２
（Ｂｉｏ　Ｒａｄ社尖）を充填した直径３Ｇ、高さ１５
０αのものを使用し、カルボキシメチル化サイクロデキ
ストリンの画分を集め凍結乾燥した（収量的６．２　Ｎ
　）。

このカルボキシメチルサイクロデキストリンｓ、ｏ：ｇ
と、ｐ−ニトロフェニルα−グルコシド３５０■とを、
２０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液　２゜ｒｎｌで溶解後、
サイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラー
ゼ（バチルスマセランス由来）２０ｉｌ！９を加え、３
７℃、５時間反応させ念。２　Ｍ酢酸を加えｐＨ４，０
とした後、グルコアミラーゼ（リゾプスニベウス由来）
３００ｍ９を加え、３７℃で１０時間反応させた後、２
Ｍアンモニア水溶液でｐＨ７，０とし、全量をイオン交
換クロマトグラフィーテ精製した。カラムは５０ｍＭ酢
酸アンモニウムで平衡化したＤｏｗｅｘ　Ｉ　Ｘ　２　
（Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉ　ｃａ　１社製）を充填した１径
２ｃｍ、高さ１００閏のものを使用Ｌ、５０　ｒｒｒＭ
から９％ｆｆｌでの酢酸アンモニウム溶液の直線的濃度
勾配で行なった。検出は３１０　ｎｍのＵｖ吸収で行な
った。ｐ−ニトロフェニル０−２−（〇−力ルボキシメ
チル）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−〇−
α−Ｄ−グルコピラノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ−
グルコピラノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピ
ラノシルー（１→４）−α−Ｄ−グル＝ピラノシド（以
下、２　ＣＭＧ５Ｐと略す。）の画分及びｐ−ニトロフ
ェニル０−３−（０−力ルボキシメチル）−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル−（１→４）−〇−α−Ｄ−グル＝ピラ
ノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー
（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー（１→４
）−α−Ｄ−グル；ピラノシ′−″（以下、３０ｉＧ５
Ｐと略す。）の画分各々を凍結乾燥し、２ＣＭＧ５Ｐ　
０．８ｇ及び３　ＣＭＧ５Ｐ　０．５　ｇを得た。

精製は高速液体り：マトダラフィーを用い、Ｃｏｓｍｏ
ｓｉｌ　５　Ｃｌ８（半井化学、Ｃ１８逆相）を充填し
たカラム（１０Ｘ２５０ｍｍ）を使用し、溶出液に１％
１−ブタノールを含む０．１Ｍ酢酸を使用して、３．５
ｍＶｍｉｎの流速で行なった。

く構造の確認〉 ２ＣＭＧ５Ｐ、　３ＣＭＧ５Ｐの構造の確認は次のよう
に行なりた。

（１）　Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　＊　３４巻、５７６頁（１９５６年）
に従い、６−０−カルボキシメチルグルコース、２−〇
−カルボキシメチルグルコース及び３−〇−カルボキシ
メチルグルコースを合成し、ｐ−ニトロフェニルα−グ
ルコシドと共に凛準物質とした。

（２）　２　ＣＭＧ５Ｐ　１３　ＣＭＧ５Ｐ及び４種の
凛準物質を用い、ガスクロマトグラフィーで組成を分析
し念。即ち、１．４Ｎ塩酸−メタノールで封管中、９０
℃、２時間のメタツリシス後乾燥させ、これてトリメチ
ルシリルクロリｒとヘキサメチルジシラデンを含むピリ
ノンを加え、５０℃で３０分間反応させてトリメチルシ
リル化を行ない、反応液をカラム（２％０Ｖ−１７，０
，４Ｘ１００ｃｎ　）　ｆ用い、１３０℃から２３０℃
まで４℃／分の昇温でガスクロマトグラフィ−を行なっ
た。検出はＦＩＤで行なった。また、ｐ−ニトロフニニ
ル基の含量は５％酢酸中での３０５ｎｍの吸収で測定を
行なっ念。

（３）分析結果 ｐ−ニトロフェニルα−グルコシドをｉｌ：して、グル
コース／ｐ−二トロフェノールの比は２ＣＭＧ５Ｐで３
．８　、３ＣＭＧ５Ｐで３．９であった。

３種のカルボキシメチルグルコースを標準として、クル
コース／カルボキシメチルグルコースの比は、２　ＣＭ
Ｇ５Ｐで３．７　、３０ＭＧ５Ｐで３．８であった。

また２　ＣＭＧ５Ｐ　、　　３　ＣＭＧ５Ｐには、各々
２−０−力ルポキシメチルグルコース、３−０−カルボ
キシメチルクルコース以外のカルボキシメチルグルコー
スは含まれていなかった。

す７力ライド誘導体の合成 実施例１と同様にして合成したカルボキシメチルサイク
ロデキストリン　５．ＯＦと、インジカン（東京化成製
）０．５ｇとを、２０ｍＭ酢酸アンモニウム１容液　２
Ｑｒｎｉで溶解後、サイクコマルトデそストリングルカ
ノトランスフニラーゼ（バチルスマセランス由来）２０
７＋９を加え、３７℃で５時間反応させた。２　Ｍ酢酸
を加えてｐＨ４，０とした後、グルコアミラーゼ（リゾ
プスニベウス由来）３００■を加え、３７℃で１０時間
反応させた。反応液を２Ｍアンモニア水溶液でｐＨ７，
０とし、全量をイオン交換クロマトグラフィーで精製し
た。カラムハ５０　ｍＭ　酢ｅアンモニウムで平衡化し
たＤｏＷｅｘｌ　Ｘ　２　（Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉ　ｃａ
ｔ社製）を充填した直径２−１高さ１００口のものを使
用し、５０　ｒｍＶＩから２Ｍまでの酢酸アンモニウム
溶液の直線的濃度勾配で行なった。検出は２８０　ｎｍ
のＵｖ吸収で行なった。インドキシル０−２−（０−力
ルボキシメチル）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー（１→４）−〇
−α−Ｄ−グルコピラノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ
−グルコピラノシルー（１→４）−、Ｊ−Ｄ−グルコピ
ラノシ）４（以下、２ＣＭＧ５Ｉ　と略す。）の画分及
ヒインドキシル０−３−（０−カルポキシメニール）−
α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−ｏ−α−Ｄ−
グルコピラノシル−（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピ
ラノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシル
ー（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノン１′（以下、３
ＣＭＧ５ｒと略す。）の画分径々を凍結乾燥し、２ＣＭ
Ｇ５Ｉ　Ｏ，！及び３　Ｃ？ｖＩＧ５　ｌ０４４夕を得
た。精製は高速゛液体クロマトグラフィーを用い、Ｃｏ
ｓｍｏｓｉ　ｌ　５　Ｃｌ８（半井化学、Ｃ１８逆相）
を充填したカラム（１０Ｘ２５０ｍｍ）を使用し、溶出
液に１チ１−ブタノールを含む０．１Ｍ酢酸を使用し、
３５辺Ｊ／ｍｉｎ　の流速で行なった。

く構造の確認〉 ２　ＣＭＧ５Ｉ　、　３　ＣＭＧ５Ｉの構造の確認は次
のように行なった。

（１）　Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｒ　３４巻、５７６頁（１９５６年
）に従い、６−０−カルボキシメチルグルコース、２−
０−カルボキシメチルグルコース及び３−０−カルボキ
シメチルグルコースを合成し、インジカンと共に標準物
質とした。

（２）　２　ＣＭＧ５Ｉ　、　　３　ＣＭＧ５１及び４
種の標準物質を用い、ガスクロマトグラフィーで組成を
分析した。即ち、１．４Ｎ塩酸−メタノールで封管中、
９０℃、２時間のメタツリシス後乾燥させ、これにトリ
メチルシリルクーリｒとヘキサメチルジシラザンを含む
ぎりジンを加え、５０℃で３０分間反応させてトリメチ
ルシリル化を行ない、反応液をカラム（２チ０Ｖ−１７
，０，４Ｘ　１００ｍ）を用い、１３０℃から２３０℃
まで４℃／分の昇温でガスクロマトグラフィーを行なっ
た。検出はＦＩＤで行なった。また、インドキシル基の
含ｌは５％酢酸中での２８０　ｎｍの吸収で測定を行な
った。

（３）分析結果 インノカンを標準として、グル＝−ス／インｉキ’／　
＃　ノ比は、２　ＣＭＧ５　Ｉで３．９　、３ＣＭＧ５
Ｉで３，９であった。

３種のカルボキシメチルグルコースを標準として、グル
コース／カルボキシメチルグルコースの比は、２ＣＭＧ
５Ｉで３．８　、３　ＣＭＧ５Ｉで３．８であつ念。

また２　ＣＭＧ５Ｉ　、　３０ＩＧ５Ｉには、各々２−
０−力ルボキシメチルグルコース、３−〇−カルポキン
メチルグル＝−ス以外のフルボキシメチルグルコースは
含まれていなかった。

実施例３．　α−アミラーゼ活性の測定〔測定試液〕 実ｎ例１で得たｐ−ニトロフェニル０−２−（０−カル
ボキシメチル）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４
）−〇−α−Ｄ−グル＝ピラノシルー（１→４）−〇−
α−Ｄ−グルコピラノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ−
グルコピラノシルー（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノ
シド（２ＣＭＧ５Ｐ）１５■トへイス［：Ｎ−２−ヒド
ロキシエチルピペリジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸
］　　２０ｍｍｏＣ塩化方ルシウム１０　ｍ　ｍｏｌ及
びグルコアミラーゼ５００単位を精製水に溶かして、水
酸化す）　ＩＪウムでｐＨ６，９とし、全量を２Ｑｒｎ
ｌとした。

〔測定操作〕

測定試液２　ｒｎｌに検体血清１００μｊを加え、３７
℃に加温し、この反応液の波長４０５　ｎｍに於ける吸
光度変化を測定した。

別に、α−アミラーゼ活性既知の標準検体を用い、上記
と同様に操作し、検量関係を求め、この検量線から検体
のα−アミラーゼ活性を求めた。

このときの漂１検体の各希釈段階に於けるα−アミラー
ゼ活性（Ｓｏｍｏｇｙｔ単位／ｄｉ　）と波長４０５　
ｎｍに於ける１分間当シの吸光度増加量（ΔＡ）との関
係を第１図に示す。

第１図より明らかな如く、α−アミラーゼ活性（Ｓｏｍ
ｏｇｙｉ単位／ｄｉ）に対してプロットした吸光度増加
量（ΔＡ）を結ぶ検量線は原点を通る１線となり、検量
線は良好な定量性を示している。

尚、２　ＣＭＧ５Ｐの代シに３　ＣＭＧ５Ｐを用いても
、全く同様の結果が得られた。

〔発明の効果〕

以上述べた如く、本発明は新規なオリゴサツカライド誘
導体と、これを基質として用いるα−アミラーゼ活性測
定法を提供するものであり、本発明のオリゴサツカライ
ド誘導体は従来のび一アミラーゼ活性測定用基質が有す
る問題点を一切有さす、しかも合成が容易で収率よくこ
れを得ることができるので、実用化（企業化）が可能な
優れたα−アミラーゼ活性測定法を提供し得るものであ
る点にま著な効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例３に於て得られ念検量線を示し、横軸
の各α−アミラーゼ活性（Ｓｏｍｏｇｙｉ単位Ａ）につ
いて得られた吸光度増加量（ΔＡ）を縦軸に沿ってプロ
ットした点を結んだものである。 特許出厘人　　和光純薬工業株式会社 葛１目

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）グルコースが４〜７個からなる直鎖状オリゴサッ
   カライドの非還元末端グルコースの２位又は３位の水酸
   基が−ＯＣＨ＿２ＣＯＯＸ（但し、Ｘは水素、ＮＨ＿４
   又はアルカリ金属を表わす。）で示される基で置換され
   、更に、還元末端グルコースの１位が、置換基を有して
   いても良いフェノキシ基、置換基を有していても良いナ
   フトキシ基、置換基を有していても良いウンベリフェリ
   ル基又は置換基を有していても良いインドキシル基で置
   換された、下記構造式〔 I 〕又は〔II〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔II〕 〔式中、Ｒ＾１は−ＯＣＨ＿２ＣＯＯＸ（但し、Ｘは水
   素、ＮＨ＿４又はアルカリ金属を表わす。）基を表わし
   、Ｒ＾２は▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式
   、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式、表等
   があります▼ （但し、Ｒ＾３〜Ｒ＾６は水素、低級アルキル基、低級
   アルコキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、スルホン基
   又はハロゲンを表わし、夫々同じであっても異なってい
   ても良く、また、Ｒ＾３とＲ＾５又はＲ＾４とＲ＾６と
   が結合して芳香環を形成していても良い。Ｒ＾７は水素
   、低級アルコキシ基、ハロゲン又はニトロ基を表わす。 また、Ｒ＾８は水素又は、メチル基を表わし、Ｒ＾９は
   水素又はハロゲンを表わす。）を表わし、ｎは２〜５の
   整数を表わす。〕 で示されるオリゴサッカライド誘導体。
2. （２）グルコースが４〜７個からなる直鎖状オリゴサッ
   カライドの非還元末端グルコースの２位又は３位の水酸
   基が−ＯＣＨ＿２ＣＯＯＸ（但し、Ｘは水素、ＮＨ＿４
   又はアルカリ金属を表わす。）で示される基で置換され
   、更に、還元末端グルコースの１位が置換基を有してい
   ても良いフェノキシ基、置換基を有していても良いナフ
   トキシ基、置換基を有していても良いウンベリフェリル
   基又は置換基を有していても良いインドキシル基で置換
   された、下記構造式〔 I 〕又は〔II〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔II〕 〔式中、Ｒ＾１は−ＯＣＨ＿２ＣＯＯＸ（但し、Ｘは水
   素、ＮＨ＿４又はアルカリ金属を表わす。）基を表わし
   、Ｒ＾２は▲数式、化学式、表等があります▼ （但し、Ｒ＾３〜Ｒ＾６は水素、低級アルキル基、低級
   アルコキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、スルホン基
   又はハロゲンを表わし、夫々同じであっても異なってい
   ても良く、また、Ｒ＾３とＲ＾５又はＲ＾４とＲ＾６と
   が結合して芳香環を形成していても良い。Ｒ＾７は水素
   、低級アルコキシ基、ハロゲン又はニトロ基を表わす。 また、Ｒ＾８は水素又はメチル基を表わし、Ｒ＾９は水
   素又はハロゲンを表わす。）を表わし、ｎは２〜５の整
   数を表わす。〕 で示されるオリゴサッカライド誘導体を基質として用い
   ることを特徴とする、α−アミラーゼ活性測定法。
3. （３）α−アミラーゼの共役酵素として、グルコアミラ
   ーゼ、α−グルコシダーゼ又はβ−グルコシダーゼを用
   い、酵素反応により生成するニトロフェノール類の吸収
   スペクトルを測定することによりα−アミラーゼ活性を
   測定する、特許請求の範囲第２項記載の測定法。
4. （４）α−アミラーゼの共役酵素として、グルコアミラ
   ーゼ、α−グルコシダーゼ、又はβ−グルコシダーゼを
   用い、酵素反応により生成するフェノール類又はナフト
   ール類に、必要によりカップラーの存在下、カテコール
   オキシダーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼ又はモノフェ
   ノールオキシダーゼを作用させ、α−アミラーゼ活性を
   測定する、特許請求の範囲第２項記載の測定法。
5. （５）α−アミラーゼの共役酵素として、グルコアミラ
   ーゼ、α−グルコシダーゼ又はβ−グルコシダーゼを用
   い、酵素反応により生成するフェノール類又はナフトー
   ル類に、必要によりカップラーの存在下、酸化剤を作用
   させ、生成する色素の吸収スペクトルを測定することに
   よりα−アミラーゼ活性を測定する、特許請求の範囲第
   ２項記載の測定法。
6. （６）α−アミラーゼの共役酵素として、グルコアミラ
   ーゼ、α−グルコシダーゼ又はβ−グルコシダーゼを用
   い、酵素反応により生成するウンベリフェロン又は４−
   メチルウンベリフェロンの螢光強度を測定することによ
   り、α−アミラーゼ活性を測定する、特許請求の範囲第
   ２項記載の測定法。
7. （７）α−アミラーゼの共役酵素として、グルコアミラ
   ーゼ、α−グルコシダーゼ又はβ−グルコシダーゼを用
   い、酵素反応により生成するインジゴ色素の吸収スペク
   トルを測定することによりα−アミラーゼ活性を測定す
   る、特許請求の範囲第２項記載の測定法。