JPS5939300A - α−アミラ−ゼ活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な基質、すなわち新規なアミロース誘導体
を基質として使用することを特徴とするα−アミラーゼ
活性の測定方法に関するものである。

試料、特にヒト生体内の唾液、膵液、血液、尿中のα−
アミラーゼ活性は医学上の診断において重要である。例
えば、膵炎、膵臓癌、耳下腺炎においては、血液、尿中
のα−アミラーゼ活性は通常の値に比べて著しい上昇を
示す。

α−アミラーゼ活性の測定方法については、これまでに
種々の方法が発表されているが、主に、アミロクラスチ
ック法、クロモダニツク法、サノカロゲニノク法の３群
に分類することができる。

アミロクラスチック法のうちではキャラウェイ法が最も
広く使用されてきたが、共存タノバクがデンプンとヨー
ドの呈色を阻害するため、又反応時間が短いため再現性
が悪い等の問題点がある。

クロモダニツク法は一般にブルースターチ法と呼ばれ、
デンプン又はアミロースに色素を結合した不溶性基質を
用い酵素反応で生成する可溶性色素を測定する方法であ
る。この方法は、最近広く使用されているが、基質とし
ての活性が弱いこと、不溶性であるため反応系が不均一
であること、繁雑な操作が必要であり自動分析装置への
適用が困難であること等の問題点がある。

サッカロダニツク法ではソモジー法が代表的であるが、
試料中のグルコースにょシ高値を示す、操作が繁雑であ
る等の問題がある。

このように従来のα−アミラーゼ活性の測定方法には各
々に個有の欠点があるが、さらに共通して、基質に使用
しているデンプンの品質にょシ測定値にバラツキが生じ
る、又α−アミラーゼ反応を真に化学量論的反応として
測定できないという欠点がある。

本発明者等は、α−アミラーゼ活性を反応速度法で精度
よく、しかも自動分析装置で測定する方法に関し鋭意研
究を重ねた結果本発明を完成するに到った。

本発明は、α−アミラーゼ活性を測定するに際し、アミ
ロースのグルコース単位６〜３５毎にカルボキシメチル
基（−ＣＨ，Ｃ０ＯＨ）又はその塩を有するアミロース
誘導体を基質として使用することを特徴とするα−アミ
ラーゼ活性の測定方法である。

カルボキシメチル基の塩としては、溶解してカルボキシ
メチルイオンを与えるものが好ましく特に限定されない
が、例えば、Ｎａ　＋　Ｋ　＋　Ｌ＋等のアルカリ金属
塩、アンモニウム塩が代表例としてあげられる。

α−アミラーゼは、α−１，４−グリコ７ド結合鎖を加
水分解する酵素であり、α−１，６−グリコシド結合を
含むデンプンあるいはアミロペクチンではα−１，６−
グリコシド結合がα−アミラーゼ反応を妨害する。又、
アミロースの方が化学構造的に均一性が良い為、α−ア
ミラーゼの基質としてはデンプンあるいはアミロペクチ
ンより優れており、結果として測定精。度が向上する。

しかしながら、アミロースを基質としα−アミラーゼに
グルコアミラーゼあるいはα−グルコシダーゼを共役さ
せ生成するグルコースを測定する方法に於いて、グルコ
アミラーゼあるいはα−グルコシダーゼは、α−アミラ
ーゼに関わシなくアミロースの非還元末端からα−１，
４−グリコンド結合を加水分解するエキソタイプの酵素
であるため、α−アミラーゼ反応に関係なく基質を分解
してしまう欠点を有する。この結果、測定用試液中に、
基質とグルコアミラーゼあるいはα−グルコシダーゼの
両方を含有できない、測定に充分なグルコアミラーゼあ
るいはα−グルコシダーゼを使用できない、又試薬盲検
の著しい上昇を生じる等、正確な測定法の組立てが困難
であった。

さらに、アミロースは水に対する溶解性が極めて低く、
非常に老化（ｒｅｔｒｏｇｒａｄａｔｉｏｎ　）　Ｌ易
い分子であることはよく知られている。〔デンプンノ・
ンドプック　Ｐ、５８〜９１　朝食書店（１９６１））
本発明者らはかかる欠点を有するアミロースに対し１、
アミロースのグルコース拳位６個から３５個に１個の割
合でカルボキシメチル基又はその塩を導入したもの（以
下修飾アミロースという）がアミラーゼの親和性に優れ
ており良好な基質となること、グルコアミラーゼ又はα
−グルコシダーゼの基質とならないこと、さらに水に対
する溶解性が顕著に上昇し、アミラーゼの反応に至適な
充分量の基質濃度で使用できること、水溶液での安定性
が向上することを見出し本発明を完成するに至ったもの
である。

グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼはエキソタイ
プの酵素であるため本修飾基質を基質とできない。これ
に対しα−アミラーゼはアミロースの任意のα−１，４
グ　リコシド結合を加水分解するエンド型酵素であり、
本修飾基質を基質とできるため、α−アミラーゼの酵素
作用によって修飾基質が加水分解されて非還元末端が新
たに生成する。この新たに生成した非還元末端に対して
α−グルコ／ダーゼ又はグルコアミラーゼが作用してグ
ルコースが生成し、生成したグルコース量を測定するこ
とによりα−アミラーゼ活性を知ることが出来る。

ここまでの反応式を次に示す ■ Ｇｎ−Ｇ−Ｇ〜 ｎ−Ｇ＋Ｇ−Ｇ〜 （上式中Ｇはグルコース単位、Ｘはカルボキシメチル基
またはその塩を表わし、ｎ、ｍは２以上の整数を表わす
。） グルコースの定量方法は多数知られておシ、これらの方
法のいずれも使用できることは言うまでもない。

主なグルコースの定量方法を示す。

マスグルコースにグルコースオキシダーゼヲ作用させる
と酸化され、同時に過酸化水素が生じる。

生成した過酸化水素は共存するペルオキシダーゼを介し
て色原体を定量的に酸化し、生成した酸化型色原体の呈
色を比色することにより反応液中のグルコース量を測定
することができる。以下に反応式を示す。

グルコースオキシダーゼ ブドウ糖十〇、＋Ｈ，０ Ｈ２Ｏ，＋グルコン酸 ペルオキシダーゼ Ｈｌｏ、十色原体− 酸化型色原体＋Ｈ，０ マタ、グルコースはＡＴＰ存在下へキンキナーゼによっ
てグルコース−６−リン酸となる。生成したグルコース
−６−リン酸はＮＡＤ存在下、グルコース−６−リン酸
脱水素酵素によって６−ホスホグルコノラクトンとなシ
、一方ＮＡＤは還元されＮＡＤＨとなるのでとのＮＡＤ
Ｈの３４０ｎｍ付近に於ける吸光度の増加を測定するこ
とにより、反応液中のグルコース量を測定することが出
来る。

以下に反応式を示す。

６−リン酸＋ＡＤＰ グルコース− グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤ□ ６−リン酸脱水素酵素 ６−ホスホグルコノラ クトン＋ＮＡＤＨ ＡＴＰ；アデノシン−５′−トリリン酸塩ＡＤＰ　；ア
デノシン−５′−シリン酸塩ＮＡＤ　；β−ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド ＮＡＤＨ；還元型−β−ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド のグルコアミラーゼ、又はα−グルコシダーゼを作用さ
せ生成するグルコースを測定するが、検体特に血清、尿
などの生体試料に共存するグルコースの影響を受ける可
能性があり、α−アミラーゼの反応に先行して、既存グ
ルコースを消失することは本測定法を実施する上で有効
な手段となる。

消去の方法としてはグルコースオキシダーゼ−カタラー
ゼによる方法、ヘキソキナーゼによる方法（特開昭５７
−４７４９５号公報）、グルコース−ペルオキシダーゼ
による方法等、種々の方法があり、いずれの方法も自由
に組合せることが可能である。

本発明に使用する修飾アミロースの製法についてその例
を述べると、分子量約３０００から２０万程度のアミロ
ース、水酸化ナトリウム、そしてモノクロル酢酸を水溶
液中で反応させる。アミロースのグルコース単位１モル
に対し、アルカリは５〜３０モル、モノクロル酢酸ハ０
．５〜５モルを使用する。反応は約３０〜７０℃で３０
分〜３時間加熱攪拌することにより進行する。本反応は
、Ｓ　、Ｐｅａｔ等の方法（Ｎａｔｕｒｅ、　１４．８
１０（１９４７）：１による。

次いで生成物を中和後、中性付近の水溶液中でグルコア
ミラーゼを加え３７℃で１０〜３０時間作用させ、修飾
アミロースの非還元末端、あるいハソの近辺のグルコー
スにカルボキシメチル基又はその塩が導入された修飾ア
ミロースとなる。反応の一般式を下に示す。

（ここでＧはＱｌｕｃｏｓｅ単位を示し、Ｘはカルボキ
シメチル基又は壬の塩を示す。ｎは正の整数、ｍは約５
〜３４の整数を表わす。） このグルコアミラーゼ処理は必須ではないが、測定値の
盲検値レベルを下げることに於いて有効である。

さらに反応生成物を外液に水を使用し透析する。

透析操作により、塩化ナトリウム、ハイドロキシ酢酸ナ
トリウム等の反応副生物及びグルコアミラーゼにより加
水分解されたグルコースが除去される。次いで濃縮後、
乾燥し修飾アミロースを得る。

本生成物のカルボキシメチル化アミロースのナトリウム
塩のカルボキシメチル化度はｐＩ（滴定することによシ
求めることが出来る。

アミロースに対し導入するカルボキシメチル基又はその
塩からなる修飾基の数はα−アミラーゼ活性測定の精度
、正確性の上で重要な要素となる。

アミロースへの修飾基の多過ぎる導入は、α−アミラー
ゼの作用を妨害し、グルコース５個に対し１個以上の割
合で修飾基を導入した場合、α〜アミラーゼの作用が低
下する。したがって、感度、精度、正確性を低下させる
こ′とになシ実用に耐えない。

一方、導入量が少ない場合、修飾基によるアミロースの
溶解性向上への寄与が少なく、十分な溶解度を有する修
飾アミロースが生成しない。

必要量の基質濃度を維持する為には、少なくともグルコ
ース３５個に１個以上の割合で修飾基が入っていること
が必要である。

従って修飾アミロースとしては、修飾基がアミロースの
グルコース単位６〜３５個毎に１個含有するものが用い
られる。

本発明の測定対象となる試料は、α＝ニーアミラーゼ含
有する検体なら何れを用いてもよく、例えば、生体成分
として血液、血清、尿等がある。

グルコアミラーゼ、又はα−グルコシダーゼとしては、
特に限定されないが例えば動物、微生物由来のものが利
用できる。

又、本発明、を実施する測定条件として、反応温度は特
に限定されないが、好捷しくけ約２５〜４０℃であシ、
反応時間は目的により自由に選択できる。

至適１）Ｈとしては特に限定されないが、ｐ　Ｈ約６〜
８が好ましい例である。至適ｐＨを維持する緩衝剤は自
由に使用できるが、例えば、リン酸塩トリスハイドロキ
シメチルアミノメタン−塩酸、グツドの緩衝剤などがあ
る。

さらにα−アミラーゼの賦活剤として、例えば°塩化ナ
トリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム等が使用され
る。

アミラーゼ活性の測定方法は、一定条件での反応速度を
測定するレイトアッセイ、あるいは反応停止剤を使用す
るエンドポイントアッセイとしてもよく、いずれの測定
方法も実施できる。

本発明の修飾アミロースをα−アミラーゼ活性の測定用
基質として用いることにより、以下（イ）〜（ト）の利
点を有する測定法の組立てができる。

（イ）本修飾アミロースは水に易溶なだめ、α−アミラ
ーゼ反応に充分な基質濃度を使用でき、検量関係が良好
で測定域が広い。

（ロ）本修飾アミロースはグルコアミラーゼ、α−グル
コシダーゼの基質とはならず、α−アミラーゼの特異基
質であるため副反応が起らず、試薬盲検値は極めて小さ
い。

（）→グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼの必要十
分量が使用可能なため、α−アミラーゼλ 反応以降の反応が速く、正確なレイトアッセイが可能で
ある。

に）グルコースの測定系に導ひき、測定感度が高く、精
度の良い測定法の組立てができる。

（ホ）測定操作が簡単である。

（へ）自動分析装置への適応性が良い。

（ト）測定用試液が安定である。

以下に実施例を示しさらに詳しく説明する。

実施例　１　修飾アミロースの調製 試薬 （１）　　アミロース 平均分子量約１５０，０００のアミロース（２）水酸化
ナトリウム溶液 ５０チ水酸化ナトリウム溶液を調整する。

（３）モノクロル酢酸溶液 ２５チモノクロル酢酸溶液を調整する。

ｚ（４）　　グルコアミラーゼ １（ｈｉｚｏｐｕｓ由来 実験方法 アミロース１０５’に水１５０ｍ１．水酸化ナトリウム
溶液５０ｍ１を加え、５０℃で１時間攪拌混合する。次
いで２５％モノクロル酢酸４０ｍ１を滴下し、さらに５
０℃で１時間加温する。

室温まで冷却した後、塩酸で中和し、グルコアミラーゼ
１０００単位を加え３７℃で約１５時間作用させる。

反応で副生じた塩化ナトリウム、ハイドロキシ酢酸ナト
リウム、及びグルコースを除去するため反応液を透析チ
ューブに入れ、外液にイオン交換水を使用し５０時間透
析する。

この液を濃縮後、凍結乾燥により修飾アミロースを得る
。収率は９０％であった。

本品の一定量に０．ＩＮ塩酸を加え、０．ＩＮ水酸化ナ
トリウムでｐＨ滴定を行うことによシアミロースのカル
ボキシメチル化度を求める。アミロースのグルコース単
位約２２個毎に１個の割合で、ソディウム力ルポキシメ
チレートが入っていることを確認した。

実施例　２ 試薬 （１）試液１ グツド緩衝液（Ｐ　Ｉ　ＰＥ５）　　４０ｍｍｏｌ、グ
ルコアミラーゼ５万単位、グルコースオキ７ダーゼ１０
万単位、ムタロターゼ２００単位、カタラーゼ５０万単
位、４−アミノアンチピリンＱ、　７　ｍｍｏｌ。

塩化ナトリウム１５ｍｍ０７Ｉ、塩化力ルンウム５ｍｍ
０ｌをとり精製水に溶かして水酸化ナトリウムでｐ　Ｈ
６，９とし全量を１１とする。

（２）試液２ グツド緩衝液（Ｐ　Ｉ　ＰＥ５）４０ｍｍｏｌ、ペルオ
キシダーゼ１５，０００単位、塩化ナトリウム１５　ｍ
　ｍｏｌ、塩化カルシウム５　ｍ　ｍｏｌ　ｓ実施例１
で調製した修飾アミロース３ｇ、窒化ナトリウム１５　
ｍ　ｍｏｌ、フェノールｌ　Ｑ　ｍ　ｍａｉｌをとシ精
製水に溶かして水酸化ナトリウムでｐ　Ｈ６，９とし全
量を１１とする。

測定方法 試液１の２　ｒｎｌに検体血・清２０μｌを加え、３７
℃で５分間加温する。これに試液２のｌ　ｍｌを加え、
３７℃で反応させ５０５　ｎｍに於ける２分後から５分
後までの３分間の吸光度変化（６８７分）を測定する。

別にα−アミラーゼ活性既知の標準検体を用い上記と同
様に操作して検量線を作製し、この検量線から検体のα
−アミラーゼ活性を求める。

この時の検量線を第１図に示す。

試薬盲検と血清アミラーゼの測定結果を、基質にアミロ
ースを使用したものと、修飾アミロースを使用したもの
と比較して比較例として以下に示すＯ 比較例　１ （１）試液３ 実施例２の試液１に同じ。

（２）　　試液４ 実施例２の試液２に同じ。

（３）試液５ 実施例２の試液２におけるソデイウム力ルポキシメチル
基が入ったアミロース３ｇの代わりに平均分子量１６，
０００のアミロース０．３ｇを用い、以下実施例２の試
液２に同じ。

（４）検体血清 α−アミラーゼ活性３００　Ｓｏｍｏｇｙｉ単位の血清
０測定方法 試液３の２ｍｌに検体血清２０μ１１　もう一方には精
製水２０μｌを加え、３７℃で５分間加温する。

これらに試液４のｌ　ｍｌを加え３７　”にで反応させ
、５０５　ｎｍに於ける２分後から５分後までの３分間
の吸光度変化（６Ｅ／分）を測定し、基質に修飾アミロ
ースを用いた場合の血清アミラーゼと試薬盲検の測定結
果とする。

又、試液４の代わりに試液５を使用し、以下上記と同様
に操作して基質にアミロースを用いた場合の血清アミラ
ーゼと試薬盲検の測定結果とする。

表　　　１

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２における標準検体のα−アミラーゼ
活性（Ｓｏｍｏｇｙｉ単位／ｄｌ　）と５０５　ｎｍに
於ける吸光度変化（△Ｅ／分）との検量関係を示した図
である。標準検体のα−アミラーゼ活性は５Ｑ　ＯＳｏ
ｍｏｇｙｉ単位である。 特許出願人　和光純薬工業株式会社 手続補正書 昭和５８年　ケ月３０日 特許庁長官　殿 １、　事件の表示 昭和５７年特許願第１４８７５６号 ２　発明の名称 α−アミラーゼ活性の測定方法 ３、　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 郵便番号　５４１ 連絡先　特許線（東京）　置　０３−２７０−８５７１
５、　補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 ６、　補正の内容 （１）明細書９頁１４行目から同頁１５行目にかけて記
載の「クルコースーベルオキンダーゼＪ？ｅｒクルコー
スオキンダーゼーベルオキンダーゼ」と補正する。 （２）明細書１０頁６行目に記載の「（Ｎａｔｕｒｅ＋
１４．８１’Ｏ（１９４７）ＪＪＪ＆：ｒ　ｒＮａｔｕ
ｒｅ。 １５９．８１０　（１９４７）Ｉｊと補正する。 （３）明細書１３頁２行目から同頁４打目にかけて記載
の「リン酸塩・・・・・・・緩衝剤なとがある。」ｒ「
リン酸塩、グツドの緩衝剤なとがある。」と補正する。 （４）明細書１３頁１０行目に記載の「エンドポイント
アッセイ」ヲ「ワンポイントアッセイ」ト補正する。 （５）明細書１４頁１７行目に記載の１調整する。」Ｑ
　ｒ調製する。」々補正する。 （６）明細書１４頁１９行目に記載の１調整する。」ｒ
「調！Ｊ！する。」と補正する。 以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　α−アミラーゼ活性を測定するに際し、アミ
   ロースのグルコース単位６〜３５毎にカルボキシメチル
   基（−ＣＨ，Ｃ００Ｈ）　　又はその塩を有するアミロ
   ース誘導体を基質として使用することを特徴とするα−
   アミラーゼ活性の測定方法。　・（２）　　α−アミラ
   ーゼの共役酵素としてグルコアミラーゼ又はα−グルコ
   シダーゼを用い、生成するグルコース量を測定すること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の測定方法。