JPS5931699A - α−アミラ−ゼ活性の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な基質、すなわちオリゴサツカライド誘導
体を基質として使用Ｔにとを特徴とするα−アミラーゼ
活性の測定方法に関するものである。 試別、翁にヒト生体内ａ〕唾敵、膵液、血液、尿中のα
−アミラーゼ活性は医学上の診断において重要である。 例えば、膵炎、膵臓癌、耳下腺炎においては、血液、尿
中υ）α−アミラーゼ活性は通常の値番こ比べて著しい
−１−昇を示す。 α−アミフーゼ活性υ）測定方法については、これまで
に種々の方法が発表されているが、主に、アミロクラス
チック法、クロモダニツク法、サツ力ロゲニック法の３
群に分類することができる。 アミ１１クラスチツク法のうちではキャラウェイ法が最
も広く使用されてきたが、共存タンパクがデンプンとヨ
ードの呈色を阻害するため、又反応時間が短いため再現
性が悪い等の問題点がある。 クロモダニツク法は一般にブルースターチ法と呼ばれ、
デンプン又はアミロースに色素を結合した不溶性基質を
用い酵素反応で生成する可溶性色素を測定する方法であ
る。この方法は、最近広く使用されているが、基質とし
ての活性が弱いこと、不溶性であるため反応糸が不均一
であること、繁雑な操作が必要であり自動分析装置への
満月１か困難であること等の問題点がある。 サツ力ロゲニック法ではメモジー法が代表的であるが、
試別中のグルコース番こより高飴を示す、操作が繁雑で
ある等の問題がある。 このように従来のα−アミラーゼ活性の測定方法には各
々に個有の欠点があるが、さらに共通して、基質に使用
しているデンプンの品質

【こより測定値にバラツキが生
じる、又α−アミラーゼ反応を真に化学量論的反応とし
て測定できないという欠点がある。 デンプンは広く知られるようにアミロースと呼ばれるα
−】、４結合による直鎖状のグルカンとアミロペクチン
と呼ばれるα−］、６結合による分岐を有するグルカン
の混合物である。アミロースとアミロペクチンの混合比
率、分子量、分岐度。 分岐構造は原料植物の種類、収穫時期、産地等により異
なり、不均一な混合物である。 不均一なデンプンを基質に使用する場合は、化学量論的
反応とはならず、α−アミラーゼの動力学的検知するこ
とはできない。 α−アミラーゼの動力学的検知はグルコース鎖が４個か
ら７個までのオリゴサツカライドの使用によってｆ、ｆ
される。 最近、デンプンの代わりに、マルトテトラオース、マル
トペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオ
ース等のオリゴサッカライドラ基質に０月１いる方法（
特開昭５０−５６９９８号公報。 特開昭５３−３７０９６号公報）、又はＰ−ニトロフェ
ノール等の色原体を還元末端に結合したオリゴザツカラ
イドを用いる方法（特開昭５４−５１８９２号公報）等
、均一で構造の明確な基質を用いる方法が発表されてい
る。 これらの方法では通常、測定用共役酵素としてα−グル
コシダーゼ（Ｉじ、Ｃ９”３．２．１゜２０゜α−１）
−グルコシドグルコヒドロラーゼ）又はグルコアミラー
ゼ（１弓、０．３．２．１゜３，１，４−α−１）−グ
ルカングルコヒドロラーゼ）を必要とする０ これらの共役酵素は、α−１，４−グリコシド結合を有
する糖鎖の非還元性末端からα−１，４−グリコシド結
合を加水分解するエキソタイプの酵素であり、α−アミ
ラーゼ反応に関係なく基質を分解してしまう欠点を有す
る。この結果、測定用試液が不安定であり、試薬盲検値
が極めて高く測定精度を著しく悪くしていた。さらに測
定に充分なグルコアミラーゼ、あるいはα−グルコシタ
”−ゼを使用できず、正確な測定法の組立てが国難であ
−）た〇 本発明者らはかかる欠点を有するグルコース鎖が４〜７
個のオリゴサツカライドに対し、これらのオリゴ糖の非
還元末端グルコースにカルボキシメチル基あるいはその
塩を導入した修飾オリゴ糖（以下修飾オリゴ糖と略称す
る）がα−アミラーゼの親和性に優れており、良好な基
質となること、グルコアミラーゼまたはα−グルコシダ
ーゼの基質とならないこと、水溶液での安定性が向上す
ることを発見し本発明を完成するに至った。 すなわち、本発明はα−アミラーゼ活性を測定するに際
し、グルコースが４〜７個からなる直鎖　５− 状オリゴザツカライドの非還元末端グルコース（こカル
ボキシメチル基（０１Ｔ２０００Ｈ）　　又はその塩ヲ
有するオリゴサツカライド誘導体を基質として使Ｊｌす
ることを特徴とするα−アミラーゼ活性のｉ１ｉ！Ｉ定
法である０′カルボギシメチル基の塩としては、溶解し
てカルボキシメチルイオンを与えるものが好ましく特に
限定されないが、例えば、Ｎａ　、　Ｋ。 Ｌｌ　等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩が代表例と
してあげられる。 以下、本発明について例を挙げて詳細に説明する０ グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼはエキソタイ
プの酵素であるため本修飾基質２基質とできない○こｒ
ｌ、に対しα−アミラーゼはオリゴサツカライドの任意
のα−１，４グリコシド結合を加水分解するエンド型酵
素であり、本修飾基質を基質とできるため、α−アミラ
ーゼの酵累禄用

【こまって修飾基質が加水分解されて非
還元末端が新たに生成する。この新たに生成した非還元
末端に対してα−グルコシダーゼ又はグルコアミラーゼ
　６− が作用してグルコースが生成し、生成したグルコース量
を測定することによりα−アミラーゼ活性を知ることが
出来る０ グルコースの定量方法は多数知られており、これらの方
法のいずれも使用できることは言うまでもない。 主なグルコースの定量方法を示す。 マずグルコースにグルコースオキシタ”−セを作用させ
ると酸化され、同時に過酸化水素が生じる。 生成し１こ過酸化水素は共存するペルオキシダーゼを介
して色原体分定量的に酸化し、生成した酸化型色原体の
呈色を比色することにより反応液中のグルコース量を測
定することができる。以下に反応式を示す。 ブドウ糖＋０２　＋Ｉ−Ｔ２０−乙ｌ二已二二二ノ二人
長二！二二±→Ｈ２Ｏ２＋グルコン酸 ）ｂ　Ｏ！　＋　色原体さノとオノとヱ二と二二ボ→酸
化型色原体＋１１２０ ま１こ、グルコースはＡＴＰ存在下ペキソチナーゼによ
ってグルコース−６−リン酸となる〇生＋１ｖ、Ｌ／た
グルコース−６−リン酸はＮＡＤ存在下。 グルコース−６−リン酸脱水素＃累によって６−ホスホ
グルコノラクトンとなり、一方ＮＡＤは還元さイｉ、　
Ｎ　Ａ　ｌ）　Ｉ（となるのでこのＮ　Ａ　Ｉ）　Ｈの
３４０ｎｎｌ付近に於ける吸光度の増加を測定すること
により１反応曲中のグルコースｆＦを測定することが出
来る。以下に反応式を示す。 ＭｇＩ＋ ６−リン酸＋ＡＤＰ グルコース− グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤ□ ６−リン酸脱水累＃、素 ６−ホスホグルコノラ クトン＋ＮＡｎＨ ＡＴＰ＋アデノシン−５′−トリリン＃塩ＡＤＰＩアデ
ノシン−５′−シリン酸塩Ｎ　Ａ　Ｉ）　Ｉβ−ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈｌ還元型−β−ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド 本修飾オリゴ糖を用いたα−アミラーゼ活性測定法に於
いて、α−アミラーゼに次いで共役酵素のグルコアミラ
ーゼ、又はα−グルコシダーゼを作用させ生成するグル
コースを測定するが、検体特に血清、尿などの生体試料
に共存するグルコースの影響を受ける可能性があり、α
−アミラーゼの反応に先行して、既存グルコースを消去
することは本測定法を実施する上で有効な手段となる。 消去の方法としてはグルコースオキシダーゼ−カタラー
ゼによる方法、ヘキソキナーゼによる方法（％開昭５７
−４７４９５号公報）、グルコース−ペルオキシダーゼ
ｌこよる方法等、種々の方法があり、いずれの方法も自
由に組合せることが可能である。 また本修飾オリゴ糖２基質とし、α−アミラーゼを作用
させ生成するマルトースを測定することによりα−アミ
ラーゼ活性を測定することができる。マルトースの測定
は、例えば特開昭５２−１１９２９６に記載の測定系に
よる０　。 −９二 本発明に使用する修飾オリゴ糖の製法についてその例を
述べるさ、分子量約１５０００から２０万のアミロース
、水酸化ナトリウム、そしてモノクロル酢酸を水溶液中
で反応させる０アミロースのグルコース単位１モルに対
し、アルカリは５〜３０モル、モノクロル酢酸は約０５
〜２５モルを使用する０反応は約３０〜７０℃で３０分
〜３時間加熱攪拌することにより進行する。本反応によ
応はＳ、Ｔ’ｃａ１等の方法（Ｎａｔｕｒｅ、　１４　
、８１０（１９４７））による。 次いで生成物を中和後、外液に水を使用し透析する。透
析操作ｌこより、塩化ナトリウム、ハイドロキシ酢酸ナ
トリウム等の反応副生成物が除去される０本液をｐ　Ｉ
Ｔ約５〜７程度の緩衝液に加え、ざらにα−アミラーゼ
を加え３７℃で一定時間反応させる。 反応後、反応′ＮＩＬを７０℃以上の温度で、３０〜６
（）分別熱し、α−アミラーゼを失活させる。加１０− 熱処理後、反応液を約２（）℃程度まで冷却させ、液の
ｐＨを６〜８θ〕中性に調整後、α−グルコシダーゼ又
はグルコアミラーゼを加え、３７℃で１０〜３０時間作
用させ、α−アミラーゼの作用により生成した修飾オリ
ゴ糖（オリゴ糖も含む）の非還元末端からα−１，４−
グリコンド結合Ｈ−分解し、カルボキシメチル基あるい
はその塩が非還元末端グルコース番こ入った修飾オリゴ
糖をうる。 この反応の一般式を下に示す。 Ｇｎ−Ｇ−Ｇｍ　（ＧＬ　ｆ含有する混合物）次に、こ
の混合物を濃縮し、Ｈ、Ｋｏｎｄｏらの方法（Ａｇｒｉ
ｃ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、　、　４５　、２３
６９　（１９８］）ｌ）に従いゲル濾過によるクロマト
グラフィーで、修飾オリゴ糖、即ち、カルボキシメチル
基又はその地が非還元末端に入ったマルトテトラオース
、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘ
プタオースの各分画を得ることができる。 本製法番こ於いて、出発原料としてα−１，４−グリコ
シド結合を有する長鎖の糖としてアミロースを使用した
が、デンプン、デキストリンも同様に原料として使用可
能である。 また、修飾アミロースをオリゴ糖にカロ水分解するα−
アミラーゼは、例えば、動物の膵臓、微生物由来のα−
アミラーゼを使用することができるが、特に限定される
ものではない。 １１＋＋ｃｉｌｌ＋＋ｓ　＋ｓｔ＋ｂＬｉｉｉｓ由来の
液化夕゛イブのアミラーゼは、グルコース鎖１０個程度
のオリゴ糖の状態で反応を停市、あるいは極めて反応を
遅くさせる１こめ、生成物をコントロールするのが容易
であり有効【こ使用することができる。 本発明の修飾オリゴ糖をα−アミラーゼ活性測定用基質
として用いる測定法は、以下の利点がある０ まず５本発明に使用する修飾オリゴ糖は、グルコアミラ
ーゼ、又はα−グルコシダーゼの基質とはならない為、
α−アミラーゼの特異基質となり、副反応が起らす試薬
盲検値は極めて小さく、又、単一の化合物を基質とする
ことから、反応の化学量論が成立し、α−アミラーゼの
動力学を検知することができる。 グルコアミラーゼ、又はα−グルコシダーゼの充分量が
使用可能となり、α−アミラーゼ反応以降の反応が速く
、正確なレイトアッセイが可能である。 その他に、本修飾オリゴ糖は六番こ易溶でα−アミラー
ゼとの反応性が高い、測定用試液が安定である、自動分
析装置への適応性が良いなどがあげられる。 本発明の測定対象となる試料は、α−アミラーゼを含有
する検体なら何れを用いてもよく、例えば生体成分とし
て血液、血清、尿等があげられる。 グルコアミラーゼ、又はα−グルコシダーゼとしては、
特に限定されないが例えば動物、微生物由来のものが利
用出来る。 １３− 又、本発明を実施する１ｌｌｌ定条件として、反応温度
は特に限定されないが、好ましくは約２５〜４０　℃で
あり、反応時間は目的により自由に選択できる。 至適ｐ　ＩＴとしては特に限定されないが、ｐＨ約６〜
８が好ましい例である。至適ｐ　Ｈを維持する緩衝剤は
自由に使用できるが、例えば、リン酸塩トリスハイドロ
キシメチルアミノメタン−塩酸、グツドの緩衝剤などが
ある。 ざらにα−アミラーゼの賦活剤として、例えば塩化すト
リウム、塩化カルシウム、塩化カリウム等が使用される
。 アミラーゼ活性の測定方法は、一定条件での反応速度を
測定するレイトアッセイ、あるいは反応停止剤を使用す
るエンドポイントアッセイとしてもよく、いずれの測定
方法も実施できる。 以下に実施例を示す。 実施例　】　修飾オリゴ糖の調製 試薬 （１）　　アミロース １４− 平均分子量約１５０，０００のアミロース（２）　　水
酸化ナトリウム溶液 ５０％水酸化す）　ＩＪウム溶液を調整する。 （３）　　モノクロル酢酸溶液 ２５％モノクロル酢酸溶液を調整する。 （４）　　リン酸緩衝液 ｐ　Ｈ５，５（１り　４０　ｍ　Ｍリン酸緩衝液合調整
する。 （５）　　アミラーゼ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ由来のアミラーゼ
（６）　　グルコアミラーゼ Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ由来 実験方法 アミロース１０ｇに水１５０ｍ／、水酸ｔヒナトリウム
溶液５　Ｑ　ｍｅ　ｆ加え、５０℃で１時間攪拌混合す
る。次いでモノクロル酢酸４０ｍ１を滴下し、５０℃で
１時間加温する。 室温まで冷却した後、塩酸で中和し、外液にイオン交換
水を使用し透析する。透析は５〜１０℃で３０時間行う
。 水液を限外濾過により約１００　Ｉ＋／に濃縮し、リン
酸緩価’Ｒ１ｌ　Ｏ（ｌ　ｍｅに加え、さらにアミラー
ゼ１０００単位を加えて：う７℃で１時間反応させる。 反応後、反応液を１（）０℃で３０分間加熱し、α−ア
ミラーゼを失活させ、約２０℃まで冷却する０ 冷却後、液性をｐ　Ｉｆ　７．０に調整し、グルコアミ
ラーゼ］　００　（１単位を加え、３７℃で４０時間反
応させる〇 この液ヲ議縮し、ゲル濾過によるクロマトグラフィーを
行い各分画を分離精製する。充填剤は親水性ビニル、ポ
リマーゲル、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、ＨＷ−４ｏｓｔｂ溶
出液昏こは０．１Ｍ塩化ナトリウムを使用する〇 凍結乾燥後、ゲル濾過により得られた各分画を１）、　
Ｊ　、　Ｍａｎｎｅｒｓらの方法（０ａｒｂｏｈｙｄ、
　Ｉ（ｅｓ、　１７（１９７］１１０９−１１４）に従
いグルコース重イ千度を、又、ｐｌＩ滴定により各分画
のカルボキシメチル化度を求める０ グルコース数が４〜７個からなる直鎖状オリゴザツカラ
イド、カルボキシメチル基が１ケ含まれた修飾オリゴ糖
の各画分２α−アミラーゼ測定用基質とする。 拳法で得たグルコース数４〜７個の修飾オリゴ糖は、α
−アミラーゼの基質となり加水分解作用を受けるが、い
ずれの修飾オリゴ糖もグルコアミラーゼ、またはα−グ
ルコシダーゼの基質トはならない。 実施例　２ 試薬 ＋１１　　試液１ グツド緩衝液（ＰＩＰｇＳ１４０ｍｍｏｔ、グルコアミ
ラーゼ５万単位、ダルコースオキシｌ−−セ１０万単位
、ムタロターゼ２０００単位、カタラーゼ５０万単位、
４−アミノアンチピリン０．７ｍｍｏｌ　ｓ塩化ナトリ
ウム１５ｍｍｏｔ、塩化カルシウム５　ｍ　ｍａｔをと
り精製水に溶かして水酸化す）　ＩＪウムでｐ　Ｈ６，
９とし全量を１ｔとする０（２）試液２ グツド緩衝液（ＰＩＰＥＳ）４０ｍｍｏｔ、ペルオキシ
ダーゼ１５，０００単位、塩化ナトリウムｌ１７− ５　ｍ　ｍｒ＋ｔ、塩化カルシウム５　ｍ　ｍｏｔ、非
還元末端にソディウム力ルボキシメチル基が入ったマル
トヘキザオース３ｇｓ窒化ナトリウム１５ｍｍｏｔ。 フェノール］　Ｏｍ　ｍｎＬをとり精製水に溶かして水
酸化すＩ・リウムでｐ　ｔＴ　６．９とし全量ｉ１ｔと
する〇測定方法 試液１，２ＩＩＩ／に検体血清２０μＬを加え、３７℃
で５分間力０温する。これに試液２，１ｍ／ｉｐ加え、
３７℃で反応させ５０５　ｎｍに於ける２分後から５分
後までの３分間の吸光度変化（ΔＥ／分）を測定する〇 別にα−アミラーゼ活性既知の標準検体を用い、上記と
同様に操作して検量線を作製し、この検量線から検体の
α−アミラーゼ活性を求める。 この時の検量線を第１図に示す。 又、実施例２による試薬盲検値の吸光度変化と、基質に
マルＩ・ヘキサオースを用いた場合の吸光度変化の比較
を比較例として以下に示す。 ＝１８− 比較例　１ 試薬 （１１試液３ 実施例２の試液１に同じ。 （２）試液４ 実施例２の試液２１こ同じ。 （３）　　試液５ 実施例２の試液２１こおけるソディウム力ルボキシメチ
ル基が入ったマルトヘキサオースの代わりにマルトヘキ
サオースを用い、以下実施例２の試液２に順じる。 測定方法 試液３．２ｍｌに水２０　ｌｉｔ　ｆ加え、３７℃で５
分間加温する。これに試液４、］＋＋＋ｌを加え、３７
℃で３分間反応させ５０５　ｎｍ　ｌこ於ける吸光度変
化（６８７分）を測定する。又別に、試液４の代わりに
試液５を用い以下同様にして測定する。その結果を表１
に示す。 表　　　　　１

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２に於ける標準検体のα−アミラーゼ
活性（Ｓｎｍｏｇｙｉ単位／ｄｔ）と５０５　ｎｍの吸
光度変化（６８７分）との検量関係を示した図である。 γこだし、標準検体のα−アミラーゼ活性は５００　Ｓ
ｏｍｏｇｙｉ単位である。 特許出願人　和光純薬工業株式会社 手続補正書 昭和５７年　と月３７日 ２　発明の名称 α−アミラーゼ活性の測定法 ３、　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 郵便番号　５４１ 連絡先　　特許課（東京）　置　０３−２７０−８５７
１自　　　　発 ５　袖市の利尿 明細ＩＩの発明の詳細な説明の欄。 ６、　袖ｉト、の内容 （１）明細ｄＦ　７百１９行目から同頁２０行目にかけ
て記載の「ヘギソチナーゼによって」？「ヘキソキナ一
ゼによって」と補正する。 （２）明細１０１７頁１３行目に記載の１ムタロターセ
２０００ノ）１位−１ｒ２　［ムタｏ　ター　セ２　（
１０単位」と補庄゛する。 以」＝

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　α−アミラーゼ活性を測定するに際し、グルコ
   ースが４〜７個からなる直鎖状オリゴサツカライドの非
   還元末端グルコースに、カルボキシメチル基１　０Ｉ４
   ０００Ｈｌ又はその塩を有するオリゴサツカライド誘導
   体を基質として使用すること２特徴とするα−アミラー
   ゼ活性の測定法０
2. （２）　　α−アミラーゼの共役酵素として、グルコア
   ミラーゼ、又はα−グルコシダーゼを用い、生成するグ
   ルコースを測定することによりα−アミラーゼ活性を測
   定することを特徴とする特許請求の範囲第一項記載の測
   定法。