JP2000189194A

JP2000189194A - α―アミラ―ゼ活性測定試薬及び測定方法

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Publication number: JP2000189194A
Application number: JP37718498A
Authority: JP
Inventors: Nobuo Hisae; 信雄久江
Original assignee: Shino Test Corp
Current assignee: Shino Test Corp
Priority date: 1998-12-30
Filing date: 1998-12-30
Publication date: 2000-07-11

Abstract

(57)【要約】【目的】試料中にヘモグロビンが存在したとしても、そ
の試料のα−アミラーゼ活性測定値に、ヘモグロビンの
存在に由来する負誤差が生じるのを抑制することがで
き、正確なα−アミラーゼ活性値を得ることができる、
試料中のα−アミラーゼ活性測定試薬及び測定方法を提
供する。【構成】修飾マルトオリゴ糖を基質として用いる試料中
のα−アミラーゼ活性測定試薬及び測定方法において、
下記一般式（Ｉ）【化１】よりなる構造の非イオン性界面活性剤を含有、又は存在
させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、修飾マルトオリゴ
糖を基質として用いる、試料中のα−アミラーゼ活性を
測定するための測定試薬及び測定方法において、特定の
非イオン性界面活性剤を含有又は存在させたものであ
り、試料中のヘモグロビンの測定値への影響を回避する
ものである。本発明は、特に、化学、生命科学、及び臨
床検査分野等の分野において有用なものである。

【０００２】

【従来の技術】α−アミラーゼ［Ｅ．Ｃ．３．２．１．
１］は、澱粉又はグリコーゲン等の糖質中のグルコース
単位間のα−１，４グリコシド結合を加水分解するエン
ド型加水分解酵素である。このα−アミラーゼは、人体
中では主として膵臓及び唾液腺で産生され、急性膵炎又
は流行性耳下腺炎発症時に血清、血漿又は尿等中の活性
値が上昇することから、その活性の測定が疾患の診断の
場で広く行われている。

【０００３】従来より、α−アミラーゼ活性測定方法と
しては、α−アミラーゼに澱粉を基質として反応させ
て、残存する澱粉の量をヨード澱粉反応により測定する
アミロクラスティック（Ａｍｙｌｏｃｌａｓｔｉｃ）
法、α−アミラーゼによって分解生成される糖の還元能
を測定するサッカロジェニック（Ｓａｃｃｈａｒｏｇｅ
ｎｉｃ）法又はα−アミラーゼに色素を結合させた澱粉
を基質として反応させて、これにより遊離する色素結合
オリゴ糖の量を測定するクロモジェニック（Ｃｈｒｏｍ
ｏｇｅｎｉｃ）法等が知られているが、これらの測定方
法はいずれも操作が煩雑であって、測定の再現性が悪い
などの問題点を有していた。

【０００４】そこで、近年、マルトペンタオースやマル
トヘプタオース等のマルトオリゴ糖の還元末端に置換さ
れたフェニル基等を結合させた修飾マルトオリゴ糖を基
質として用い、α−グルコシダーゼ、又はα−グルコシ
ダーゼ並びにβ−グルコシダーゼを、共役酵素として利
用する測定方法が開発された。しかしながら、この測定
方法は、測定試薬に含まれるα−グルコシダーゼ等の共
役酵素により基質が分解され、測定試薬の保存中又は測
定中に試薬ブランク値が上昇して、測定試薬の性能が劣
化するという問題点を有していた。

【０００５】この問題点を解決するためにマルトペンタ
オースやマルトヘプタオース等のマルトオリゴ糖の非還
元末端をアルキル基等で修飾し、かつ還元末端に置換さ
れたフェニル基等を結合させた、修飾マルトオリゴ糖を
基質として用い、α−グルコシダーゼ、又はα−グルコ
シダーゼ並びにβ−グルコシダーゼ、或いはこれらの酵
素とグルコアミラーゼを、共役酵素として使用する測定
方法が考え出された。

【０００６】しかしながら、この測定方法は、α−グル
コシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコアミラーゼ
等の共役酵素を必要とするため、直接α−アミラーゼ活
性を測定することが出来ず、測定反応が定常状態となっ
て測定可能となるまでに時間がかかり、（ラグフェーズ
を有し）、共役酵素中に不純物として含まれている微量
のα−アミラーゼにより、測定値が正の誤差を受け、か
つ、共役酵素を添加するため測定のコストが高いものに
なる、等の問題点を有していた。

【０００７】そのため、共役酵素を使用しないα−アミ
ラーゼ活性測定方法として、マルトトリオース又はマル
トースの還元末端に、置換された４−ニトロフェニル基
又は置換されたナフチル基を結合させた、２−クロロ−
４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド（以
下、Ｇ３ＣＮＰと略記することがある）又は４−クロロ
−２−ニトロ−１−ナフチル−α−Ｄ−マルトトリオシ
ド等の修飾マルトトリオース又は修飾マルトース等を基
質として用いる方法や、マルトオリゴ糖の還元末端及び
非還元末端を特定の官能基により誘導体化した、４，６
−Ｏ−エチリデン−２−クロロ−４−ニトロフェニル−
α−Ｄ−マルトトリオシド等の修飾マルトトリオース又
は修飾マルトース等を基質として用いる方法等が開発さ
れている。

【０００８】ところで、これらの方法を用いて試料中の
α−アミラーゼ活性を測定する場合、測定試薬と試料を
混合し、その後、波長４００〜４５０ｎｍでの吸光度変
化の測定結果からα−アミラーゼ活性を求める方法が一
般的である。しかし、この場合、試料中に溶血作用によ
り生成したヘモグロビンが存在していると、このヘモグ
ロビンが光や熱等により分解して、４００〜４５０ｎｍ
の測定波長域における吸光度の経時的な減少を引き起こ
し、その結果、α−アミラーゼ活性の測定値に負誤差を
与えるため、試料中のα−アミラーゼ活性測定値を正確
に測定することができないという問題があった。

【０００９】このヘモグロビンの影響を抑制する方法と
しては、従来、測定試薬にチオ尿素を含有させる方法
（特公平６−１２９９８号公報）や、ピリジン類、イミ
ダゾール類、ヒスタミン類を含有させる方法（特公平３
−５６４２５号公報）や、アルキルスルホン酸塩などを
含有させる方法（特公平３−５８４６７号公報）等が知
られているが十分ではなかった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記の従来
技術における問題点に鑑み、修飾マルトオリゴ糖を基質
として、試料中のα−アミラーゼ活性を測定する際に、
試料中のヘモグロビンによる測定値への負誤差が生じる
のを防ぐことにより、正確な測定値を得ることができる
測定試薬及び測定方法の提供を目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者は、前記目的を
達成するために、鋭意検討を行った結果、下記の一般式
（Ｉ）よりなる構造の非イオン性界面活性剤を、修飾マ
ルトオリゴ糖を基質として用いる、試料中のα−アミラ
ーゼ活性を測定する測定試薬又は測定系に含有させるこ
とにより、試料中のヘモグロビンによる測定値への負誤
差を抑制させることを確認して、本発明を完成するに至
った。

【００１２】従って、本発明は、修飾マルトオリゴ糖を
基質として含む、試料中のα−アミラーゼ活性測定試薬
において、下記一般式（Ｉ）

【化５】よりなる構造の非イオン性界面活性剤を含有することを
特徴とする、試料中のα−アミラーゼ活性測定試薬であ
る。

【００１３】そして、本発明の測定試薬においては、一
般式（Ｉ）よりなる構造の非イオン性界面活性剤が、下
記一般式（ＩＩ）

【化６】よりなる構造の非イオン性界面活性剤であることが好適
である。

【００１４】更に、本発明の測定試薬においては、修飾
マルトオリゴ糖が、２−クロロ−４−ニトロフェニル−
α−Ｄ−マルトトリオシドであることが好適である。

【００１５】また、本発明は、修飾マルトオリゴ糖を基
質とする、試料中のα−アミラーゼ活性測定方法におい
て、試料中のα−アミラーゼと前記基質の反応時に、下
記一般式（Ｉ）

【化７】よりなる構造の非イオン性界面活性剤を存在させること
を特徴とする、試料中のα−アミラーゼ活性測定方法で
ある。

【００１６】そして、本発明の測定方法においては、一
般式（Ｉ）よりなる構造の非イオン性界面活性剤が、下
記一般式（ＩＩ）

【化８】よりなる構造の非イオン性界面活性剤であることが好適
である。

【００１７】更に、本発明の測定方法においては、修飾
マルトオリゴ糖が、２−クロロ−４−ニトロフェニル−
α−Ｄ−マルトトリオシドであることが好適である。

【００１８】

【発明の実施の形態】〔１〕 α−アミラーゼ活性測定
試薬（１）試料本発明の試料中のα−アミラーゼ活性測定試薬における
試料とは、α−アミラーゼを含むことが推測され、その
試料中のα−アミラーゼの存在の有無の測定、又はα−
アミラーゼ活性値の測定を行おうとするもののことであ
り、このようなものであれば特に限定されない。

【００１９】例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血
漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体
液；ヒト若しくは動物の膵臓、肝臓等の臓器、毛髪、皮
膚、爪、筋肉、又は神経組織等の抽出液；ヒト又は動物
の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞の抽出液；植物の抽出
液等が挙げられる。

【００２０】（２）基質である修飾マルトオリゴ糖本発明において、試料中のα−アミラーゼ活性測定試薬
に含ませる基質としては、修飾マルトオリゴ糖が用いら
れる。ここでいう修飾マルトオリゴ糖とは、マルトオリ
ゴ糖の還元末端及び／又は非還元末端などが官能基で修
飾されたものである。

【００２１】例えば、マルトオリゴ糖の還元末端に置換
されたフェニル基等を結合させた化合物であり、例とし
て、２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルト
トリオシド、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプ
タオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−
マルトヘプタオシド、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マ
ルトヘキサオシド、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マル
トペンタオシド、又は２−クロロ−４−ニトロフェニル
−α−Ｄ−マルトペンタオシド等を挙げることができ
る。

【００２２】また、この修飾マルトオリゴ糖の例とし
て、マルトオリゴ糖の非還元末端をアルキル基等で修飾
し、かつ還元末端に置換されたフェニル基等を結合させ
た化合物を挙げることができ、例えば、４，６−Ｏ−エ
チリデン−２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−
マルトトリオシド、４，６−Ｏ−ジメトキシメチリデン
−２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトト
リオシド、４，６−Ｏ−イソプロピリデン−２−クロロ
−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド、４
⁵−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−２−クロロ−４
−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトシド、４，６−Ｏ−
ベンジリデン−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘ
プタオシド、４，６−Ｏ−エチリデン−４−ニトロフェ
ニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシド、４⁵−Ｏ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシル−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−
マルトペンタオシド、４，６−Ｏ−（３−ケトブチリデ
ン）−２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マル
トヘプタオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル６⁵
−アジド−６⁵−デオキシ−β−Ｄ−マルトペンタオシ
ド、６−Ｏ−ベンジル−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−
マルトペンタオシド、又は４⁵−Ｏ−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシル−２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ
−マルトテトラオシド等を挙げることができる。

【００２３】本発明における、試料中のα−アミラーゼ
活性測定試薬に含ませる基質（修飾マルトオリゴ糖）と
しては、特に、２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−
Ｄ−マルトトリオシド、４，６−Ｏ−エチリデン−２−
クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシ
ド、４，６−Ｏ−ジメトキシメチリデン−２−クロロ−
４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド、４，
６−Ｏ−イソプロピリデン−２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド、若しくは４⁵−Ｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−２−クロロ−４−ニト
ロフェニル−β−Ｄ−マルトシドなどの、修飾マルトト
リオース、又は修飾マルトース等が好適である。

【００２４】本発明において、前記修飾マルトオリゴ糖
をα−アミラーゼ活性測定試薬に基質として含ませて、
α−アミラーゼ活性の測定を行う場合には、α−アミラ
ーゼ活性測定試薬中の基質濃度は、０．０５〜１００ｍ
Ｍの範囲にあることが好ましく、０．１〜５０ｍＭの範
囲が特に好ましい。

【００２５】（３）一般式（Ｉ）よりなる構造の非イオ
ン性界面活性剤本発明は、修飾マルトオリゴ糖を基質として含む、試料
中のα−アミラーゼ活性測定試薬において、前記の一般
式（Ｉ）よりなる構造の非イオン性界面活性剤を含有す
ることを特徴とするものである。なお、本発明におい
て、非イオン性界面活性剤とは、水溶性であって、イオ
ンに解離する基を有しない界面活性剤をいう。

【００２６】本発明においては、前記の一般式（Ｉ）よ
りなる構造の非イオン性界面活性剤が、前記の一般式
（ＩＩ）よりなる構造の非イオン性界面活性剤であるこ
とが好ましい。なお、前記の一般式（ＩＩ）よりなる構
造の非イオン性界面活性剤としては、例えば、日本サー
ファクタント工業社製のＴＭＨ−７ＥＸ（商品名）が知
られている。

【００２７】本発明における、前記の一般式（Ｉ）より
なる構造の非イオン性界面活性剤のα−アミラーゼ活性
測定試薬中における含有濃度は、０．０１〜４．０％の
範囲にあることが好ましく、０．０５〜１．０％の範囲
が特に好ましい。

【００２８】（４）試薬の構成本発明のα−アミラーゼ活性測定試薬は、１試薬のもの
でもよいが、必要に応じて２試薬以上に試薬成分を分け
て構成してもよい。

【００２９】（５）α−アミラーゼ活性測定時のｐＨ本発明において、α−アミラーゼ活性測定時の測定反応
液のｐＨは、例えば、基質として修飾マルトトリオース
又は修飾マルトースを用いる場合は、ｐＨ５．５〜７．
０の範囲が好ましく、修飾マルトヘプタオース、修飾マ
ルトペンタオース、又は修飾マルトテトラオースを用い
る場合は、ｐＨ６．５〜８．０の範囲が好ましい。

【００３０】α−アミラーゼ活性測定試薬が１試薬であ
る場合は、α−アミラーゼ活性測定試薬のｐＨを前記の
範囲のｐＨとすればよく、２試薬以上である場合には、
それらの試薬を測定時の所定の混合比率で混合した時
に、前記の範囲のｐＨとなるよう各試薬のｐＨを定めれ
ばよい。

【００３１】（６）試薬の構成成分本発明におけるα−アミラーゼ活性測定試薬には、基質
である修飾マルトオリゴ糖、及び前記の一般式（Ｉ）よ
りなる構造の非イオン性界面活性剤の他に、緩衝剤、共
役酵素、α−アミラーゼなどの活性化剤、安定化剤、防
腐剤、又は他の界面活性剤等を含有させることができ
る。

【００３２】（７）緩衝剤緩衝剤としては、前記のｐＨ範囲に緩衝能がある緩衝剤
を適宜用いることができる。

【００３３】例えば、ｐＨ５．５〜７．０の範囲に緩衝
能がある緩衝剤としては、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、
ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、
ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、又はＴｒ
ｉｓ等を挙げることができる。

【００３４】また、ｐＨ６．５〜８．０の範囲に緩衝能
がある緩衝剤としては、例えば、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、Ｔ
ＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳ
Ｏ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃ
ｉｎｅ、ＴＡＰＳ、又はＴｒｉｓ等を挙げることができ
る。

【００３５】（８）α−アミラーゼの活性化剤本発明の測定試薬には、α−アミラーゼの活性化剤を含
有させてもよい。このα−アミラーゼの活性化剤とは、
α−アミラーゼの活性化の効果を有する化合物であり、
例えば、カルシウムイオン又は塩化物イオンを含む化合
物を挙げることができ、より具体的には、酢酸カルシウ
ムや塩化ナトリウム等を挙げることができる。

【００３６】これらの活性化剤を含有させる場合の濃度
としては、カルシウムイオンが０．５ｍＭ以上、塩化物
イオンが１０ｍＭ以上であれば好ましい。

【００３７】更に、本発明のα−アミラーゼ活性測定試
薬中に、α−アミラーゼの活性化剤として、アルカリ金
属のアジ化物、又はチオシアン酸塩等を含有させてもよ
い。

【００３８】具体的には、例えば、アジ化リチウム、若
しくはアジ化ナトリウム等のアジ化物であれば、０．１
〜１０％含有させることが好ましく、またチオシアン酸
ナトリウム、若しくはチオシアン酸カリウム等のチオシ
アン酸塩であれば、１００〜４，０００ｍＭ含有させる
ことが好ましく、５００〜３，０００ｍＭ含有させるこ
とが特に好ましい。

【００３９】（９）共役酵素本発明のα−アミラーゼ活性測定試薬には、必要に応じ
て、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、又はグ
ルコアミラーゼ等の共役酵素を含有させてもよい。

【００４０】これらの共役酵素を測定試薬に含有させる
酵素活性値は、酵素活性測定方法により酵素活性値が異
なるので一概に示すことはできないが、適宜共役反応に
十分な量を含有させればよい。

【００４１】（１０）防腐剤そして、本発明のα−アミラーゼ活性測定試薬には、ア
ジ化ナトリウムなどの防腐剤等を含有させてもよい。

【００４２】〔２〕 α−アミラーゼ活性測定方法（１）本発明の測定方法本発明の試料中のα−アミラーゼ活性測定方法は、修飾
マルトオリゴ糖を基質とする、試料中のα−アミラーゼ
活性測定方法において、試料中のα−アミラーゼと前記
基質の反応時に、前記の一般式（Ｉ）よりなる構造の非
イオン性界面活性剤を存在させることを特徴とするもの
である。

【００４３】前記のα−アミラーゼ活性測定試薬と同様
に、α−アミラーゼ活性測定方法においても、前記の一
般式（Ｉ）よりなる構造の非イオン性界面活性剤が、前
記の一般式（ＩＩ）よりなる構造の非イオン性界面活性
剤であることが好ましい。

【００４４】本発明のα−アミラーゼ活性測定方法にお
いても、前記の測定試薬の場合と同様に、試料中のα−
アミラーゼ活性測定試薬に含ませる基質（修飾マルトオ
リゴ糖）としては、特に、２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル−α−Ｄ−マルトトリオシドなどの、修飾マルトト
リオース、又は修飾マルトース等が好適である。

【００４５】なお、本発明の試料中のα−アミラーゼ活
性測定方法における、試料、基質である修飾マルトオリ
ゴ糖、前記の一般式（Ｉ）よりなる構造の非イオン性界
面活性剤、試料中のα−アミラーゼの活性測定に用いる
α−アミラーゼ活性測定試薬、α−アミラーゼ活性測定
時のｐＨ、緩衝剤、α−アミラーゼなどの活性化剤、共
役酵素、及び防腐剤等については、前記「〔１〕α−ア
ミラーゼ活性測定試薬」の項での記載と同様である。

【００４６】（２）測定方法の具体例本発明におけるα−アミラーゼ活性測定方法の一例を具
体的に述べると、まず、修飾マルトオリゴ糖を基質とし
て含むα−アミラーゼ活性測定試薬とα−アミラーゼを
含有すると推測される試料とを混合し、前記の試料中に
含有されるα−アミラーゼを前記の修飾マルトオリゴ糖
と反応させる。そして、この反応時に前記の一般式
（Ｉ）よりなる構造の非イオン性界面活性剤を存在させ
る。

【００４７】なお、α−グルコシダーゼ、β−グルコシ
ダーゼ、又はグルコアミラーゼ等の共役酵素を必要とす
る場合には、更にこれらの共役酵素とも反応させる。そ
して、この（これらの）反応により修飾マルトオリゴ糖
から還元末端側の置換されたフェニル基等を遊離させ、
この遊離した置換されたフェノール等の量を測定するこ
とにより試料中のα−アミラーゼの活性の測定を行う。

【００４８】基質である修飾マルトオリゴ糖が、修飾マ
ルトトリオース又は修飾マルトース等の場合は、基質で
ある修飾マルトオリゴ糖を、α−アミラーゼを含有する
と推測される試料と混合、接触させると、この試料中に
含有されるα−アミラーゼによって修飾マルトオリゴ糖
の糖とアグリコン（置換されたフェノール等）の間のグ
リコシド結合が直接加水分解され、マルトオリゴ糖又は
非還元末端修飾マルトオリゴ糖と、２−クロロ−４−ニ
トロフェニル基又は４−ニトロフェニル基等の置換され
たフェニル基等に分離し、遊離する。

【００４９】ここで遊離した２−クロロ−４−ニトロフ
ェノール又は４−ニトロフェノール等の置換されたフェ
ノール等は、４００ｎｍ付近において吸収を示すので、
これを分光光度計を用いて吸光度を測定すること等によ
り、遊離した置換されたフェノール等の量を求め、これ
により試料中のα−アミラーゼ活性の算出を行うことが
できる。

【００５０】また、基質である修飾マルトオリゴ糖が、
修飾マルトヘプタオース、修飾マルトペンタオース、又
は修飾マルトテトラオース等の場合は、基質である修飾
マルトオリゴ糖を、α−アミラーゼを含有すると推測さ
れる試料と混合、接触させると、この試料中に含有され
るα−アミラーゼによって修飾マルトオリゴ糖の糖と糖
の間のグリコシド結合が加水分解され、よりグルコース
残基数が小さな還元末端修飾マルトオリゴ糖と、マルト
オリゴ糖又は非還元末端修飾マルトオリゴ糖が生成す
る。

【００５１】そして、この還元末端修飾マルトオリゴ糖
は、共存する前記の共役酵素によって、糖と糖の間のグ
リコシド結合、又は糖とアグリコン（置換されたフェノ
ール等）の間のグリコシド結合が加水分解されて、グル
コースと、２−クロロ−４−ニトロフェニル基又は４−
ニトロフェニル基等の置換されたフェニル基等に分離
し、遊離する。

【００５２】ここで遊離した２−クロロ−４−ニトロフ
ェノール又は４−ニトロフェノール等の置換されたフェ
ノール等は、４００ｎｍ付近において吸収を示すので、
先の場合と同じように、これを分光光度計を用いて吸光
度を測定すること等により、遊離した置換されたフェノ
ール等の量を求め、これにより試料中のα−アミラーゼ
活性の算出を行うことができる。

【００５３】本発明における試料中のα−アミラーゼ活
性測定方法の一例をより具体的に例示すると、あらかじ
め室温又は２０℃〜４０℃に加温、好ましくは３７℃に
加温した、修飾マルトオリゴ糖を基質として含み、前記
の一般式（Ｉ）よりなる構造の非イオン性界面活性剤を
含有するα−アミラーゼ活性測定試薬と、α−アミラー
ゼを含有すると推測される試料を混合して測定反応液と
し、温度一定の条件下において、試料添加後３０秒から
３０分の間、好ましくは３分から５分の間の４００ｎｍ
付近におけるこの測定反応液の吸光度変化を測定し、１
分間当たりの２−クロロ−４−ニトロフェノール又は４
−ニトロフェノール等の置換されたフェノール等の生成
量（遊離量）から試料中のα−アミラーゼ活性値を算出
する。

【００５４】また、基質を含まないα−アミラーゼ活性
測定試薬にα−アミラーゼを含有すると推測される試料
を混合し、その後この混合液に修飾マルトオリゴ糖を基
質として含むα−アミラーゼ活性測定試薬を添加して測
定反応液とし、前記の測定方法と同様の操作により測定
を行い、１分間当たりの置換されたフェノール等の生成
量（遊離量）から試料中のα−アミラーゼ活性値を算出
してもよい。

【００５５】なお、この場合、前記の一般式（Ｉ）より
なる構造の非イオン性界面活性剤は、基質を含まないα
−アミラーゼ活性測定試薬か、又は修飾マルトオリゴ糖
を基質として含むα−アミラーゼ活性測定試薬のいずれ
かに含有させるか、或いは、基質を含まないα−アミラ
ーゼ活性測定試薬と修飾マルトオリゴ糖を基質として含
むα−アミラーゼ活性測定試薬の両方に含有させてお
く。

【００５６】（３）反応時の他の成分本発明の試料中のα−アミラーゼ活性測定方法において
は、試料中のα−アミラーゼと前記基質の反応時に、緩
衝剤、共役酵素、α−アミラーゼなどの活性化剤、安定
化剤、防腐剤、又は他の界面活性剤等を存在させてもよ
い。

【００５７】（４）測定ステップ本発明の試料中のα−アミラーゼ活性測定方法は、１ス
テップ法（１試薬系）で実施してもよく、又は２ステッ
プ法（２試薬系）等の多ステップ法（多試薬系）で実施
してもよい。

【００５８】（５）測光方法本発明の試料中のα−アミラーゼ活性測定方法は、α−
アミラーゼの反応停止後に吸光度を測定するエンドポイ
ント法、又は単位時間当たりの吸光度変化を測定するレ
ート法のいずれにおいても実施することができる。

【００５９】（６）吸光度の測定波長本発明の試料中のα−アミラーゼ活性測定方法におい
て、遊離した置換されたフェノール等の吸光度の測定を
行う波長としては、遊離した２−クロロ−４−ニトロフ
ェノール又は４−ニトロフェノール等の置換されたフェ
ノール等が吸収を持つ波長の範囲内のものであればよ
く、前記の置換されたフェノールにおいては、３４０ｎ
ｍから４５０ｎｍであり、更に好ましくは３８０ｎｍか
ら４２０ｎｍの範囲である。

【００６０】また、遊離した置換されたフェノール等が
吸収を持たない波長を副波長として用い、二波長分析に
より吸光度の測定を行うこともできる。

【００６１】（７）本測定方法の応用なお、本発明のα−アミラーゼ活性測定方法によりα−
アミラーゼ活性を測定することによって、α−アミラー
ゼの活性化剤であるカルシウムイオン又は塩化物イオン
等の試料中での存在の有無の測定又は濃度の測定を行う
こともできる。

【００６２】

【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に詳
述するが、本発明はこの実施例によって何ら限定される
ものではない。

【００６３】〔実施例〕（本発明及び対照のα−アミラーゼ活性測定試薬による
試料中のα−アミラーゼ活性の測定）本発明及び対照の
α−アミラーゼ活性測定試薬にて、ヘモグロビンを含有
したヒト血清試料中のα−アミラーゼ活性を測定して、
ヘモグロビンによる影響を抑制する効果を確かめた。

【００６４】（１）α−アミラーゼ活性測定試薬の調製本発明・測定試薬の調製下記の測定試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように
純水に溶解し、ｐＨを６．２８（３７℃）に調整した。

【００６５】測定試薬成分濃度 2-クロロ-4-ニトロフェニル-α-D-マルトトリオシト゛（G3-CNP）〔オリエンタル酵母社製〕２．２５ｍＭ酢酸カルシウム５．０ｍＭ塩化ナトリウム３００ｍＭチオシアン酸カリウム９００ｍＭ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸・一水和物（MES）５０ｍＭＴＭＨ−７ＥＸ（非イオン性界面活性剤）〔日本サーファクタント工業社製〕０．２％

【００６６】対照１・測定試薬の調製非イオン性界面活性剤を、ＴＭＨ−７ＥＸ；濃度０．２
％から、トライトンＸ−４０５；濃度０．０５％に変え
ること以外は、前記の本発明・測定試薬と同じ試薬成
分及び濃度で調製を行った。

【００６７】対照２・測定試薬の調製非イオン性界面活性剤を、ＴＭＨ−７ＥＸ；濃度０．２
％から、トライトンＸ−４０５；濃度０．１％に変える
こと以外は、前記の本発明・測定試薬と同じ試薬成分
及び濃度で調製を行った。

【００６８】対照３・測定試薬の調製非イオン性界面活性剤を、ＴＭＨ−７ＥＸ；濃度０．２
％から、Ｔｗｅｅｎ２０；濃度０．０５％に変えること
以外は、前記の本発明・測定試薬と同じ試薬成分及び
濃度で調製を行った。

【００６９】対照４・測定試薬の調製非イオン性界面活性剤を、ＴＭＨ−７ＥＸ；濃度０．２
％から、ＢＴ−９；濃度０．０５％に変えること以外
は、前記の本発明・測定試薬と同じ試薬成分及び濃度
で調製を行った。

【００７０】対照５・測定試薬の調製非イオン性界面活性剤（ＴＭＨ−７ＥＸ；濃度０．２
％）を含有させないこと以外は、前記の本発明・測定
試薬と同じ試薬成分及び濃度で調製を行った。

【００７１】（２）ヒト血清試料中のα−アミラーゼ活
性の測定日立７１５０形自動分析装置（日立製作所社製）にてα
−アミラーゼ活性の測定を行った。

【００７２】試料には、ヒト血清をヘモグロビン濃度が
各々０ｍｇ／ｄＬ、５００ｍｇ／ｄＬになるように調製
した２種類のものを使用した。なお、これら２種類の試
料のα−アミラーゼ活性値は、いずれも８３．０ＩＵ
／Ｌ（国際単位／Ｌ）である。

【００７３】３７℃に加温した前記（１）の〜で調
製したそれぞれのα−アミラーゼ活性測定試薬３００μ
Ｌと、試料５μＬを各々混合し、３７℃で反応させ、主
波長４０５ｎｍ及び副波長５４６ｎｍにおける２分１２
秒目（１１ポイント）と、４分１２秒目（２１ポイン
ト）の経時的な吸光度増加度を測定し、１分間あたりの
吸光度変化量を求め、試料中のα−アミラーゼ活性値を
求めた。

【００７４】なお、試料中のα−アミラーゼ活性値〔Ｉ
Ｕ／Ｌ〕は、１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡ／ｍｉ
ｎ）から次式により算出した。

【００７５】α−アミラーゼ活性値（IU／L）＝｛ΔＡ
／min ×（Ｓ＋Ｖ）×１０⁶｝÷（ε×Ｓ×ｄ）＝ΔＡ
／min ×３８８５

【００７６】なお、前記式中、Ｓは試料の容量（５μ
Ｌ）を、Ｖはα−アミラーゼ活性測定試薬の容量（３０
０μＬ）を、εは置換されたフェノール等のモル吸光係
数（２−クロロ−４−ニトロフェノール：１５．７×１
０³ ）を、ｄは吸収セルの光路長（１ｃｍ）を表す。

【００７７】この測定結果を表１に示した。

【００７８】

【表１】

【００７９】この表より、試料中にヘモグロビンが５０
０ｍｇ／ｄＬ存在することによりα−アミラーゼ活性測
定値に生じる誤差が、本発明・測定試薬では、−２．５
％にとどまっているのに対して、非イオン性界面活性剤
を含有しない対照５・測定試薬では、−７．６％も生じ
ていることが分かる。

【００８０】また、他の種類の非イオン性界面活性剤を
含有する対照１・測定試薬、対照２・測定試薬、対照３
・測定試薬、及び対照４・測定試薬においては、誤差が
−１５．３％〜−１９．１％にも達しており、非イオン
性界面活性剤を含有しない対照５・測定試薬より逆に誤
差が増幅されてしまっていることが分かる。

【００８１】このことにより、前記の一般式（Ｉ）より
なる構造の非イオン性界面活性剤を含有する本発明の測
定試薬による試料中のα−アミラーゼ活性の測定では、
試料中に存在するヘモグロビンによりα−アミラーゼ活
性測定値に負誤差が生じることを抑制することができ、
正確なα−アミラーゼ活性値が得られることが確かめら
れた。

【００８２】

【発明の効果】本発明の、前記の一般式（Ｉ）よりなる
構造の非イオン性界面活性剤を含有する（存在させる）
試料中のα−アミラーゼ活性測定試薬及びα−アミラー
ゼ活性測定方法は、試料中にヘモグロビンが存在したと
しても、その試料のα−アミラーゼ活性測定値に、ヘモ
グロビンの存在に由来する負誤差が生じるのを抑制する
ことができ、正確なα−アミラーゼ活性値を得ることが
できるという効果を有するものである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】修飾マルトオリゴ糖を基質として含む、
試料中のα−アミラーゼ活性測定試薬において、下記一
般式（Ｉ）【化１】よりなる構造の非イオン性界面活性剤を含有することを
特徴とする、試料中のα−アミラーゼ活性測定試薬。
【請求項２】一般式（Ｉ）よりなる構造の非イオン性
界面活性剤が、下記一般式（ＩＩ）【化２】よりなる構造の非イオン性界面活性剤である、請求項１
記載の試料中のα−アミラーゼ活性測定試薬。
【請求項３】修飾マルトオリゴ糖が、２−クロロ−４
−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシドである、
請求項１又は請求項２記載の試料中のα−アミラーゼ活
性測定試薬。
【請求項４】修飾マルトオリゴ糖を基質とする、試料
中のα−アミラーゼ活性測定方法において、試料中のα
−アミラーゼと前記基質の反応時に、下記一般式（Ｉ）【化３】よりなる構造の非イオン性界面活性剤を存在させること
を特徴とする、試料中のα−アミラーゼ活性測定方法。
【請求項５】一般式（Ｉ）よりなる構造の非イオン性
界面活性剤が、下記一般式（ＩＩ）【化４】よりなる構造の非イオン性界面活性剤である、請求項４
記載の試料中のα−アミラーゼ活性測定方法。
【請求項６】修飾マルトオリゴ糖が、２−クロロ−４
−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシドである、
請求項４又は請求項５記載の試料中のα−アミラーゼ活
性測定方法。