JP2871034B2 - 塩素イオン測定用組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、塩素イオンの測定用組成物に関するもので
ある。体液中の塩素イオンの測定は、生体内の各種電解
質の異常輸送、吸収および排出に関して有用な情報を与
え、臨床的意義が高い。

（従来の技術） 従来、体液中の塩素イオンの測定には、クロライドメ
ーターによる電量滴定法、イオン選択電極を用いた電極
法など、塩素イオン濃度を電気的信号として測定する方
法及びチオシアン酸水銀と硝酸鉄を用いた比色定量法が
一般に用いられていた。ところが、前者の電量滴定法、
電極法は専用の装置が必要であり機器の保持、管理に注
意が必要であり、試料の分析処理効率が悪いなどの問題
点があった。また後者の比色定量法は測定後、シアン・
水銀を含む廃液を生じるため、特別な処理が必要である
といった欠点を持っていた。その他、最近、非活性型の
α−アミラーゼ、カルシウム錯体、およびα−アミラー
ゼ測定用試薬からなる、酵素法を用いた塩素イオンの測
定方法（特開昭63−126497）が利用されるようになって
きた。

しかし、この方法では、カルシウム錯体を添加するこ
とや、一般的にα−アミラーゼ測定用試薬中に含まれ
る、α−グルコシダーゼ、β−フルコシダーゼ等の追随
酵素の影響でマルトオリゴ糖誘導体が分解されることに
より、試薬ブランク上昇が著しく大きく、測定値の精度
が悪い、といった問題点があった。また、測定域が狭
く、正常値以上の高濃度域では正しい測定値を与えない
といった問題点も有していた。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の課題を解決するものであり、その
目的とするところは、特殊な機器の保持・管理の必要が
なく、分析効率が良く、特別な廃液処理が不要であり、
試薬ブランクの上昇を抑制することができ、測定精度に
優れ、かつ良好な直線性を持ち高値検体に対しても正確
な測定値を与える簡便な塩素イオン測定用試薬を提供す
ることである。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記目的を達成するために種々鋭意検
討したところ、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、修飾または非修飾の非還元性末
端および修飾基がα型で結合した還元性末端を有するマ
ルトオリゴ糖誘導体、金属キレート剤およびα−アミラ
ーゼを含有し、追随酵素を含有しないことを特徴とする
塩素イオン測定用組成物である。本発明の組成物は、α
−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコアミラ
ーゼ等の追随酵素を含有しない。

本発明に用いるマルトオリゴ糖誘導体とは、下記一般
式（Ｉ）で表わされる修飾した非還元性末端および修飾
基がα型で結合した還元性末端を有するマルトオリゴ糖
誘導体および下記一般式（II）で表わされる非修飾の非
還元性末端および修飾基がα型で結合した還元性末端を
有するマルトオリゴ糖誘導体である。

一般式（Ｉ） （式中、R¹およびR²の少なくとも一方は炭素原子数１
〜６個のアルキル基、置換アルキル基、フェニル基、又
は置換フェニル基を示し、残された基は水素原子を示す
か、あるいはR¹とR²は一緒になってメチレン架橋基を形
成してもよく、この架橋基の水素原子は炭素原子数１〜
５個を有するアルキル基、置換アルキル基、フェニル
基、又は置換フェニル基によって置換されていてもよ
い。R³はフェニル基又は置換フェニル基を示す。ｎは１
〜８の整数を示す。） 一般式（II） （式中、R³はフェニル基又は未置換のフェニル基を示
す。ｎは１〜８の整数を示す。） 本発明に用いるマトリオリゴ糖誘導体のマルトオリゴ
糖としては、マルトトリオース、マルトテトラオース、
マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプ
タオース、マルトオクタオース、マルトノナオース、マ
ルトデカオース等がある。特にマルトトリオース、マル
トテトラオースが好適である。

上記マルトオリゴ糖の非還元性末端グルコースの４−
位および／または６−位の水酸基を修飾する修飾基とし
ては、メチル、エチル、プロピルなどの炭素原子数１〜
６個のアルキル基、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチ
ル、スルホメチル、カルボキシメチル、スルホエチル、
カルボキシエチル、２−ケトプロピル、２−ケトブチ
ル、２−ケトペンチル、３−ケトペンチル、４−ケトペ
ンチル、ベンジルなどの置換アルキル基、フェニル基、
４−メチルフェニル、４−ヒドロキシフェニル、４−カ
ルボキシフェニル、４−スルホフェニルなどの置換フェ
ニル基、２−ケトプロピリデン、２−ケトブチリデン、
３−ケトブチリデン、２−ケトペンチリデン、３−ケト
ペンチリデン、４−ケトペンチリデン、ベンジリデン、
メチリデン、エチリデン、イソプロピリデン、シクロヘ
キシリデン、メチルスルフィニルエチリデン、エチルス
ルフィニルエチリデン、メタンスルホニルエチリデン、
エタンスルホニルエチリデン等のメチレン架橋基があ
る。

特に非還元性末端グルコースの４−位および６−位の
水酸基がメチレン架橋基によって結合していることが好
ましく、さらに該メチレン架橋基の水素原子がカルボニ
ル基、スルフィニル基、スルホニル基等の極性基を有す
るアルキル基で置換されていることが好ましい。

上記マルトオリゴ糖の還元性末端グルコースの１−位
の水酸基を修飾する修飾基としては、フェニル基および
置換フェニル基があり、置換フェニル基はハロゲン、ニ
トロ、ヒドロキシなどの置換基を有する。このような置
換フェニル基としては、４−ニトロフェニル、２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル、2,6−ジクロロ−４−ニトロ
フェニル、２−フルオロ−４−ニトロフェニル、2,6−
ジフルオロ−４−ニトロフェニル、２−ブロモ−４−ニ
トロフェニル、2,6−ジブロモ−４−ニトロフェニル、
２−ニトロフェニル、２−ヒドロキシ−４−ニトロフェ
ニル、３−ヒドロキシ−４−ニトロフェニル基等が用い
られる。特にニトロ基および／またはハロゲン原子を有
するフェニル基が好ましい。これらの基は還元性末端グ
ルコースの１−位の水酸基にα型で結合していなくては
ならない。

本発明の用いるマルトオリゴ糖誘導体としては、例え
ば３−ケトブチリデン−２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル−α−Ｄ−マルトトリオサイド、エチリデン−４−ニ
トロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオサイド、ベンジリ
デン−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオサイ
ド、ベンジル−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトト
リオサイド、２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ
−マルトトリオサイド、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−
マルトトリオサイド等が挙げられる。

本発明に使用される金属キレート剤としては、エチレ
ンジアミン四酢酸、エチレンジアミン−N,N,N′,N′−
四酢酸、トランス−1,2−ジクロヘキサンジアミン−N,
N,N′,N′−四酢酸、ジヒドロキシエチルグリシン、ジ
アミノプロパノール四酢酸、ジエチレントリアミン五酢
酸、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミン二プロ
ピオン酸塩酸塩、ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸、
エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）、
グリコールエーテルジアミ四酢酸、ヘキサメチレンジア
ミン−N,N,N′,N′，−四酢酸、ヒドロキシエチルイミ
ノ二酢酸、イミノ二酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、ニ
トリロ三酢酸、ニトリロ三プロピオン酸、ニトリロトリ
ス（メチレンホスホン酸）、トリエチレンテトラミン六
酢酸、1,2−ビス（オルト−アミノフェノキシ）エタン
−N,N,N′−Ｎ′−四酢酸およびこれらの１価の金属塩
類等がある。これらは単独または複数の組合せで用いる
ことができる。

本発明に用いるα−アミラーゼとしては、人膵由来、
人唾液由来、豚由来、牛由来、微生物由来等がある。

修飾された非還元性末端をもつマルトオリゴ糖誘導体
を用いる場合には、ヒト、その他動物および微生物由来
の全てのα−アミラ−ゼが適用可能である。非修飾の非
還元性末端をもつマルトオリゴ糖誘導体を用いる場合に
は、ブタ膵臓由来のα−アミラーゼが好ましい。

本発明の塩素イオン測定用組成物にはリン酸緩衝液、
クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液またはグッド緩衝液等あ
らゆる緩衝液が使用できる。しかし塩酸、塩化ナトリウ
ム等の塩化物を含むものは適しない。緩衝液のpHは６〜
８付近が好ましい。

本発明の塩素イオン測定用組成物には、マルトオリゴ
糖誘導体0.1〜20mM、キレート剤0.01〜200mM、α−アミ
ラーゼ0.05〜50u/ml含有される。

本発明の塩素イオン測定用組成物は必要に応じて界面
活性剤、防腐剤、安定化剤等を含有するものである。

試料中の塩素イオンを測定するには、マルトオリゴ糖
誘導体、金属キレート剤、およびα−アミラーゼを含有
する試薬を試料に添加して、生成するフェノール又は置
換フェノールを光学的に測定する。また試薬を二つ以上
に分けて、適宜組み合わせてもよい。例えば金属キレー
ト剤、α−アミラーゼを含む第一試液と金属キレート剤
とマルトオリゴ糖誘導体を含む第２試液とし、試料に第
一試液を加えた後、第二試液を加えて反応させ、生成す
るフェノール又は置換フェノールを光学的に測定する。

本発明の塩素イオン測定用組成物は分析効率がよく、
特別な廃液処理が不要であり、試薬ブランクの上昇を抑
制することができ、測定精度に優れ、かつ良好な直線性
をもち、高濃度域まで正確かつ簡便に測定できる。ま
た、酵素としてα−アミラーゼのみ含有するので、試薬
が非常に安価である。本発明による上記試薬は、自動分
析機を用いての連続測定にも適用可能である。

（実施例） 以下、本発明を実施例により説明する。

実施例１ 下記試薬を用いて下記方法により試薬ブランク上昇、
血清３種の塩素イオン濃度を測定した。

1.試薬 酵素試液（R1とする） 0.15M リン酸緩衝液（pH7.0） 100mM EDTA 21.5U/ml α−アミラーゼ （ブタ膵臓由来） マルトオリゴ糖誘導体試液（R2とする） 0.15M リン酸緩衝液（pH7.0） 100mM EDTA 3.5mM マルトオリゴ糖誘導体 （第１表に記載） 2.測定方法 被検液25μｌに上記R1試液2mlを加えて37℃で５分間
放置した後、R2試液500μｌを加え、37℃で反応させ、
その吸光度を波長400nmで測定して、１分間当りの吸光
度変化量を求めた。血清は、140mM KClを標準液として
濃度を算出した。結果を第２表に示す。

この結果から明らかなように、G3−α−PNPおよびG4
−α−PNPのいずれを用いても、試薬ブランク上昇が小
さく良好な測定値を得た。

比較例１ 下記２種類の試薬を用いて下記方法により試薬ブラン
ク上昇、血清３種の塩素イオン濃度を測定した。

1.試薬Ａ 酵素試薬（R1とする） 0.15M リン酸緩衝液（pH7.0） 100mM EDTA 1mM Ca−EDTA 21.5U/ml α−アミラーゼ （ブタ膵臓由来） マルトオリゴ糖誘導体試液（R2とする） 0.15M リン酸緩衝液（pH7.0） 100mM EDTA 1mM Ca−EDTA 3.5mM G3−α−PNP 試薬Ｂ 酵素試液（R1とする） 0.15M リン酸緩衝液（pH7.0） 100mM EDTA 1mM Ca−EDTA 21.5U/ml α−アミラーゼ（ブタ膵臓由来） 5U/ml β−グルコシダーゼ 150U/ml α−グルコシダーゼ マルトオリゴ糖誘導体試液（R2とする） 0.15M リン酸緩衝液（pH7.0） 100mM EDTA 1mM Ca−EDTA 3.5mM ４−ニトロフェニル−β−Ｄ −マルトトリオサイド （G3−β−PNP） 2.測定方法 被検液25μｌにR1試液2mlを加えて37℃で５分間放置
した後、R2試液500μｌを加え、37℃で反応させ、その
吸光度を波長400nmで測定して、１分間当りの吸光度変
化量を求めた。血清は、140mM KClを標準液として濃度
を算出した。それぞれ試薬A,B両方についておこないそ
の結果を第３表に示す。

試薬中にカルシウムを添加するとブランク上昇が非常
に大きくなることが明らかである。また追随酵素を含有
すると一層試薬ブランク上昇が大きくなることも明らか
である。

（発明の効果） 本発明によれば、修飾または非修飾の非還元性末端お
よび修飾基がα型で結合した還元性末端を有するマルゴ
オリゴ糖誘導体を用い、追随酵素を用いないことで、試
薬ブランク上昇を抑え精度良く、高濃度まで、簡便に塩
素イオンの測定を行うことができる。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12Q 1/40 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】修飾または非修飾の非還元性末端および修
   飾基がα型で結合した還元性末端を有するマルトオリゴ
   糖誘導体、金属キレート剤およびα−アミラーゼを含有
   し、追随酵素を含有しないことを特徴とする塩素イオン
   測定用組成物。